4120

Рисунок 2. Форма зависимости qР для уравнений (9) и (10).

На рис. 2 показаны графики функций (9) и (10), эти уравнения дают выпуклую (9) и вогнутую (10) кривые, выходящие из нуля, но эти функции могут иметь также дополнительный свободный член qP0:

(11),

(12).

Тогда графики функций (11) и (12) в отличии от (9) и (10) выходят не из нуля, а из некоторой точки qP0 на оси y, что продемонстрировано на рисунке

3.

I II

Рис. 3. Форма зависимости qР для уравнений I: (11) и (12); II: для уравнений

(13) и (14).

Возможны также эмпирические уравнения типа: (13),

(14).

Где а, b, с – эмпирические константы.

По аналогии с уравнениями (11) и (12) уравнение (14) начинается, не из 0 по оси ординат, а из некоторой точки a, что означает начало синтеза продукта без роста биомассы.

Субстрат-зависимые модели кинетики биосинтеза продуктов метаболизма.

Для процессов, связанных только с ростом, возможно скорость биосинтеза при этом будет одинакова. Для несвязанных с ростом процессов небезразлично, каким путем мы будем изменять величину . Лимитирование углеродом, лимитирование азотом, повышение рН или снижение температуры, давая одно и то же значение скорости роста, могут давать совершенно различные скорости биосинтеза продукта метаболизма. Другими словами, связь между qP и не имеет строго причинно-следственного характера, а обусловлена влиянием на обе эти кинетические характеристики одних и тех же факторов внешней среды. Для таких процессов необходимо использовать уравнения, которые в качестве аргументов содержат независимо влияющие первичные факторы: концентрация того или иного субстрата, температура или величина рН.

Биосинтез продукта может описываться однофакторными или многофакторными уравнениями. Кроме того, было установлено, что структуры зависимостей qP от S, P, температуры и величины рН аналогичны структурам таких же уравнений для роста биомассы, например: Моно, Андрюса, Перта, Хиншельвуда и т.д. Например, если субстрат влияет на qP по Андрюсу, то имеем:

(15),

где qm – максимальная удельная скорость биосинтеза продукта; K’S – константа насыщения;

Ki – константа ингибирования продуктом.

Многофакторные зависимости здесь чаще бывают мультипликативными,

чем аддитивными. Приведем зависимость мультипликативного	и
аддитивного влияния концентрации субстрата по механизму Моно:
(16),
(17).

Применяются также уравнения с не разделяющимися эффектами факторов, например, типа Контуа или неконкурентного торможения продуктом:

(18),

(19).

Для биосинтеза продуктов метаболизма часто бывает недостаточно только благоприятных ―внешних‖ факторов среды. Потому что в биосинтезе участвуют внутриклеточные ферменты микроорганизмов, промежуточные продукты, содержание которых в клетке зависит от предыстории развития культуры. Слишком быстро выросшая культура часто неэффективна с точки зрения биосинтеза продукта. У микробиологов есть выражение ―культура ушла в ботву‖, что означает биомассы – много, продукта – мало или вообще нет. Однако, учитывать эти внутриклеточные компоненты при моделировании очень проблемно – их трудно измерять и соответственно находить кинетические коэффициенты.

Вместо этого предложены некоторые феноменологические подходы к оценке физиологического состояния микробной биомассы, основанные на оценке возрастного состояния популяции клеток.

Есть несколько подходов для учета возраста культуры. Один из них заключается в определении распределения клеток микроорганизмов по возрастам. Тогда значение удельной скорости биосинтеза продукта можно считать как бы суммой скоростей, даваемых разными возрастными фракциями биомассы:

(20),

где Xi – концентрация биомассы i-ой возрастной группы;

qi – удельная скорость биосинтеза биомассой i-ой возрастной группы.

При этом, вполне возможно, что значения q1, q2, … ,qn не будут одинаковыми: ―молодежь‖ не синтезирует нужный продукт, слишком старые клетки – тоже.

Японским ученым Аибой был предложен более простой подход, использовать для оценки возраста культуры так называемый средний возраст популяции как параметр, определяющий биосинтетическую активность культуры. Биологически термин вполне понятен – это сумма возрастов всех клеток, деленная на их количество:

(21),

где λi – возраст i-ой возрастной группы.

Если последовательно уменьшать поддиапазоны t и Χ, доведя их до бесконечно малых dX и dt, то для среднего возраста можно получить интегральную формулу:

(22),

где Х0 – начальная концентрация биомассы;

– средний возраст культуры в начальный момент культивирования. Другим способом упрощения возрастной зависимости является разделение возрастного диапазона клеток на 2 класса – продуктивный (выше некоторого значения) и не продуктивный:

(24),

где λ* – возраст зрелости;

qP* – удельная скорость биосинтеза клетки, по достижении ею возраста зрелости.

Теперь остается рассмотреть форму зависимости удельной скорости биосинтеза продукта qР от среднего возраста культуры: .

Если зависимость имеет возрастающий характер с насыщением, то зависимость удобно выразить в форме, похожей на уравнение Моно:

(25).

Если, наоборот, она падает с возрастом, то лучше подходит выражение, подобное уравнению Иерусалимского:

(26).

Если зависимость имеет экстремум, то оно может быть выражена, например, с помощью аппроксимирующего полиномиального уравнения:

(27).

Однозначная зависимость между qР и на практике встречается редко, часто зависимость скорости биосинтеза продукта от возраста учитывают в виде мультипликативного сомножителя, сопряженного с основной частью уравнения, учитывающего влияния остальных факторов.

Не всегда синтезированные продукты метаболизма остаются устойчивыми; часто они настолько нестабильны, что разрушаются уже в процессе самой ферментации. Поэтому, описывая материальный баланс по продукту метаболизма, необходимо учитывать кинетику его инактивации:

(28),

где – скорость деградации продукта метаболизма.

При рассмотрении синтеза метаболитов, использовалась удельная скорость, в случае деградации, вводить удельную скорость не корректно, т.к. продукт существует отдельно от биомассы, и его деградация не зависит в общем случае от ее концентрации.

Рассмотрим модели кинетики деградации:

(29),

деградация отсутствует.

(30),

деградация идет с постоянной скоростью. Такое выражение странно выглядит в начале процесса, когда продукта еще нет; из уравнения же получается, что концентрация продукта снижается ниже нуля, что не имеет физического смысла.

(31),

реакция разложения первого порядка, пропорционально количеству образовавшегося продукта.

(32),

реакция разложения n-ого порядка, при чем n может быть как больше 1, так и меньше и не быть целым числом.

(33),

реакция разложения зависит не только от концентрации продукта, но и от концентрации биомассы.

(34),

скорость реакции разложения зависит от концентрации биомассы и возрастает с концентрацией продукта до какого-то предела.

Приведенные уравнения инактивации (29)-(34) наиболее распространенные, существуют также и другие более сложные зависимости.

Задача 1.

Ферментативная реакция в реакторе периодического действия. Фермент с Кm=1,0∙10-3 М инкубировали с субстратом при начальной концентрации s0=3,0∙10-5 М. Через 2 минуты прореагировало 5,0 % субстрата. Какое количество субстрата будет трансформировано в течение 5, 10, 20, 30,60 минут?

Задача 2.

Определение vmax и Km

В таблице2 приведены начальные скорости реакции, катализируемой ферментом, при различных концентрациях субстрата.

Таблица 2 Экспериментальные данные

s,моль/л	v,	s,моль/л	v,
	моль/(л∙мин)∙106		моль/(л∙мин)∙106
4,1∙10-3	177	4,9∙10-5	80
9,5∙10-4	173	1,06∙10-5	67
5,2∙10-4	125	5,1∙10-6	43
1,3∙10-4	106

а) Определить vmax и Km методом Лайнуивера–Бэрка. Б) Определить vmax и Km методом Эди–Хофсти.

В) Сравнить точность методов для определения vmax и Km.

Вопросы для самоконтроля

1. Какие требования предъявляются к выбору биореакторов?

2. Какие параметры необходимо контролировать при работе биореакторов?

4. Какие основные технологические параметры необходимо контролировать в процессе ферментации?

4.Каковы правила выбора объема ферментатора?

Лабораторная работа № 4 Исследование процесса периодической ферментации Исследование процесса непрерывной ферментации.

Технологические расчеты

Цель: изучить процессы периодической и непрерывной ферментации Задание: рассчитать основные технологические показатели процесса ферментации (табл.3).

Таблица 3 Исходные данные для расчета основных технологических параметров процесса ферментации

№	Объем	Объем	Время цикла	Концентраци	Концентр	Скоро
вариант	ферментатора	ферментатора	работы	я биомассы,	ацичя	сть
а	геометрически	рабочий, м3 Vf	ферментатора,	г/л (Х)	продукта	слива
	й, м3		ч (t)		в	ульту
					культура	ральн
					льной	ой
					жидкости	жидко
					, г/л (С)	сти,
						м3/ч
						Wcf
1	10	8	24-30	3,5-4,0	1,4	0,15
2	16	11,2	20-40	10,1	11.5	0,16
3	20	16	30-36	9,6	22	0,2
4	32	26	36-42	8,5	32	0,25
5	50	20	46-48	15	44	0,3
6	63	50,4	44-48	20	49	0,4
7	100	70	48-52	16,6	57	0,5
8	160	128	36-48	20	65	0,1
9	200	160	36-72	50	5,0	0,35
10	800	320	7-8	35	2,0	0,6

Процесс ферментации можно оценивать по различным показателям, используя расчетные формулы.

1.Продуктивность по биомассе Qх , г/л ч; а) для периодического процесса

X1 – X0 Qх = t1 – t0

б) для непрерывного процесса

Qх = D Χ1 ,

где Χ 0 – концентрация биомассы, г/л на период времени, t0 ч; Χ1 – концентрация биомассы (г/л) на период времени, t1 ч;

D – коэффициент разбавления или скорости потока, 1/ч, равный удельной скорости ( μ ) для непрерывного процесса.

2. Удельная скорость роста, μ , л/ч,

Χ1 – Χ0

μ= Χ1 (t1 −–t0 )

3. Концентрация биомассы

11.

Υp / s =

8.Χ1 = Χ0 e μ ( t1 –t0 ) .

Для Log – фазы размножения e = 2,718.

4.Продуктивность по целевому продукту, Q p , г/л ч: а) для периодического процесса

P1 – P0 Qр = t1 – t0

б) для непрерывного процесса

Qр = D P,

где P – концентрация продукта, г/л ч.

5. Удельная скорость образования целевого продукта, qр , г/г ч,

9.	qp= P1 – P0
Χ1 (t1 −–t 0 )

6. Удельная скорость потребления субстрата, qs , г/г ч,

qs= S0 – S1 Χ1 (t1 – t0 )

где S – концентрация субстрата, г/л.

7. Выход биомассы из субстрата или экономический коэффициент, Υх / s , г/г

10. Μ Χ1 – Χ0

Υх / s =

qs= S0 – S1

8. Выход целевого продукта, Υp / s , г/г,

qp= P1 – P0

.

qs = S0 – S1

Общая продуктивность ( Pср) в биореакторе определяется количеством целевого продукта в ЕD активности или в кг получаемого продукта с 1 м3 ферментационной емкости в час.

Периодический процесс	Непрерывный процесс
Pср = Vcf Α cf 106, ED/м3 ч;	Pср = Wcf Α cf 106 , ED/м3 ч;
Pap = Vcf C, кг/м3 ч,	Pap = Wcf C , кг/м3 ч,

где Vcf – объем культуральной жидкости за весь процесс ферментации, м3; Α cf – активность культуральной жидкости, ED/м3 ,

C – концентрация целевого продукта в культуральной жидкости, кг/м3 ; Wcf – скорость слива культуральной жидкости из ферментатора, м /ч; Vf – вместимость ферментатора, м ;

Tc – время цикла работы ферментатора, ч.

Общую продуктивность для непрерывных процессов определяют в

установившемся режиме, а для периодических процессов и полунепрерывных – с учетом времени на подготовку ферментатора к работе.

Объемная продуктивность процесса ( Pср ) – это количество целевого продукта в ED активности или в кг, получаемого с 1 м3 питательной среды в час.

Периодический процесс	Непрерывный процесс
Pср = Vcf Α cf 106, ED/м3 ч	Pср = Wcf Α cf 106 , ED/м3 ч
Pср = Vcf C ,кг/м3ч	Pср =Wcf C,кг/м3ч
где Vnm – объем питательной среды, м3.

Выход продукта от субстрата ( Ls ) – это количество целевого продукта в ED активности или кг, полученное из 1 кг компонента ферментационной среды, являющегося энергоносителем.

Периодический процесс		Непрерывный процесс
Ls =	Vcf Α cf 106 , ED/кг;	Ls = Α cf 106, ED/кг;
		или
Ls =	Vcf C , кг/кг;	Ls = C cf, кг/кг;

где ms – исходное содержание энергоносителя в субстрате, кг, S0 – исходная концентрация энергоносителя в субстрате, кг/м3 .

Степень использования субстрата ( U )

U= S0 – Sk ,

где S0 -–исходная концентрация энергоносителя в субстрате;

Sk -–конечная концентрация энергоемкого компонента в субстрате.

Вопросы для самоконтроля

1.Назовите условия проведения периодического процесса ферментации.

2.Назовите условия проведения непрерывного процесса ферментации.

3.По каким критериям оценивается эффективность ферментации?

Лабораторная работа № 5 Исследование ферментативного гидролиза крахмала

Цель: изучить свойства ферментов, гидролизующих крахмал.

Задание: провести ферментативный гидролиз картофельного крахмала ферментами солода, оценить эффективность гидролиза по количеству накопленной мальтозы в заторе.

Ферментативный гидролиз крахмала и гликогена осуществляется с помощью ферментов класса гидролаз, подкласса карбогидраз, называемых амилазами: a-амилазы, b-амилазы и глюкоамилазы. Различаются они по свойствам, распространению в природе и способу действия на крахмал. Наиболее активные амилазы содержатся в слюне и соке поджелудочной железы животных и человека, в плесневых грибах, проросшем зерне. Обычно препараты амилазы получают из высушенного проросшего зерна (солод).

Амилазы гидролизуют как неизмененные крахмальные зерна, так и крахмальный клейстер. Атакуемость крахмала амилазами увеличивается с уменьшением размеров крахмальных зерен, т.е. с увеличением их относительной поверхности. Она резко возрастает при механическом нарушении стуктуры крахмальных зерен. Действие амилаз усиливается на клейстеризованный крахмал. Поэтому в целом ряде отраслей пищевой промышленности, например, спиртовой, осахаривание крахмала солодом производится лишь после заваривания муки или измельченного картофеля. a-амилаза – фермент, гидролизующий a-(1®4)-гликозидные связи внутри молекулы амилозы или амилопектина без определенного порядка. В результате образуются продукты неполного гидролиза крахмала – a- декстрины – полисахариды разной молекулярной массы.

Всоотвествии со свойствами различают следующие виды декстринов:

1.амилодекстрины – окрашиваются раствором йода в фиолетово-синий цвет;

2.эритродекстрины, окрашиваются йодом в красно-бурый цвет;

3.ахродекстрины – окрашиваются йодом в слабо-желтый цвет;

4.мальтодекстрины – не дают окрашивания с йодом.

a-амилазу называют декстринирующим ферментом. Она не расщепляет a- (1®6) гликозидные связи. При действием a-амилазы на амилозу можно получить при полном гидролизе около 85% мальтозы и 15% глюкозы, при действии на амилопектин – около 70% мальтозы, 10% изомальтозы (молекулы глюкозы связаны a-(1®6) гликозидной связью) и 20% глюкозы. b-амилаза –фермент, который катализирует гидролиз крахмала и гликогена по a(1®4) гликозидной связи с нередуцирующих концов молекул. Она не расщепляет a(1®6) связи. В отличие от a-амилазы, b-амилаза действует упорядоченно и, начиная с нередуцирующего конца, отщепляет по молекуле мальтозы.

Амилозу b-амилаза расщепляет нацело, превращая ее на 100% в мальтозу. Если субстратом для действия b-амилазы служит амилопектин, то она расщепляет его на мальтозу и продукт неполного гидролиза, получивший название b-амилодекстрин. Предельный декстрин гидролизуется b-амилазой только в том случае, если в реакционную смесь добавить a-амилазу. При совместном действии a- и b-амилаз на крахмал около 95% его превращается в мальтозу.

a- и b-амилазы различаются по своему отношению к реакции среды: a- амилаза гораздо более чувствительна к подкислению. Отличаются эти ферменты также по термостабильности и температурному оптимуму: a- амилаза более устойчива к действию повышенных температур, ее температурный оптимум (~70°С) лежит несколько выше, чем оптимум b-

амилазы (50~60°С).

Приготовление крахмального затора

50 г картофельного крахмала смешивают со 100 см3 холодной водопроводной воды. Полученную суспензию при тщательном перемешивании тонкой струйкой приливают к 900 см3 кипящей водопроводной воды. Полученный таким образом густой прозрачный крахмальный затор охлаждают до 40 С и используют для осахаривания.

Приготовление солодовой вытяжки

Для приготовления солодовой вытяжки 20 г тонкоизмельченного ячменного солода смешивают со 100 см3 водопроводной воды. Полученную смесь настаивают в течение 1 часа при температуре 35–40 С.

Гидролиз крахмального затора

Для осуществления гидролиза крахмального затора к объему клейстера приливают 50 см3 ферментной вытяжки. Гидролиз крахмала

осуществляют при 40С при периодическом перемешивании (для интенсификации процесса). Осахаривание обычно продолжается 1,5–2часа. Во время осахаривания проводят контроль гидролиза по йодной пробе и каждые 15 минут определяют количество мальтозы в заторе. Если при повторном определении количество затрачиваемого титранта остается прежним и имеется отрицательная йодная проба на крахмал, осахаривание считают законченным. По результатам определения мальтозы в заторе строится график накопления биозы в зависимости от продолжительности гидролиза.

Определение мальтозы

Метод разработан Вильштеттером и Шудлем. В основу метода положена реакция окисления альдегидной группы сахаров в соответствующую одноосновную кислоту. Например, глюкоза окисляется в глюконовую кислоту по уравнению:

СН2ОН(СНОН)4СОН + J2+2NaОН ==СН2ОН(СНОН)4СОН +2NaJ + Н2О.