УП- Биоорганическая химия

Рис. 2.22. ДНК/РНК синтезатор ASM-800 (передняя панель снята): 1) шприцнасосы с дискретностью 1 мкл и расходом 12,5-100 мкл/сек для подачи растворов на колонки; 2) блок с 8-ю колоночными реакторами, каждый с внутренним объемом 25 мкл (показано на врезке); 3) емкости с растворами мономеров. В больших флаконах – растворители и реагенты для проведения синтеза.

Рис. 2.23. Хроматографическая очистка синтезированного олигонуклеотида. Пики: № 1 – целевой продукт, № 2 – укороченные олигонуклеотиды, образующиеся в результате кэпирования. Соединения с ранним временем выхода (до 15 минут) – ненуклеотидной природы. mAU – единицы оптической плотности..

На рисунке 2.23 приведена хроматограмма реакционной смеси после синтеза 22-членного олигонуклеотида на этом синтезаторе. Основной пик целевого олигонуклеотида составляет примерно 80% от суммарной оптической плотности. Второй, существенно меньший пик, принадлежит олигонуклеотидам, которые получаются после реакции кэпирования – это укороченные последовательности, получающиеся в результате не

101

100%-го выхода реакции конденсации. Материал любезно предоставлен к.х.н. В.А. Рябининым (ИХБиФМ СО РАН, г. Новосибирск)

2.9. Синтетические олигонуклеотиды с особыми свойствами Аптамеры – синтетические олигонуклеотиды рибоили дезоксирибо-ряда

сравнительно небольшой длины (до 100 н.о.), обладающие специфической пространственной структурой (aptus – подходящий, лат.). Было показано, что эта структура образуется благодаря образованию локальных спаренных участков цепи

(дуплексов) за счет комплементарности оснований и стабилизируется стэкинг взаимодействиями оснований и другими силами. Оказалось, что уникальная пространственная структура этих молекул обеспечивает их специфическое сродство

(аффинность) с другими соединениями – белками, гормонами, ионами металлов и т.д.

Применение аптамеров как биоспецифических молекул на заданную мишень открыло возможность создания высокочувствительного анализа для нужд биологии и медицины.

По сравнению с другими широко используемыми биоспецифическими молекулами – иммуноглобулинами, аптамеры имеют ряд очевидных преимуществ: обладая такой же аффинностью, они стабильны, для их получения не нужны экспериментальные животные и клеточные технологии, поскольку их легко синтезировать в любых необходимых количествах, мишени могут быть самыми разнообразными по природе, в том числе и токсичными – от ионов металлов до клеток и вирусов. Для получения аптамеров с нужной специфичностью используют химически синтезированное множество олигонуклеотов одинаковой длины, но разной последовательности, так называемую рэндом ДНК библиотеку (random – случайный, бессистемный, англ.). Хорошая библиотека содержит до

1020 различных последовательностей. Ее получают с помощью рэндом синтеза, когда в реактор на каждом этапе вносят все четыре синтона. Из этого множества олигонуклеотидов отбирают аффинные к целевой мишени, используя известную технологию отбора (SELEX) или другие. Далее секвенированием определяют последовательность отобранного олигонуклеотида и синтезируют его в нужных количествах. На рисунке 2.24 приведены структуры нескольких аптамеров и названия молекул, к которым они отобраны.

Перспективы применения аптамеров весьма обширны, уже сегодня их активно используют как инструмент исследования в молекулярной биологии, биохимии,

биотехнологии, разрабатывают на их основе методы высокоспецифичной диагностики,

аффинной хроматографии, а также способы адресной доставки лекарственных средств и

терапии.

102

Рис. 2.24. Аптамеры. 1) Пространственная структура ДНК-аптамера к белку системы свертываемости крови тромбину, показаны водородные связи между комплементарными основаниями и стэкинг взаимодействия гуанидинов [1]; 2) 2D-структура РНК-аптамера к антибиотику тетрациклину [2]; 3). 2D-структура ДНК-аптамера к капсидному белку Е2 вируса гепатита [3].

Рибозимы – это короткоцепочечные рибоолигонуклеотиды, обладающие

ферментативными свойствами. Название происходит от двух слов «рибонуклеиновая

Рис. 2.25 Пример структуры комплекса рибозим-РНК. Стрелкой показано место расщепления мРНК. Поскольку эта РНК кодирует определенный белок (т.е. является мРНК), то этот гидролиз приведет к трансляции укороченного нефункционального полипептида [4].

кислота» и «энзим». Эти соединения способны катализировать ряд процессов, в том числе

вызывать расщепление (гидролиз) молекул РНК. На рисунке 2.25 приведен случай такого

расщепления с помощью рибозима. Форма образующегося комплекса рибозим-мРНК напоминает молоток. Такие рибозимы так и называют рибозимами типа «головка

молотка» (hammerhead-type ribozyme).

103

Рибозимы встречаются в клетках и существует гипотеза, что на ранних этапах развития РНК они выполняли двойственную функцию: носителей генетической информации и каталитическую, которая позднее перешла к белкам (гипотеза «мир РНК»,

автор Уолтер Гилберт, США, Нобелевский лауреат по химии 1980 г.). Было показано, что в каталитическом сайте рибосомы (там, где происходит синтез пептидной связи) нет белковых молекул, т.е. эта реакция катализируется молекулами рибосомальной РНК.

Таким образом, рибосомы можно считать примером природного рибозима.

Задачи и упражнения к Части 2

1Опишите общую структуру нуклеотида. Перечислите основные биологические и химические различия между ДНК и РНК.

2Изобразите все возможные способы присоединения фосфатного остатка к: а)

дезоксирибонуклеотиду и б) к рибонуклеозиду.

3Известно, что молекулы ДНК кодируют последовательность аминокислот в белках.

Сколько аминокислот может быть закодировано, если код: а) однобуквенный, б)

двухбуквенный, в) трехбуквенный, г) четырехбуквенный.

4Изобразите все возможные продукты ацетилирования (получение эфира уксусной

кислоты) рибонуклеозида действием уксусного ангидрида. Есть ли разница

в рекакционной активности гидроксильных групп?

5 Киназы – это ферменты, осуществляющие перенос фосфатной группы нуклеозидтрифосфата. Какие из приведенных ниже реакций катализируются киназами?

А) ATP + GDP -> ADP + GTP

ATP + GMP -> AMP + GTP

ADP + CMP -> AMP + CDP

AMP + ATP -> 2 ADP

6Диплоидный организм с гаплоидным геномом размером 45000 kb содержит 21% G-

нуклеотидов. Вычислите количество A, C, G, T в ДНК каждой клетки данного организма.

7Фрагмент ДНК содержит 20 пар оснований, включающих 7 гуанинов. Определите количество A-, U-нуклеотидов в данном фрагменте.

104

8Почему цепи молекулы ДНК можно легко разделить при pH> 11?

9Вычислите массу двойной спирали ДНК в граммах, если ее длина равна расстоянию от Земли до Люны (320 000 км). Масса ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов примерно

1х10-18 г. Расстояние между двумя соседними парами составляет 0,34 ангстрема. Для информаци: в теле человека суммарный вес ДНК составляет примерно 0,5 г.

10Напишите формулы следующих соединений и сравните их растворимость в воде:

дезоксирибоза, гуанин, фосфат натрия. Как растворимость этих веществ соотносится с трехмерной структурой двойной спирали ДНК?

11Какова оптическая плотность растворов (ОД) при длине волны 260 нм, толщине кюветы 1 см следующей концентрации: А) раствор аденина 3,2х 10-5 М (ответ: 0,429)

Б) раствор цитозина 47,5 мкМ (ответ: 0,264) В) раствор урацила 6,0 мкМ (ответ:

0,049)?

12.Вы померили оптическую плотность (ОД) растворов при длине волны 260 нм,

толщине кюветы 1 см и получили следующие данные: раствор гуанина имеет ОД=0,325, а тимина – 0,09. Какова молярная концентрация этих веществ? (Ответы: 4,51х10-5 М и 1,22х10-5 М, соответственно).

13Напишите последовательность 12-нуклеотидных праймеров, которые могут быть использованы для амплификации нижеприведенного фрагмента ДНК с помощью ПЦР.

ATAGGCATAGGCCCATATGGCATGCGATAGGCGCTGGTCA

14 На примере додекануклеотида 3'-CCGGTAGCAACT рассмотреть способ секвенирования методом дидезокситерминаторов (по Сенгеру). В качестве праймера использовать динуклеотид GC. Определить состав из 4-х реакционных смесей ПЦР и состав получаемых продуктов в каждой из них. Изобразить результаты гель-

электрофореза полученных продуктов и восстановить последовательность данного олигонуклеотида.

Как отразится на результате секвенирования, если в реакционную смесь ПЦР добавить: а) слишком много ddNTP; б) недостаточно ddNTP; в) недостаток праймера или его избыток? Как вы думаете, какие требования предъявляются к праймеру?

13.Объясните, почему геномная библиотека больше чем кДНК у организмов? Почему кДНК библиотеки, созданные из различных клеток одного организма, отличаются друг от друга?

105

15.Вам удалось клонировать некий фрагмент кДНК, определить его последовательность и составить соответствующую мРНК (чем она отличается от клонированной ДНК?):

CGUGGCAUUGUGGAACAAUGCUGUACCAGCAUCUGCUCCCUCUACCAG

Таблица кодонов аминокислот

Пользуясь таблицей кодонов, составьте аминокислотную последовательность (ти),

которую может кодировать данная последовательность ДНК. Есть ли разница, если

экспрессировать данную последовательность в клетках Е. coli или Saccharomyces

cerevisiare? Для ответа используйте таблицу, приведенную ниже. Что делают, чтобы

обеспечить эффективность экспрессии?

Таблица. Частота встречаемости кодонов в разных организмах.

Приведены частоты встречаемости (на 1000) кодонов в генах различных организмов. Если бы распределение было равномерным, то частота для всех кодонов была бы в районе 16.4. http://www.kazusa.or.jp/codon/

HUM - Homo sapiens, MUS - Mus musculus, DRO - Drosophila melanogaster, ATH - Arabidopsis thaliana,

YSC - Saccharomyces cerevisiae, ECO - Escherichia coli

	Амино-	Кодон			Организм
	кислота		HUM	MUS	DRO	ATH	YSC	ECO
	Arg	CGA	6.3	6.7	8.5	6.3	3.0	3.5

106

		CGC	10.8	10.1	17.9	3.7	2.6	20.6
		CGG	11.6	10.5	8.3	4.8	1.7	5.4
		CGU	4.6	4.7	8.7	8.8	6.5	20.6
		AGA	11.5	11.4	5.1	19.0	21.3	2.8
		AGG	11.3	11.6	6.4	10.9	9.3	1.7
		CUA	7.0	7.5	8.3	10.1	13.4	4.0
		CUC	19.3	19.6	13.9	15.7	5.4	10.3
	Leu	CUG	39.7	39.3	38.7	10.0	10.4	50.4
		CUU	12.8	12.3	9.1	24.2	12.2	11.2
		UUA	7.3	6.0	4.3	13.2	26.4	13.9
		UUG	12.5	12.5	16.2	21.3	27.1	13.1
		UCA	11.9	11.2	7.6	18.3	18.8	8.1
		UCC	17.5	18.1	19.6	10.9	14.2	9.1
	Ser	UCG	4.5	4.5	16.6	9.0	8.6	8.6
		UCU	14.8	15.4	6.8	25.0	23.6	9.9
		AGC	19.3	20.0	20.4	11.2	9.7	15.3
		AGU	12.0	12.2	11.5	14.3	14.2	9.2
		ACA	14.9	15.6	10.7	15.9	17.7	8.2
	Thr	ACC	19.3	19.6	21.4	10.1	12.6	22.8
		ACG	6.3	6.1	14.4	7.6	8.0	13.8
		ACU	12.9	13.2	9.5	17.6	20.2	10.0
		CCA	16.7	17.3	13.5	16.1	18.2	8.6
	Pro	CCC	20.0	19.1	17.9	5.2	6.8	5.1
		CCG	7.0	6.8	16.0	8.2	5.3	22.0
		CCU	17.3	18.7	6.9	18.3	13.6	7.2
		GCA	15.9	15.5	12.8	17.4	16.2	21.0
	Ala	GCC	28.3	26.7	33.6	10.0	12.6	24.5
		GCG	7.5	7.1	14.0	8.6	6.1	31.8
		GCU	18.5	19.7	14.5	27.5	21.1	16.8
		GGA	16.4	17.3	17.8	23.5	10.9	8.7
	Gly	GGC	22.7	22.9	26.6	8.9	9.7	28.4
		GGG	16.4	15.9	4.7	10.1	6.0	11.0
		GGU	10.8	11.7	13.3	21.7	23.9	25.9
		GUA	7.0	6.9	6.3	10.2	11.8	11.4
	Val	GUC	14.6	15.6	13.9	12.5	11.6	14.6
		GUG	28.8	29.0	28.1	17.3	10.7	25.2
		GUU	10.9	10.1	10.9	27.2	22.0	19.6
	Lys	AAA	24.0	21.3	16.5	31.3	42.1	34.8
		AAG	32.6	34.6	39.5	32.5	30.8	11.5
	Asn	AAC	19.8	21.5	26.1	20.7	24.9	21.8
		AAU	17.0	15.5	20.8	23.1	36.0	19.2
	Gln	CAA	12.0	11.6	15.6	19.7	27.5	14.7
		CAG	34.5	34.5	36.8	15.0	12.2	28.6

107

	His	CAC	14.9	15.3	16.2	8.6	7.8	9.6
		CAU	10.5	9.9	10.6	14.1	13.7	12.6
	Glu	GAA	29.1	26.9	20.9	35.0	45.9	39.7
		GAG	40.2	40.3	43.0	32.1	19.1	18.2
	Asp	GAC	26.1	27.5	24.7	17.1	20.3	19.5
		GAU	22.4	21.4	27.6	37.2	37.8	32.6
	Tyr	UAC	15.8	16.8	18.4	13.5	14.7	12.3
		UAU	12.1	11.8	10.7	15.2	18.8	16.9
	Cys	UGC	12.3	12.6	13.3	7.2	4.7	6.2
		UGU	10.0	10.9	5.3	10.9	8.0	5.1
	Phe	UUC	20.5	21.6	21.8	20.3	18.2	16.4
		UUU	17.0	16.0	13.1	22.7	26.0	21.9
		AUA	7.2	6.6	9.3	13.1	17.8	5.6
	Ile	AUC	21.6	22.9	23.0	18.3	17.1	24.4
		AUU	15.8	14.6	16.5	22.1	30.2	30.1
	Met	AUG	22.3	22.2	23.5	24.4	20.9	26.8
	Trp	UGG	12.9	12.9	9.9	12.6	10.3	13.9
		UAA (ochre)	0.7	0.6	0.8	0.9	1.0	2.0
	Ter	UAG (amber)	0.5	0.5	0.6	0.5	0.5	0.2
		UGA (opal)	1.3	1.1	0.5	1.0	0.6	0.9

Контрольные вопросы

1 Каждый студент получает индивидуальное задание, пример приведен ниже.

Даны 4 олигонуклеотида:

GGGTTATACATACCG AUGCAUCCUUUGGC

TACTAAGTTTAAATT

CTUAGAACTCACAAA

а) Укажите, какие из нуклеотидов являются ДНК, а какие РНК?

б) Напишите под каждой последовательностью, комплементарную цепь; в) Укажите, какие из полученных двуцепочечных ДНК будут плавиться при более высокой температуре и почему?

2.В образцах ДНК, выделенных из двух неизвестных видов бактерий (X и Y), аденин соответственно составляет 32% и 17% от общего состава оснований. Каково

относительное содержание G, T и C в этих образцах ДНК? Один из видов был выделен из горячего источник с температурой 64ºС. Какой из этих видов с наибольшей вероятностью был выделен из горячего источника и почему?

3.Определена первичная структура тРНК E.coli, специфичная к тирозину:

108

5’рGGUGGGGUUCCCGAGCmGGCCAAAGGGA-

CAGACUGUGUAAAψCUGCCGCAUCAUCGACUUCGAAGGUψGCAAUCCUUCCCC

CACCACCA-OH3’

а) Нарисуйте структуру этой тРНК в виде «клеверного листа», используя приведенную на рисунке структуру другой тРНК (к какой аминокислоте она специфична?).

б) В чем наиболее существенное отличие пространственной структуры тирозиновой тРНК от тРНК на рисунке?

в) В каком организме содержание этой тРНК существенно выше, чем других тРНК, специфичных к тирозину? Используйте информационный материал предыдущего семинара

Структурная формула тРНК

4 Нарисуйте пространственную структуру следующего фрагмента двойной спирали ДНК:

5’–AG–3’

3’–TC–5’

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Deng B., Lin Y., Wang C., Li F. Aptamer binding assays for proteins: the thrombin example – a review. Anal. Chim. Acta, V. 837, 2014, 1-15.

109

 Xiao H., Edwards T.E., Ferre´-D’Amare´ A.R. Basis for specific, high-affinity tetracycline binding by an in vitro evolved aptamer and artificial riboswitch. Chem.&Biol. V. 15, 2008, 1125-1137.

 Chen F., Hu Y., Li D., Chen H., Zhang X.L. CS-SELEX generates high-affinity ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2.PLoS One. 2009 4(12):e8142.

 Воробьева М.А., Ковалев Н.А., Зенкова М.А., Веньяминова А.Г., Власов В.В..

Вестник ВОГиС 2006, Т.10, №2, 321-330.

110