книги из ГПНТБ / Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков
..pdf
NEW TECHNIQUES IN AMINO ACID,
PEPTIDE AND PROTEIN ANALYSIS
EDITED BY A. NIEDERWIESER
AND G. PATAKI
Ann Arbor Science Publishers, Inc.
1971
Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков
Перевод с английского канд. хим. наук Ю. В. Алахова, канд. хим.
наук Ц. А. Егорова и канд. хим. наук П. Д. Решетова Под редакцией академика Ю. А. Овчинникова
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР» . МОСКВА . 1974
УДК 641.64 + 577.1
Книга представляет собой методическое руководство по 1ис.
следованию пептидов и белков и содержит ценные данные, от|ра_ жающие современное состояние и тенденции этой области.
В книге подробно рассматриваются автоматический метгод анализа пептидов и белков с помощью ионообменной хромат^, графин, газожидкостная хроматография аминокислот и пет,,и. дов, очистка белков с помощью гель-фильтрации и электро^, реза, изучение функциональных групп в белках с привлечени|ем химических методов. Отдельная глава посвящена изучению ч^т_ вертичной структуры белков.
Книга предназначена для специалистов, работающих в об^,а. сти химии белка.
Редакция литературы по химии
20504—085
Н 041(01)—74 85— 74 © Перевод на русский язык, «Мир», 1974
ПРЕДИСЛОВИЕ
Белки и пептиды занимают особое место среди биологически важных веществ. Они не имеют себе равных по многообразию и спектру выполняемых ими биологических функций и участвуют, по существу, во всех процессах жизнедеятельности. Среди них мы встречаем ферменты, гормоны, антибиотики, токсины, белкирецепторы и белки-регуляторы; белки образуют строительный материал тканей и органов, лежат в основе защитных систем живого организма (антитела, интерфероны и т. п.), являются ключевыми элементами всех биологических транспортных и энергетических систем. Несмотря на то что многие белки уже хорошо изучены, перед исследователем предстают новые неизве данные просторы мира белков, и в этом отношении надо гово рить лишь о нашем вступлении в этот удивительный и загадоч: ный мир. Если вы стремитесь найти новый белок, прослеживая его роль по определенной биологической функции, то сейчас все чаще и чаще вам приходится встречаться с белками новых ти пов, меняющими наши традиционные представления о свойствах белка и принципах проявления его активности. Это и мембран ные белки, существующие и действующие в неполярных средах, и белки рецепторных систем, способные к скачкообразному изменению своей пространственной структуры и, наконец, ог ромные по размеру белки-ансамбли, с молекулярным весом, достигающим многих сотен тысяч. Все это ставит перед исследователем сложнейшие проблемы, заставляет его посто янно обновлять свой методический арсенал, а колоссальные темпы развития современной науки и стремительный прогресс в изучении живой материи обязывают его находить и идентифи цировать эти белки точно и в кратчайшие сроки, отводя не так уж много времени для полного распознания всех уровней струк турной организации белка. Это естественно, поскольку настоя щее изучение белка, подступ к пониманию его функционирова ния, начинается лишь тогда, когда структура белка уже расшиф рована.
Современная обстановка в химико-биологическом изучении пептидов и белков постоянно диктует необходимость разработки новых методов их анализа и предполагает филигранное владе ние всеми существующими методами.
■ Можно с удовлетворением констатировать, что эта область развивается в настоящее время весьма интенсивно, и каждый
6 ПРЕДИСЛОВИЕ
месяц приносит что-либо новое. Исследователю трудно следить за каждым новым достижением в методологии или методике ана лиза белков, поскольку он вынужден просматривать огромную оригинальную литературу, разбросанную в журналах биологи ческого, химического и даже технического профиля. В этой связи чрезвычайно возрастает роль оперативных обзоров по этой про блеме, и, естественно, хороших монографий, обобщающих суще
ствующий опыт.
Книгу «Новые методы анализа аминокислот, пептидов и бел ков», написанную рядом авторов под общей редакцией извест ных специалистов в области химии белка А. Нидервайзера и Г. Патаки, можно отнести к числу наиболее удачных методиче ских пособий по исследованию пептидов и белков, поскольку она хорошо отражает современный уровень и тенденции в рассмат риваемой области. Изложенный в книге материал касается как традиционных, классических, методов анализа, так и ряда но-, вых приемов, широко используемых в последних работах по структуре белков.
В книге достаточно детально рассмотрены основные преиму щества и недостатки классического метода определения амино кислотного состава белков с помощью ионообменной хромато графии по Муру и Стейну; даны указания относительно выбора ионообменников, подготовки реактивов и численной интерпрета ции результатов. Значительное место также уделено изложению принципов анализа аминокислот методом газожидкостной хро матографии. Применение этого метода, обладающего на 2—3 по рядка большей чувствительностью по сравнению с нингидринной реакцией по Муру и Стейну, позволяет значительно снизить ко личества белка, требуемые для определения его состава. Анализ аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии пока еще не находит широкого применения, однако имеющиеся в ли тературе данные позволяют считать этот метод весьма перспек тивным. Кроме того, обсуждаются возможности использования газожидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектромет- рией для определения состава и аминокислотной последователь ности в пептидах.
Самого пристального внимания заслуживает обзор, посвя щенный масс-спектрометрическому методу определения амино кислотной последовательности пептидов. Этот метод, в разра ботку которого значительный вклад внесли советские ученые, в настоящее время находит все большее применение при изучении структуры пептидов и белков.
Большим достоинством обзора, написанного крупнейшими специалистами в области масс-опектрометрии — Э. Ледерером и Б. Дасом, является тот факт, что наряду с данными о поведении аминокислот и пептидов в условиях масс-спектрометрирования
ПРЕДИСЛОВИЕ |
7 |
авторы приводят практические примеры масс-спектрометриче- ского анализа структуры природных пептидов, а также дают критическую оценку границ возможностей этого метода.
Значительная часть книги отведена описанию современных методов выделения и очистки белков с помощью электрофореза и гель-фильтрации. Следует отметить, что получение индивиду альных белков в высокоочищенном состоянии является необхо димым условием любых структурных исследований. Поэтому разделы, посвященные теории и практике гель-фильтрации на колонках и в тонком слое, несомненно, окажутся полезными для широкого круга научных работников, так или иначе связан ных с проблемой выделения чистых белков. Особый интерес представляет также весьма подробное описание метода очистки белков с помощью изоэлектрического фокусирования. Этот ме тод, ставший известным сравнительно недавно, позволяет до стичь значительных успехов в разделении сложных смесей бел ков и день ото дня становится все более популярным.
Хорошим дополнением к описанию препаративных способов очистки белков служит раздел, касающийся повышения чувстви тельности диск-электрофореза в полиакриламидном геле, по скольку этот метод является общепринятым для оценки чистоты белков. Анализ функциональных групп в белках является пере ходной ступенью от расшифровки последовательности амино кислот в полипептидной цепи к выяснению трехмерной конфи гурации белковой молекулы. Избирательная химическая моди фикация функциональных групп позволяет точно локализовать их положение в белковой молекуле и сделать важные выводы относительно расположения в пространстве отдельных участков полипептидной цепи белка. Предпоследняя глава книги, содер жащая описание методик химической модификации и применяе мых для этой цели реагентов, является как бы введением к следующей, заключительной главе, посвященной собственно изу чению пространственной структуры белков. Здесь авторы кратко знакомят читателя с современным арсеналом химических и фи зико-химических методов исследования четвертичной структуры белков.
В целом в книге привлекает стройность изложения мате риала: начиная с азов белковой химии — анализа аминокислот ного состава белка, — авторы постепенно раскрывают перед чи тателем весь круг современных проблем исследования белков на все более высоких уровнях структурной организации.
Мы выражаем надежду, что настоящая книга окажет несом ненную помощь тем, кто посвятил себя этой области знаний, и
будет способствовать новым успехам отечественной науки в по знании белков.
Ю. Овчинников
ИЗ ПРЕДИСЛОВИЯ К АНГЛИЙСКОМУ ИЗДАНИЮ
Резкая интенсификация научной деятельности за последние десятилетия вынуждает исследователя отказаться от чтения множества узкоспециальных публикаций и большую часть ин формации получать из заслуживающих доверия обзоров. Эта ситуация наблюдается и в области анализа аминокислот, пеп тидов и белков, где каждые пять лет появляются новые эффек тивные методы, способные заменить уже существующие. Напри мер, в настоящее время газожидкостная хроматография успешно конкурирует с автоматической ионообменной хромато графией аминокислот по Муру и Стейну, которая полностью заменила микробиологический анализ, хроматографию на бу маге и другие методы количественного анализа, существовавшие до 1958 г. Определение последовательности пептидов—трудо емкая задача при использовании обычных методов — произво дится на данном этапе автоматически на секвенсере Эдмана, а последовательность небольших пептидов удобно определять с помощью масс-спектрометрии.
В рамках однотомного издания невозможно исчерпывающе изложить все новое, что возникло за последние годы в области белков, поэтому в сборник включены избранные разделы, кото рые, следует полагать, представляют интерес для всех, кто ра ботает в этой обширной области. Все главы написаны специа листами, способными обобщить и объективно оценить текущие исследования.
Мы уверены в том, что предлагаемый сборник окажется по лезным, а затраченный труд оправданным.
А. Нидервайзер Г. Патаки
ГЛАВА 1
Хроматографический анализ аминокислот и пептидов на сферических смолах
иего применение в биохимии
имедицине
Дж. В. Бенсон мл., Дж. А. Патерсон
Обширные исследования в области хроматографии на ионо обменных смолах, которая, по-видимому, все еще находится в стадии бурного развития, основываются на ставших уже класси ческими работах Мура и Стейна. Серия основополагающих ста тей [1—13], вышедших в свет в 1949-м и последующих годах, способствовала появлению такого количества новинок и усовер шенствований в хроматографической технике, что любая попытка охватить их все далеко превзошла бы рамки этой статьи. Из вестно много прекрасных обзоров [14—25] и монографий [26— 30], освещающих историю, теорию, методы и применение ами нокислотного анализа.
Настоящая глава преднамеренно ограничена обсуждением тех систем и методик, которые в настоящее время не только отвечают современному уровню, но и наиболее широко исполь зуются. Она содержит описание различных приемов, пользуясь которыми, можно достичь желаемых результатов в случае спе цифических анализов. «Играя» несколькими из этих приемов одновременно, можно получить новые и единственные в своем роде результаты, необходимые для решения тех или иных кон кретных задач.
Методики специфических анализов описаны очень подробно, для того чтобы читатель мог приступить к сбору данных, не те ряя времени на подборку условий анализа. Несмотря на то что
влитературе опубликовано большое число методик анализа, здесь приведены только те, которые чаще всего использовались
влаборатории авторов и были признаны наиболее удовлетво рительными.
1.1.ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА
Ионообменная хроматография на колонках использовалась в многочисленных и разнообразных исследованиях для по лучения основной биохимической информации, а также как