7 семестр / Методичка - Химическая кинетика
.pdfРисунок 7.5 Биосенсорная установка на основе кислородного
электрода
2. Для модификации кислородного электрода наносят 10 мкл суспензии фермента глюкозооксидазы на диализную мембрану (Sigma,
США) и фиксируют на электроде с помощью резинового кольца (рисунок
7.6).
110
Рисунок 7.6 Иммобилизация фермента на кислородном электроде с
применением диализной мембраны: 1 – платиновый электрод; 2 – серебряная проволока; 3 – раствор фермента; 4 – газопроницаемая мембрана; 5 – диализная мембрана; 6 – резиновое кольцо фиксации; 7 – кислородный электрод с иммобилизованным ферментом ГО (или бактериями P.yeei).
1. Управление прибором и обработка результатов измерений проводится с помощью программы «EXP2PR», установленной на персональном компьютере.
Рисунок 7.7. Окно программы «EXP2PR»
111
2.В кювету вносят 4 см3 буферного раствора и погружают в нее электрод с иммобилизованным ферментом (или бактериями P.yeei).
Дожидаются установления стационарного содержания растворенного кислорода (от 4 до 8 мг/дм3).
3.Во вкладке программы «Таблица» выставляют интервал записи 1 секунду, нажимают галочку «Запись интервал» и вводят в кювету раствор глюкозы. При введении субстрата в измерительную ячейку фермент окисляет его, в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью датчика растворенного кислорода, подключенного к анализатору «Эксперт – 001».
Рисунок. 7.8. Вкладка «Таблица» программы «EXP2PR»
4.После окончания измерения кювету снова промывают буферным раствором, до восстановления начальных параметров (содержание кислорода).
5.После снятия ответа данные копируют в программу Exel и
проводят их обсчет, выбирая максимальный тангенс угла наклона
112
(коэффициент при x в уравнении прямой). Измеряемым параметром
(ответом биосенсора) является максимальная скорость (по модулю) изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата (рисунок 7.9)
Рисунок 7.9 Ответ биосенсора (R) при добавлении субстрата
6. |
Данные измерений заносят в таблицу |
|
||
|
|
|
|
|
№ |
|
Объем пробы |
Концентрация |
Скорость реакции (r), |
|
|
глюкозы, мкл |
глюкозы в кювете |
мг/ дм3с |
|
|
|
(S), моль/дм3 |
|
|
|
|
|
|
1 |
|
50 |
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
100 |
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
150 |
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
200 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
113 |
|
5 300
6500
7700
11.По полученным экспериментальным и расчетным данным строят зависимость ответа биосенсора от концентрации глюкозы в кювете в программе SigmaPlot. Обрабатывают данную зависимость
гиперболической функцией.
Определяют константу Михаэлиса (КМ) (коэффициент b из уравнения гиперболы) и максимальную скорость ферментативной реакции (rmax) (коэффициент а из уравнения гиперболы) из вкладки «Report».
114
7. Строят график в программе Exel в двойных обратных координатах по методу Лайнуивера-Берка по данным таблицы
№ |
Концентрация |
Скорость |
|
1/S |
1/r |
|
|
глюкозы |
в |
реакции |
(r), |
|
|
|
кювете |
(S), |
мг/ дм3с |
|
|
|
|
моль/дм3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Данная зависимость также описывается уравнением прямой (y=ax+b). В случае отклонения от линейности при необходимости можно
удалить несколько точек, т.к. метод хорошо работает только в области малых значений переменных. Максимальная скорость (rmax)
ферментативной реакции соответствует обратной величине свободного члена уравнения (коэффициент b). Константа Михаэлиса может быть найдена как графически (-1/отсекаемый отрезок на оси х) (рисунок 7.3) ,
так и аналитически как произведение тангенса угла наклона прямой (коэффициент а в уравнении) на rmax.
115
8. |
Строят график в программе Exel в обратных координатах по |
|||||||
методу Иди-Хофсти по данным таблицы |
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
№ |
|
Концентрация |
Скорость |
реакции |
r/S |
|
|
|
|
|
глюкозы |
в |
(r), мг/ дм3с |
|
|
|
|
|
|
кювете |
(S), |
|
|
|
|
|
|
|
моль/дм3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Данная зависимость описывается уравнением прямой (y=ax+b), где константа Михаэлиса (Km) равна тангенсу угла наклона (коэффициент а), а максимальная скорость (rmax) соответствует коэффициент b (рисунок 7.4).
9. Проводят сравнение констант рассчитанных тремя способами и
делают вывод по работе
Контрольные вопросы
1.Ферментативная кинетика.
2.Физический смысл константы Михаэлиса. Что такое кажущаяся константа Михаэлиса?
3.Почему константа Михаэлиса является кинетическим параметром ферментативной реакций, а не равновесной константой?
116
4.Методы определения параметров уравнения Михаэлиса-
Ментен.
5.Суть метода Иди-Хофсти
6.Суть метода Лайнуивера-Берка
117
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРА
Цель работы: выявить влияние обратимых ингибиторов на кинетику ферментативной реакции окисления глюкозы ферментом глюкозооксидазой (или бактериями).
Теоретические сведения
На активность всех ферментов могут влиять неспецифические факторы, такие как температура и рН. Кроме того, существуют вещества, которые в очень низких концентрациях повышают активность ферментов (активаторы), или, напротив, снижают ее (ингибиторы). Активаторы и ингибиторы могут действовать в активном центре или в удалённом от него, аллостерическом центре молекулы фермента.
Рассмотрим схему взаимодействия конкурентных и неконкурентных ингибиторов на фермент в присутствии субстрата (рисунок 8.1).
118
Рисунок 8.1. Сравнение конкурентного и неконкурентного ингибирования.
В общем случае влияние обратимо действующих ингибиторов на двухстадийную ферментативную реакцию может быть передано схемой (рисунок 8.2). В этой схеме предусмотрено взаимодействие ингибиторов (I) как со свободной формой фермента (E), так и с фермент-субстратным комплексом (ES).
Рисунок 8.2. Общая схема ингибирования, где: E – фермент;
S – субстрат;
ES – фермент-субстратный комплекс;
119