Оценка санитарного состояния почвы

Определение Cl. perfringens в почве

Сульфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре (44 ± 1) °C в течение (16 - 18) ч.

Принцип метода Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях,

приближенных к анаэробным, и подсчете числа черных колоний. Посев почвенных разведений в среде Вильсон-Блера

Из приготовленных почвенных разведений (до 1:106), прогретых при температуре (75 ± 5) °C в течение 20 минут для исключения вегетативных форм, по 1,0 см3 переносится в два параллельных ряда пробирок. Затем во все пробирки наливают по 9 - 10 см3 горячего железосульфитного агара, приготовленного ex tempore и прогретого до 70 - 80 °C (среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков). Для создания анаэробных условий роста пробирки быстро охлаждают, помещая в емкости с холодной водой. Посевы инкубируют при (44 ± 1) °C в течение 16 – 18 часов. При росте в среде черных крупных колоний (грамположительные, каталазоотрицательные) выдают положительный ответ о присутствии С. perfringens в 1 г почвы.

Определение методом фильтрования в пробирках Перед посевом пробирки с железосульфитным агаром расплавляют на водяной бане (не

кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70 - 80) °C в водяной бане. После фильтрования установленного объема мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.

Сразу же после посева пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают, помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при 44 °C в течение (16 - 18) ч.

Определение методом фильтрования в чашках Петри Чашки Петри заливают тонким слоем железосульфитного агара 4,0 - 5,0 см3. После

фильтрации фильтр помещают фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так, чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44 ± 1) °C в течение (16 - 18) ч. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. При отсутствии роста на всех фильтрах - дают отрицательный ответ.

Перфрингенс-титр – это наименьшее весовое количество почвы (г), в котором обнаруживаются жизнеспособные клетки C. рerfringens.

Определение в почве нитрифицирующих бактерий

Нитрифицирующие бактерии завершают цикл превращения в почве азотсодержащих соединений, окисляя аммиак до нитритов и нитратов. Поэтому численность этих микроорганизмов довольно четко указывает на степень органического загрязнения, скорость и окончание распада органики в почве.

Определение нитрификаторов можно производить посевом разведений почвенной суспензии на плотных или жидких средах. Чаще всего применяется для этих целей минеральная среда Виноградского. Для этого производят посев почвенных разведений, приготовленных обычным способом, во флаконы со средой, разлитой тонким слоем. В опыт рекомендуется включать два незараженных флакона со средой, служащих контролем на чистоту среды. Посевы инкубируют при 28 °C в течение 14 - 15 суток.

При развитии нитрифицирующих бактерий в среде постепенно появляются азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота рекомендуется проверять на 5 - 7

день после засева и вторично на 14 - 15 день. Титр нитрифицирующих бактерий чаще всего устанавливают с помощью качественной пробы с дифениламином; в присутствии азотистой и азотной кислот этот реактив дает синее окрашивание. Для этого пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносятся на стеклянную или фарфоровую пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов не должна давать изменение окраски.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХ ЗАГРЯЗНЕНИЕ И САМООЧИЩЕНИЕ ПОЧВЫ ОТ ОРГАНИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ Общее количество бактерий и нитрификаторов дает определенное представление о течении

процессов загрязнения и самоочищения почвы от органических и химических загрязнений, но далеко не полное. В связи с этим для более глубокого изучения этих процессов дополнительно применяется комплекс методов определения отдельных групп и видов почвенной микрофлоры: общая численность сапрофитных микробов, число споровых бактерий, аммонификаторов, целлюлозоразлагающих микроорганизмов и др.

Определение общей численности почвенных сапрофитных микроорганизмов Напряженность микробиологических процессов почвы коррелятивно связана с размножением и активностью всей совокупности почвенных сапрофитных микроорганизмов. Существуют несколько методов определения численности почвенных сапрофитов: посев почвы на питательные среды, микроскопия.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов на питательных средах. Посев производится на поверхности почвенного агара, разлитого в чашки Петри. Термостатирование засеянных чашек ведется при 28 - 30 °C в течение 72 часов. Учет анализа и расчет общей численности почвенных микроорганизмов производится, как и при определении общего количества бактерий.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов методом прямой микроскопии. При определении численности почвенной микрофлоры наиболее достоверные результаты можно получить при использовании методов непосредственного учета микроорганизмов в почве - прямой микроскопии. Желательно при этом пользоваться методом капилляроскопии по Перфильеву и Габе с последующей люминесцентной микроскопией. Обработка почвенной суспензии при этом проводится 1% раствором акридинового оранжевого. Этот метод дает возможность определить в 10 раз большее количество живых микробных клеток в 1 г почвы за счет учета клеток, сорбированных на почвенных частицах.

Для этого к 1 мл почвенного разведения 1:10 добавляется 1 - 2 капли красителя. Через 5 секунд в почвенную суспензию помещают отрезок счетного капилляра (2 - 2,5 см). После заполнения капилляра его помещают на предметное стекло и фиксируют двумя каплями расплавленного парафина, нанося их на концы отрезка капилляра. Эти парафиновые капли одновременно защищают содержимое каналов. После этого приступают к подсчету общей численности почвенных микроорганизмов с помощью люминесцентного микроскопа при увеличении до 90 x 10.

Численность микроорганизмов в 1 г почвы определяется по формуле:

m x 1012

Q = -------- x С,

И

где:

Q - количество микроорганизмов в г изучаемого образца почвы;

m - средняя численность микроорганизмов в одном ходе капилляра; 1012 - объем 1 куб. см в кубических мк; И - объем одного хода капилляра в кубических мк;

С - кратность разведения суспензии, которая обычно равна 10.

Определение общего числа и процента почвенных бацилл Этот показатель является индикатором глубины минерализации органического субстрата.

В чистых почвах с окончившимся процессом самоочищения число бацилл относительно общей микробной обсемененности достигает 20 - 50%, в загрязненных сохраняется в пределах до 20%. Однако содержание бацилл и их процент колеблется в зависимости от почвенно-климатических условий, поэтому в конкретных условиях необходимо устанавливать величины этих микробиологических показателей.

Для учета бациллярных форм микроорганизмов используются те же почвенные разведения, что и для определения общей численности, предварительно прогретые при 80 °C в течение 15 минут. Посев может производиться на поверхность среды, состоящей из 50% сусла и 50% мясо-пептонного агара (pH 7,0 - 7,2), на поверхность агара Сабуро или почвенного агара. Термостатирование и учет производятся аналогично, как и при учете общей численности микроорганизмов.

Определение количества грибов и актиномицетов в почве Данные по изучению загрязнения почвы указывает на большую чувствительность к

действию отдельных химических веществ почвенных актиномицетов и грибов по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Несомненно, что такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ и благодаря чрезвычайно выраженным антагонистическим и токсическим свойствам они оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных ценозов, являются продуцентами многих физиологических активных веществ - аминокислот, ферментов, витаминов.

Для учета почвенных актиномицетов и грибов используются те же разведения почвенной суспензии, что и при учете общей численности микроорганизмов, те же методы посева и учета. Как правило, для учета почвенных грибов используют разведения почвенной суспензии 1:10 - 1:100, а при учете актиномицетов - 1:100 - 1:10000. Посев производят поверхностным способом, нанося на агаризованные среды 0,1 - 0,05 мл суспензий. Для учета актиномицетов используется чаще всего крахмало-аммиачный агар или агар Ваксмана, при учете грибов - сусло-агар или минеральная среда Чапека. При учете грибов используют добавление в среду веществ, ингибирующих рост бактерий, - концентрированную молочную кислоту в количестве 4 мл/л среды. Прибавление такого количества кислоты доводит pH среды до 4,0 - 4,5. Кислота добавляется непосредственно перед посевом в расплавленную среду. Поскольку прибавляют концентрированные кислоты, то их предварительно не стерилизуют.

Определение аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов

Эта группа микроорганизмов осуществляет самоочищение почвы от остатков растительного происхождения. Чаще всего для учета этих микроорганизмов используют посев разведений почвенной суспензии в жидкую среду Гетчинсона. Среда разливается в колбочки или пробирки, куда в качестве источника углерода помещают фильтровальную бумагу; в колбочки опускают складчатый фильтр, в пробирки - полоски бумаги. Учет

производится через 15 - 20 суток (инкубация при 28°) по разложению полосок фильтровальной бумаги и образованию колоний микроорганизмов на них.

Определение аммонификаторов в почве

Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на мясо-пептонном агаре, а при необходимости на жидких пептонных средах (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными бумажками, открывающими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака краснеют). При выращивании почвенных суспензий на мясо-пептонном агаре результаты выражают в количестве бактерий на 1 г почвы. При определении этого показателя в жидких средах определяют титр аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25 - 30 °C.

Определение токсичности почв по отношению к микроорганизмам

Метод определения степени токсичности почв к микроорганизмам используется в качестве быстрого и достаточно чувствительного теста для получения ориентировочных данных о самоочищающей способности почвы от патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Кроме того, этот тест оказался также чувствительным при определении влияния химических веществ на почвенный микробиоценоз. Низкая степень токсичности или ее снижение по отношению к патогенным микроорганизмам свидетельствует о наличии или возникновении более благоприятных условий для выживания возбудителей в таких почвах. К почвенным сапрофитам - наоборот: высокая или повышенная токсичность - явление неблагоприятное. Степень токсичности почв отдельных территорий оценивается по классам:

1 - отсутствие - 0 - 20% токсичных образцов, 2 - слабо выраженная - 21 - 40% токсичных образцов, 3 - средняя - 41 - 60% токсичных образцов,

4 - сильно выраженная - 61 - 80% токсичных образцов, 5 - абсолютная - 81 - 100% токсичных образцов.

Для определения токсичности почв можно использовать два метода - качественный и качественно-количественный.

Качественный метод определения токсичности почв. В стерильную чашку Петри вносится 10 г перемешанной и просеянной почвы и ровным слоем распределяется на половину дна чашки. На дне и крышке чашки записывается номер пробы по журналу и тестмикроорганизм. Затем чашки переносятся в бокс и устанавливаются на ровной поверхности. Чашки с почвой заливают 1,5% непитательным агаром в количестве около 10 мл с таким расчетом, чтобы он покрыл слой почвы. После его застывания в чашки вносится питательный агар также в количестве 10 мл, адекватный тест-микроорганизмам. С одного почвенного образца готовятся 2 параллельные чашки к каждому микроорганизму. Чашки высушивают под бактерицидными лампами в течение 30 минут. Затем производится посев индикаторных штаммов микроорганизмов.

Посевы производятся петлей, причем движения петли всегда начинают с той части чашки, на которой помещена почва. В качестве контроля производят посевы тех же культур на аналогичные среды, но без почвы.

Посевы инкубируют в зависимости от вида индикаторного микроорганизма. Учет результатов начинается с просмотра контрольного посева. В случае равномерного роста тест-микроба на всей поверхности агаровой пластинки просматривают остальные чашки с

посевами. Колонии идентифицируются по "форме роста". Кроме того, из каждой серии посевов с нескольких чашек снимают колонии и производят их идентификацию. Распределение выросших колоний на всей поверхности среды свидетельствует о том, что исследуемая почва нетоксична (Н/Т), а в случае роста колоний только на участке агаровой пластинки, под которой нет почвы, показывает, что исследованный почвенный образец токсичен (Т). При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловыраженная токсичность (М/Т).

Качественно-количественный метод определения токсичности почв. В стерильную чашку Петри также вносится 10 г почвы, но распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится непитательный и питательный агар. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.

На матовую поверхность мембранных фильтров N 3 - 4 простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуется кипячением обычным способом. Затем на поверхность питательной среды помещаются мембранные фильтры (матовая поверхность - вверх) в количестве от 1 до 4-х на одну чашку. На поверхность фильтра в местах, отмеченных точками, производится посев бактериальной петлей (иглой) культуры индикаторного штамма, суспензированного в физиологическом растворе, содержащем около 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Эта манипуляция упрощается при использовании специального штампа в виде металлического диска диаметром около 30 мм. В диск вмонтированы 16 стальных игл строго одинаковой длины и толщины. Культуры микроорганизмов наливаются в чашки Петри и погружают в них кончики игл стерильного штампа, а затем одновременно производится посев в 16 точках мембранного фильтра. Посевы инкубируются в термостате или анаэростате при оптимальной температуре и продолжительности в зависимости от физиологических особенностей каждого вида.

Учет результатов производится путем подсчета выросших колоний от количества точек посев. Процент пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле: Т = 100 - Р. Этим методом, как и качественным, устанавливается абсолютная токсичность, когда на фильтрах не вырастает ни одной колонии; отсутствие токсичности - на местах всех посевов вырастают колонии и различная степень токсичности - когда прорастает только часть засеянных точек.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ВИРУСОВ В ПОЧВЕ Определение сальмонелл в почве

С целью определения сальмонелл в почве могут быть использованы два равнозначных по эффективности метода.

1.Усовершенствованный метод коагуляции с центрифугированием по Фиккеру (увеличение скорости центрифугирования с 3000 об./мин. до 5000 об./мин. повысило чувствительность метода в 5,8 раза).

2.Метод обнаружения сальмонелл в почве с использованием магниевой среды накопления, исключающей необходимость дополнительной обработки почвенной суспензии (коагуляцию с центрифугированием).

Выделение сальмонелл из почвы методом коагуляции с центрифугированием. Для концентрирования сальмонелл применяется 10% раствор сернокислого железа. В

исследуемый объем почвенной	суспензии (500 мл) добавляют	2	мл 10%	раствора
углекислого натрия для подщелачивания, что способствует процессу коагуляции,				и 1,7 мл
10% раствора Fe2(SO4)3 . Суспензию тщательно перемешивают		с	коагулянтами и

помещают на 1 час в холодильник при температуре +4° до полного образования хлопьев. Через час осадок вместе с надосадочной жидкостью разливают в стерильные центрифужные стаканы по 100 мл и центрифугируют 5 минут со скоростью 5000 об./мин.

Если позволяет техническая возможность лаборатории, лучше проводить центрифугирование 500 мл почвенной суспензии без ее предварительного дробления. Жидкость над осадком, образовавшимся после центрифугирования, выливают и добавляют по 1,0 мл 25% раствора виннокислого калия, тщательно перемешивают и содержимое всех центрифужных стаканов сливают в одну колбу для дальнейшего исследования.

По 0,1 - 0,5 мл образовавшейся взвеси пипеткой засевают на 3 - 5 чашек с висмутсульфитным агаром и шпателем растирают по поверхности агара. К оставшейся взвеси добавляют 50 мл желчного бульона с концентрацией желчи 10 - 20%. Посевы инкубируются при температуре 37 °C.

Из сред накопления делают высев петлей на 3 - 5 чашек висмут-сульфитного агара через 5 часов инкубации, второй - через 20 часов. При этом основным является посев через 5 часов, а через 20 часов - дополнительным (в случае отсутствия срочности результатов исследования можно ограничиться лишь высевом через 20 часов инкубации желчного бульона).

Дальнейшая идентификация сальмонелл проводится по общепринятой методике. Применение магниевой среды "М" для обнаружения сальмонелл в почве. Этот метод более простой, не требует каких-либо дефицитных реактивов и специального оборудования. Применение магниевой среды "М" сокращает время обработки каждой пробы почвы на 1,5 часа. Однако следует учитывать, что среда "М" угнетает рост сальмонелл тифа.

В почвенную суспензию вносят растворы и навески ингредиентов среды "М" с расчетом на исследуемый объем суспензии. Посевы инкубируются в термостате при температуре 37°. Через 18 - 20 часов производят высев петлей на 3 - 5 чашек висмут-сульфитного агара. Дальнейшая идентификация проводится по общепринятой методике.

При исследовании сильнозагрязненных почв возможна замена желчного бульона и среды "М" широко распространенным в настоящее время селенитовым бульоном в классической прописи в первом случае и двойной концентрации - во втором (соотношение почвенной суспензии и среды 1:1). Однако необходимо отметить, что чувствительность метода коагуляции с центрифугированием при этом снижается на один, а без обработки коагулянтами - на два порядка, к тому же при использовании селенитового бульона высев через 5 часов инкубации малорезультативен.

Индикация и выделение патогенных клостридий из почвы

Индикация и выделение столбнячной и ботулинической палочек из почвы производится аналогично, как и из других объектов внешней среды и при исследовании материалов от больных и трупов. Особенностью являются методические приемы предварительной обработки почвы до проведения анализа.

Исследования почвы на наличие патогенных клостридий могут производиться в обычных условиях санитарно-бактериологических лабораторий, имеющих виварий и экспериментальных животных (белые мыши, морские свинки).

Идентификация и выделение столбнячной палочки. Основным методом обнаружения Cl. tetani в почве является биологическая проба на лабораторных животных. Существует несколько способов подготовки образцов почвы к исследованию.

Исследование нативных почв. Предварительно образцы почв хорошо перемешивают в стерильных (обожженных спиртом) лотках, отбирают 3 - 5 г, которые переносят в стерильные фарфоровые ступки и тщательно растирают, после чего добавляют 6 - 8 мл физиологического раствора, перемешивают и оставляют на 1 - 2 часа при комнатной температуре. Из полученной взвеси по 1 мл внутримышечно вводят двум белым мышам в правую заднюю лапку (в бедро); морским свинкам можно ввести 3 - 5 мл взвеси. При наличии столбнячной палочки в почве через 2 - 3 дня у мышей развивается типичная картина столбняка. Для окончательного решения вопроса о наличии столбнячной палочки в исследуемом образце ставят реакцию нейтрализации с противостолбнячной сывороткой (Руководство по санитарной охране почвы, М., 1972).

Методы пастеризации. а) Исследуемый образец почвы, взвешенный в изотоническом растворе в соотношении 1:2 - 1:10, прогревают во флаконах на водяной бане при температуре 90° в течение 10 минут. Затем взвесь помещают в аппарат для встряхивания и взбалтывают 10 - 15 минут, после чего отстаивают в течение 1 - 2 минут и по 1 - 1,5 мл надосадочной жидкости внутримышечно вводят в заднюю правую лапку 2-м белым мышам. Учет производится, как и при введении животным взвеси из нативной почвы.

б) Исследуемый образец в чашках Петри высушивают в печи Пастера при температуре 37°

втечение 50 минут, затем растирают в стерильной ступке до порошкообразного состояния и просеивают через 3-мм стерильное сито. После образец прогревают при температуре 80°

втечение 30 минут. Два грамма прогретой почвы помещают в стерильные пробирки, добавляют 6 мл стерильного изотонического раствора и снова прогревают при температуре 60° в течение 1 часа. Этот материал в количестве 1 - 1,5 мл вводят белым мышам аналогично, как было указано выше. Контрольным животным за 48 часов до опыта необходимо ввести от 0,1 до 3 АЕ противостолбнячной сыворотки.

Гибель первой группы животных с характерными симптомами (функции конечностей нарушаются, хвост вытягивается, возникает искривление позвоночника) наряду с выживанием контрольных мышей указывает на наличие Cl. tetani в исследуемых образцах. Подобные методические приемы обработки образцов почвы могут привести, однако, к уничтожению вегетативных, а частично и споровых форм столбнячной палочки. Поэтому более целесообразным является метод с подращиванием на питательных средах.

Метод с подращиванием. Нативную и прогретую при 80° в течение 15 - 20 минут почву засевают в питательные среды для культивирования анаэробных микроорганизмов (КиттТароцци, бульон Мартена с комочками ваты и др.). Биологическую пробу на белых мышах ставят путем введения им культуральной жидкости на 3 - 4 сутки инкубации. При этом методе опытным животным предварительно вводят противогангренозные сыворотки, а контрольным - противогангренозные и противостолбнячные сыворотки. Учет результатов аналогичен, как и при введении животным почвенных суспензий.

При всех методах предварительной обработки почвы наблюдение за опытными и контрольными животными необходимо вести в течение 10 дней.

Посев в питательные среды позволяет выделить и культуры столбнячной палочки. Выделение Cl. tetani производится по обычной методике.

Индикация и выделение ботулинической палочки. Для индикации и выделения возбудителя ботулизма производят посев почвы в среды накопления, преимущественно Китт-Тароцци. Две навески почвы по 20 - 30 г растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором или 1% пептонной водой и засевают во флаконы с 80 - 100 мл питательной среды. Один флакон прогревают на водяной бане при 80° в течение 30 минут. Оба флакона инкубируются при температуре 37° в течение 2-х недель.

Для индикации Cl. botulinum на 5-е сутки роста по 0,5 мл культуральной жидкости, разведенной 1:2 - 1:3 физиологическим раствором, вводят 2-м белым мышам внутрибрюшинно. В случае гибели белых мышей на 1 - 2-е сутки после заражения ставят реакцию нейтрализации с поливалентной сывороткой с содержанием в 1 мл 10 АЕ каждого типа ботулинической палочки. Для этого 1 мл поливалентной сыворотки смешивают с 1 мл культуральной жидкости, выдерживают 45 минут при комнатной температуре, затем ставят биологическую пробу. Двум мышам внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл нейтрализационной культуральной жидкости, а 2-м - культуральную жидкость без сыворотки. Реакция нейтрализации считается положительной, если животные, которым вводили культуральную жидкость без противоботулинической сыворотки, погибли на 1 - 4-е сутки после заражения с клинической картиной заболевания, типичной для ботулизма, а животные, которым вводили смесь культуральной жидкости с противоботулинической сывороткой, остались здоровыми в течение 4 дней или заболевали с нетипичной для ботулизма клинической картиной.

Для определения типа Cl. botulinum в дальнейшем ставят реакцию нейтрализации с моновалентными противоботулиническими сыворотками типа А, В, С, Д, Е с активностью 10 АЕ в 1 мл. При наличии в пробах почв нескольких типов Cl. botulinum ставят реакцию нейтрализации с биили тривалентными сыворотками.

Выделение культур Cl. botulinum производят из сред обогащения, положительных на ботулинический токсин, на 8 - 14-е сутки. Производят высев на чашках с сахарным кровяным агаром с последующим обычным ходом анализа при выделении культур Cl. botulinum из других объектов.

Исследования по выделению Bac. anthracis из почвы производится в лабораториях, имеющих условия и разрешение на работу с возбудителями особо опасных инфекций. Предварительная подготовка проб почвы. Навеску почвы в 5 - 30 г взбалтывают в течение 10 минут с 50 - 100 мл стерильной воды, а затем отстаивают. Для уничтожения вегетативных форм микроорганизмов к почвенной взвеси добавляют в избытке кристаллов мочевины и подогревают на водяной бане при температуре 37° в течение 5 - 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, доводят по объему до 1-го литра стерильным физиологическим раствором; 0,5 л равными порциями фильтруют через 4 мембранных фильтра без прогревания, а вторые 0,5 л в колбах предварительно прогревают при температуре 65 - 70° в течение 30 минут или при температуре 80° в течение 10 минут и также фильтруют через 4 мембранных фильтра.

Для проведения люминесцентно-серологического анализа 2 фильтра засевают на чашки с 0,7% МПА путем накладывания мембранного фильтра на питательную среду вверх поверхностью, через которую фильтровали почвенную взвесь, а с остальных фильтров делают смыв в стерильных чашках Петри, для чего на поверхность наносят 1 мл физиологического раствора. Смыв используют для посева на среду ГКИ, введения белым мышам (тест капсулообразования in vivo) и исследования люминесцентно-серологическим методом.

Аналогично исследуются и фильтры, через которые профильтровывали прогретую надосадочную жидкость.

Предварительный положительный ответ (сигнальный) дается на основании специфического свечения материала в люминесцентно-серологическом анализе, капсулообразования in vivo и in vitro.

Люминесцентно-серологический анализ. Из исследуемых суспензий, полученных с мембранных фильтров, делают мазки на предметных стеклах, фиксируют путем погружения на 10 - 15 минут в метанол и окрашивают продажной люминесцирующей адсорбированной сибиреязвенной сывороткой в рабочем разведении, указанном в наставлении и на этикетке ампулы. Для этого на препарат наносят каплю сыворотки и помещают на 20 мин. во влажную камеру, затем промывают забуференным физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,4) в течение 10 минут и докрашивают люминесцирующей сывороткой против глобулинов кролика в рабочем разведении, смешанной с бычьим альбумином, меченным родамином в течение 15 минут. Мазки вновь промывают забуференным физиологическим раствором, подсушивают, наносят каплю смеси 9 частей глицерина и одной части забуференного раствора и закрывают покровным стеклом. В препаратах, содержащих микробные клетки с капсулой, наблюдается их яркозеленое свечение.

Капсулообразование. Капсулообразование устанавливают "прямым" путем в результате бактериоскопии окрашенных (методами выявления капсул) мазков, приготовленных из фильтратов, а также мазков, приготовленных из посевов на питательные среды: Государственного института им. Тарасевича, среду Томова или Буза.

Из различных способов окраски капсул наиболее простым и демонстративным является применение раствора Ребигера, который одновременно фиксирует и красит мазки. Берут 15

- 20 г генциана фиолетового и растворяют в 100 мл 40% формалина. Раствор выдерживают при комнатной температуре несколько часов, затем фильтруют. Нефиксированный мазок покрывают краской на 15 - 20 секунд, после чего промывают водой и высушивают. Капсулы окрашивают в красно-фиолетовый цвет, а тело бациллы - в темно-фиолетовый.

Тест на капсулообразование in vivo по Шляхову и Груз проводится следующим образом. Исходный смыв с фильтров вводят по 0,5 мл внутрибрюшинно 6 - 8 белым мышам. После инокуляции материала животным одну пару мышей оставляют под наблюдением 10 суток, как при классической биологической пробе. Остальных мышей забивают (по 2 мыши) через 1, 2 и 3 часа. Забитых мышей вскрывают. Из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки; из селезенки, почек, легких, печени делают мазки-отпечатки, окрашивают по Ребигеру или леффлеровской синькой и микроскопируют на предмет выявления капсульных палочек сибирской язвы.

Окончательное заключение дается на основании выделения чистых культур и их изучения. Посев и идентификация чистых культур. Посев исходного материала производят на МПА или МПБ, приготовленные на переваре Хоттингера (амминного азота 100 - 110 мг%, pH среды 7,2 - 7,6). Посевы инкубируют при температуре 37° в течение 18 - 24 часов. На агаре сибиреязвенная палочка растет в виде серовато-белого сухого налета, по краям которого при малом увеличении видны локообразные завитки. В бульоне наблюдается рост на дне пробирки в виде комка ваты, бульон остается прозрачным.

На МПБ и МПА Bac. anthracis в обычных аэробных условиях растет в виде бескапсульных особей, что не позволяет определить один из важнейших признаков - капсулообразование. Для выявления последнего наилучшим, "прямым" способом является заражение животных (белых мышей) с последующим исследованием патологоанатомического материала.

Существуют также другие лабораторные приемы выявления капсулообразования наряду с прочими признаками сибиреязвенного микроба. В частности, для этих целей предложен ряд элективных питательных сред: среда ГКИ, Томова, Буза.

Посевы на средах Томова и Буза инкубируют в атмосфере 20 - 40% углекислого газа (в кристаллизаторе или микроанаэростате) в течение 18 - 24 часов, затем делают мазки, окрашивают и микроскопируют на предмет выявления капсульных палочек антракса. На средах Томова и Буза колонии сибиреязвенной палочки растут в S- или SM-форме: гладкие, блестящие, слизистой консистенции.

Идентификацию и дифференциацию выделенных культур проводят на основании главных и дополнительных опорных признаков. К ним относятся специфическая патогенность, капсулообразование, тест жемчужного ожерелья, лизабельность бактериофагом, люминесцентно-серологический тест. Дополнительными являются лецитиназная активность, неподвижность, отсутствие гемолиза, образование фосфатазы.

Санитарно-вирусологическое исследование почвы

При санитарно-вирусологических исследованиях почвы следует в первую очередь брать пробы из верхних слоев, так как установлено, что в природных условиях энтеровирусы адсорбируются главным образом верхними слоями почвы.

Отбор проб почвы для санитарно-вирусологических исследований производится так же, как и отбор для санитарно-бактериологического анализа, поэтому одни и те же пробы могут быть исследованы параллельно на наличие энтеровирусов и бактериальную обсемененность.

В отличие от санитарно-бактериологического анализа проб почвы, для которых все исследования необходимо производить непосредственно по доставлении проб в лабораторию, санитарно-вирусологический анализ состоит из нескольких этапов, которые могут значительно отстоять друг от друга во времени, так как первично обработанные пробы могут храниться в холодильнике в замороженном состоянии.

Первичную обработку проб почвы для санитарно-вирусологического анализа рекомендуется проводить в день отбора проб, непосредственно после транспортировки в лабораторию. При невозможности немедленной обработки проб их помещают в холодильник при температуре +4° и обрабатывают на следующий день. Производить обработку проб позже чем через 24 часа после отбора проб не следует, так как титр энтеровирусов в пробе значительно падает и снижается возможность их выделения.

Предварительная обработка почвы для проведения вирусологических исследований. С целью максимальной десорбции адсорбированных на почвенных частицах вирусов применяют специальные приемы первичной обработки пробы почвы. Для этого в навеску почвы 5 г добавляют в качестве десорбента стандартную среду N 199, содержащую 5% нативной бычьей сыворотки с pH 8,5. Проба тщательно перемешивается в течение 5 минут для разрушения почвенных конгломератов.

Для механического отрыва вирусов с почвенных частиц проба в течение 5 минут интенсивно встряхивается в вертикальной плоскости. Полученная почвенная суспензия центрифугируется при 4000 об./мин. в течение 15 минут. Надосадочную жидкость отсасывают и переносят в стерильные флаконы, добавляют равное по объему количество этилового эфира. Эфир и пробу тщательно смешивают пипетированием или встряхиванием на шуттель-аппарате до получения гомогенной эмульсии. Флаконы закрывают ватными пробками и помещают в холодильник при температуре 4 - 6 °C. После того как эфир испарится (3 - 4 дня), флаконы перекрывают резиновыми пробками и хранят в замороженном состоянии при -15 - -20° до последующего вирусологического анализа.

Выделение цитопатических вирусов. С целью полного выделения из исследуемой пробы почвы группы энтеровирусов необходимо использовать параллельно минимум два вида культур ткани: первичную и перевиваемую.

В качестве первичной культуры ткани можно использовать клетки почек обезьян, фибробласты эмбриона человека, клетки почек человека. Из перевиваемых линий можно рекомендовать: НЕР-2, HeLa, PM, ФК и др.

Заражение культуры ткани производят во флаконах емкостью 50 - 100 мл. В силу того что материал может обладать выраженным цитопатическим действием, заражение следует проводить следующим образом: после удаления питательной среды на монослой клеток наносят 0,5 - 1,0 исследуемой пробы и флакон помещают на 30 минут в термостат при 37°. Затем пробу сливают и добавляют 10 мл поддерживающей среды. Зараженные культуры клеток инкубируют в термостате 7 - 9 дней.

При отсутствии цитопатического действия на культуру ткани при первичном заражении проводят 2 слепых пассажа по общепринятой методике в пробирках (не менее 2 пробирок на каждое заражение). Результаты считают отрицательными, если во всех пассажах отсутствовал цитопатический эффект.

Идентификация выделенных цитопатических агентов проводится по общепринятой методике с учетом того, что в одной пробе могут присутствовать несколько типов вирусов, что создает трудности при их типировании.