12 Диссертация Смолянова

31

также возможность одновременного исследования большего количества образцов по сравнению с РВН с использованием животных.

Данный метод позволяет уйти от использования животных, что помимо биоэтического аспекта позволяет улучшить воспроизводимость метода, особенно при использовании перевиваемых клеточных культур.

Однако применение данного метода ограничено наличием чувствительных клеточных культур для модельного эксперимента. То есть необходимо установить наличие перевиваемой клеточной культуры, действие патогена на которую приводит к стабильному и значительному повреждению или гибели клеток. В РВН на клеточных моделях вирулентность вируса в клетках ограничивается механизмом, представленным в выбранной для испытания культуре клеток, и

также как в РВН на животных исследуется только патоген нейтрализующее действие антител.

Рисунок 1.4 – Принцип действия при постановке реакции вируснейтрализации на культуре клеток [119]

Поскольку работа ведётся с вирулентным штаммом вируса, эти исследования выполняются в лабораториях, отвечающих требованиям безопасности работ с патогенными биологическими объектами [120].

Также использование РВН на культуре клеток является достаточно трудоемким и сложным методом, сложно поддающимся валидации и являющимся скорее полуколичественным. Кроме того, стоимость выполнения данного тестирования крайне высока.

Несмотря на отмеченные ограничения, традиционные методы титрования остаются

«золотым стандартом» определения ВНА, поскольку наиболее точно моделируют естественный процесс нейтрализации вируса антителами.

32

1.4.5. Определение уровня специфической активности в реакции торможения

гемагглютинации

В основе РТГА лежит способность эритроцитов склеиваться под влиянием на них определенных антигенов определенных вирусов. РТГА основана на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител [121].

При проведении РТГА в зависимости от типа вируса используют эритроциты кур,

кроликов, человека или морской свинки. Перед постановкой опыта эритроциты отмывают физиологическим раствором. Титром антител считают их последнее разведение, при котором наблюдается полное торможение агглютинации эритроцитов. Значения, выраженные в условных единицах, требуется одновременной постановки опыта с использованием контрольных образцов,

содержащих антитела [121, 122].

Данный метод также не требует использования животных, что помимо биоэтического аспекта позволяет улучшить воспроизводимость метода.

Однако применение данного метода ограничено наличием гемагглютинирующего действия вируса, то есть действия патогена, которое приводит к значительному повреждению эритроцитов.

Поскольку работа ведётся с вирулентным штаммом вируса, эти исследования выполняются в лабораториях, отвечающих требованиям безопасности работ с патогенными биологическими объектами.

1.4.6. Иммуноферментный метод

При качественном и количественном определении биологически активных веществ в медицинских иммунобиологических препаратах в качестве одного из высокочувствительных методов лабораторной диагностики применяется метод ИФА. Этот метод характеризуется высокой скоростью проведения и простотой исполнения процедур по сравнению с другими иммунохимическими методами, такими методами как иммуноблоттинг и иммунофлуоресценция in situ, а также высокой чувствительностью и специфичностью; в отличие от методов радиоиммунологического анализа (РИА) в данном методе не применяются опасные для здоровья реактивы.

Принцип ИФА заключается в реакции специфического взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса и последующей детекции полученного комплекса с помощью спектрофотометрии, хемилюминесценции и других адекватных методик.

Детекция может быть как прямой (когда исследуемое вещество само обладает ферментативной активностью, либо оно помечено ферментной меткой), так и косвенной или непрямой (когда исследуемое вещество, связавшееся с иммобилизованными на твердой фазе антителами,

инкубируется с антителами, меченными ферментом) [123].

33

Метод ИФА включает 3 основных этапа: 1) образование иммунного комплекса «антиген

(исследуемое вещество) – специфическое к нему антитело» или наоборот; 2) формирование связи конъюгата с образовавшимся на предыдущем этапе иммунным комплексом или со свободными местами связывания (детерминантами); 3) преобразование субстрата под действием ферментной метки в регистрируемый сигнал в результате биохимической реакции [123].

Метод ИФА является высокочувствительным и высокоспецифичным иммунодиагностическим методом, с помощью которого проводят качественное,

полуколичественное и количественное определение различных веществ, обладающих свойствами антигена или антитела.

Качественный анализ позволяет получить информацию о содержании антигена или антитела в исследуемом материале по принципу «есть/нет». При проведении количественного анализа определяют концентрацию антигена или антитела в исследуемом материале с использованием калибровочного графика [124].

ИФА является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимической реакции сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации, возможность создания каскадных систем усиления различных химических сигналов, относительно низкая цена и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, сельское хозяйство, микробиологическую и пищевую промышленность, охрану окружающей среды, а также в научные исследования.

Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких минут. Исторически первым среди них был РИА, предложенный в конце 50-х годов прошлого

века. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). В

середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов.

Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны

34

эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом,

так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании полистирольных планшетов для иммобилизации антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов.

На поверхности молекулы сложного антигена можно выявить функциональные группы или остатки, обуславливающие антигенную специфичность, называемые антигенными детерминантами или эпитопами. Число эпитопов на поверхности сложной молекулы определяет валентность антигена. Понятие «антигенная детерминанта» включает в себя последовательность образующих ее химических функциональных групп и их пространственное расположение. В

молекулах белков антигенная детерминанта образуется совокупностью аминокислотных остатков (может варьировать от 5 до 20). Антигенные детериминанты белков бывают двух типов

– линейные, т.е. представляющие собой последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, и конформационные, образованные аминокислотными остатками из различных частей белковой глобулы. Во многих случаях единичная замена аминокислоты в структуре антигенной детерминанты или изменение конформации белковой глобулы являются достаточными для изменений антигенной специфичности макромолекулы. Если два антигена имеют только часть одинаковых антигенных детерминант, их называют перекрестно реагирующими антигенами [125].

Различают несколько десятков модификаций ИФА. В зависимости от того, какие компоненты присутствуют в реакционной смеси, выделяются два типа методов ИФА:

неконкурентный ИФА, который включает только анализируемое соединение и соответствующие ему антитела, и конкурентный ИФА, который наряду с прочими компонентами содержит аналог анализируемого соединения, конкурирующий с ним за так называемые места специфического связывания.

Наиболее распространенные варианты неконкурентного ИФА (Рис. 1.5):

1. Прямой ИФА. На первом этапе реакции исследуемый образец фиксируют на твердой фазе. Затем к нему добавляют конъюгат. После удаления непрореагировавших компонентов реакции проводится ферментативная реакция, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию исследуемых антигенов в образце и вообще говорит об их наличии в исследуемом материале.

35

2.Непрямой ИФА. На твердой фазе иммобилизуют антиген, после инкубации исследуемого материала и удаления несвязавшихся компонентов добавляют меченые ферментом антитела к иммуноглобулинам человека класса IgG, которые взаимодействуют с Fc-фрагментом

кIgG. После проведения субстрат-ферментативной реакции проводят учет полученных результатов. При наличии антител уровень оптической плотности прошедшей реакции превосходит показатели отрицательных образцов. Этот метод применяется для определения антител к вирусу гепатита С.

3.“Сэндвич”-метод (Sandwich). Общая схема проведения метода заключается в следующем. На твердой фазе адсорбированы антитела к исследуемому антигену. После инкубации исследуемого материала и образования комплекса «антитело — антиген» проводится удаление несвязавшихся компонентов, добавляется конъюгат, т.е. антитела к искомому антигену,

меченые ферментом. По завершении инкубации, с последующим удалением непрореагировавшего коньюгата промывкой, образуется комплекс, в котором антиген как бы заключен между двумя слоями антител. Наличие меченных ферментом антител определяется при помощи соответствующего субстрата. “Сэндвич”-метод используется для выявления HBsAg, HBeAg, антигена вируса гепатита А.

4. Конкурентные твердофазные методы обладают меньшей чувствительностью по сравнению с неконкурентными. Предел обнаружения различных соединений для них ограничен как чувствительностью регистрации ферментной метки, так и аффинностью антител, в то время,

как для неконкурентных методов, при отсутствии неспецифических взаимодействий, только чувствительностью определения фермента. Поэтому для достижения высокой чувствительности анализа конкурентным методом необходимо использовать высокоаффинные антитела.

Рисунок 1.5 – Схематическое изображение модификаций иммуноферментного анализа

36

ИФА по сравнению с другими методами детекции антител обладает следующими преимуществами:

-высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05 нг/мл.

Такая чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента

катализировать превращение большого числа молекул субстрата;

-возможностью использовать минимальные объемы исследуемого материала;

-стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более);

-простотой проведения реакции;

-наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так

ивизуального учета;

-возможностью автоматизации всех этапов реакции;

-относительно низкой стоимостью диагностических наборов;

-возможностью валидации.

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства,

микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Метод ИФА широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний человека и животных и может также применяться для подтверждения качества иммунобиологических ЛП.

Благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности, ИФА перешел в разряд стандартных, «рутинных» анализов.

По своей сути метод ИФА не является альтернативой РВН, так как при постановке ИФА мы лишь определяем количество антител, а не их нейтрализующее свойство. Однако, при условии, что осуществляется детекция только нейтрализующих антител в системе ИФА, это может служить более простой и воспроизводимой заменой РВН

ЕФ и ГФ РФ устанавливает различные требования к препаратам СИГ и определяет различные методы оценки специфической активности: определение титра в реакции торможения гемагглютинации, реакции нейтрализации на культуре клеток или в животных, реакции нейтрализации гемолитических свойств или в реакции пассивной гемагглютинации. Также для оценки специфической активности применим метод ИФА [106, 107].

Анализ зарубежного опыта определения специфической активности для препаратов иммуноглобулинов показал более частое использование иммунологических методов и уход от

37

использования животных моделей, что обосновывается современными требованиями к возможности валидации методов анализа [111, 126-131].

a.Валидация количественного иммуноферментного анализа

Основная цель валидации аналитической методики - гарантия, что выбранная аналитическая методика будет давать воспроизводимые и достоверные результаты,

соответствующие поставленной цели [132, 133].

Валидация методики является важной частью системы обеспечения и контроля качества ЛП. Валидация сама по себе не улучшает качества продукции, ее результаты могут либо повысить степень гарантии качества, либо указать на необходимость совершенствования условий производства, в частности, аналитических методов исследований. Одним из наиболее сложных разделов валидации фармацевтического производства является валидация аналитических методов.

Согласно ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» в зависимости от класса аналитических методов рекомендуется конкретный перечень оценки валидационных параметров. Так для количественных методов определения действующего вещества определены следующие параметры валидации: специфичность, аналитическая область, линейность,

правильность и прецизионность (повторяемость (сходимость) и промежуточная

(внутрилабораторная) прецизионность) [132].

Специфичность - доказательство отсутствия взаимодействия с близкими по структуре антигенами по результатам изучения перекрестных реакций. В коммерческих наборах специфичность каждого метода определена и, как правило, представлен перечень интерферирующих веществ. Для работы в лаборатории следует использовать наборы с высокой специфичностью. Специфичность исследуется для перекрестно-реагирующих соединений в разведениях, выполненных с 10кратным шагом (от 10 до 1000 раз), позволяющими оценить 100, 10, 1,0 и 0,1 %-ю перекрестность [133].

Аналитическая область - интервал данного аналитического метода, который обеспечивает точность, правильность и линейность при определении образцов, содержащих аналит на границах интервала и внутри его. Для определения примесей интервал изучается от концентрации, в которой примесь обычно обнаруживается и до 120 % от нормируемого содержания [133].

Линейность - доказательство того, что результаты теста сразу или после определенной математической обработки пропорциональны концентрации аналита в образце в пределах данного интервала, установленного для данного метода по коэффициенту корреляции,

пересечению с осью Y, наклону регрессионной линии и остаточной сумме отклонении при условии, что данные обнаруживают признак линейности. Для исследования линейности

38

значений калибровочного графика анализируются 4 или более образца, от трех до шести повторностей. Производится расчет линии регрессии методом наименьших квадратов для результатов с различными концентрациями аналита, от 50 до 150 % от планируемых [133].

Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений,

выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное. Для оценки правильности результаты 15-20 измерений физической величины в одной и той же пробе усредняются, и среднее арифметическое значение сравнивается с истинным. Разность между этими величинами называется «постоянным сдвигом» или смещением [132].

Анализ на оценку сходимости (повторяемости) выполняется в одной лаборатории одним оператором на одном оборудовании за относительно короткий промежуток времени. По крайней мере проводится 5-6 определений, используются три различных матрикса при трех различных концентрациях, и рассчитывается относительное среднеквадратичное отклонение. Критерием для сходимости является коэффициент вариации, значения которого для биоаналитических методов должны быть не более 15 % для каждого концентрационного уровня (за исключением нижнего предела количественного определения - не более 20 %) [132].

Для определения промежуточной прецизионности используют следующие условия анализа: CDER, АОАС - как минимум 2 отдельных случая; EURACHEM - 10 независимых повторностей; АОАС - 5 пар значений, полученных по крайней мере двумя репликатами для каждой партии анализа.

Для оценки каждого из этих параметров выбирается соответствующий метод, заранее фиксируемый в протоколе валидации. Результаты проведенных работ статистически обрабатываются согласно принятым критериям, например, в руководстве по валидации методик анализа ЛП подробно описаны критерии проведения валидации для методик количественного анализа, а также научные рекомендации по оценке результатов валидации [132-136].

Единый алгоритм валидации биологических методик в РФ отсутствует, необходимо руководствоваться общими рекомендациями в соответствии с ОФС «Валидация аналитических методов» ГФ РФ и НПА ЕАЭС [132, 133] и учитывать особенности методики и объекта приложения методики [133136].

На сегодняшний день компьютерные технологии все шире находят свое применение в технологии производства фармацевтической продукции. Согласно Европейской (2004) и

Британской (2000) фармакопеям для статистической обработки результатов количественного ИФА, выражения активности биологических и фармацевтических препаратов рекомендуется применять метод параллельных линий, для этих целей существует компьютерная программа

«Analysis of Parallel-Line Assays» [137]. Его отечественным аналогом является компьютерная

39

программа «Паралайн», разработанная главным метрологом ГИСК им. Л.А. Тарасевича доктором биологических наук В.Г. Петуховым.

b.Анализ наличия стандартных образцов для оценки уровня антител,

специфичных к вирусу SARS-CoV-2

Согласно ФЗ N 61 «Об обращении ЛП» от 12.04.2010 г. под стандартными образцами (СО)

подразумевают вещества, посредством сравнения с которыми осуществляется контроль качества исследуемых ЛП с помощью физико-химических и биологических методов в целях подтверждения соответствия ЛП требованиям нормативной документации, установленным при осуществлении государственной регистрации, и которые применяются для калибровки стандартных образцов предприятия производителя (СОП) ЛП, используемых для контроля качества и иных целей при обращении ЛП [69].

В силу присущей биологическим системам вариабельности, а также вариабельности,

связанной с приборами, реактивами, проведением испытаний в разные дни, разными исполнителями, в разных лабораториях, СО приобретают особенно важное значение, прежде всего при определении активности, поскольку определение относительно СО обеспечивают объективную возможность сравнения результатов различных лабораторий. Кроме того,

абсолютное значение биологической активности – величина менее постоянная, чем результат определения активности по сравнению с СО [136]. В области производства и контроля качества иммунобиологических ЛП из-за отсутствия эталонов СО вместе с соответствующими методиками испытаний являются единственным средством передачи единиц измерений [138].

Международные СО ВОЗ как правило, готовятся в ограниченном количестве, кроме того,

их номенклатура также ограничена, и для определенных показателей и препаратов они отсутствуют. Поэтому принято использовать имеющиеся стандартные образцы ВОЗ,

Европейской и Британской фармакопей при разработке и аттестации отечественных отраслевых стандартных образцов или стандартных образцов предприятия [136].

В случае отсутствия отраслевых или международных СО разработка стандартных образцов должна стать задачей предприятия [138].

Основными аттестуемыми характеристиками таких СО являются специфическая активность, содержание антител, титр или концентрация бактерий, вирусов, активного или иного компонента [139, 140]. Значение аттестуемой характеристики устанавливают с применением живых бактерий, вирусов, клеток животных, самих живых организмов или с применением иммунохимических или серологических методов, предусматривающих применение специфических биологических материалов. Использование биологических материалов, трудно

40

поддающихся стандартизации, значительно увеличивает неопределенность аттестуемой характеристики и затрудняет описание измеряемой величины [141].

Таким образом, главной особенностью ИЛП является трудность описания измеряемой величины. К ним относятся не только такие показатели, как минимальная иммунизирующая доза

(МИД50); разведение вакцины, защищающее 50% животных (LD50); эффективная доза (ЭД);

тканевая цитопатогенная инфекционная доза (ТЦИД50) и т.п., но и показатели, определяющие концентрацию антигенов, антител и даже белка, углеводов или липидов [142].

Соответственно, основной особенностью аттестации СО ИЛП является отсутствие норм точности используемых методик. В связи с этим, актуальным является установление норм точности (правильности и воспроизводимости) используемых методик измерений и,

соответственно, вопрос согласованности результатов. Поэтому вопрос валидации методики определения очень тесно сопряжен с процессом выбора, аттестации и применения СО [143].

Определение активности или концентрации действующего вещества – важный аспект разработки любого ЛП. Разработка, производство и контроль качества ЛС, в том числе биологических, должны соответствовать специальным требованиям, которые определяются рекомендациями ВОЗ, а также требованиям надлежащих практик (GMP, GLP, GPhP и т.п.),

принятых на международном, межрегиональном или национальном уровнях. В Российской Федерации контроль ЛС осуществляется в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи (ГФ) или по методикам, изложенным в нормативной документации на ЛП, т.е.

согласно фармакопейным методам с использованием СО [144,145].

Стандартные процедуры по созданию СО биологических ЛП включают основные этапы,

предусмотренные в системе нормативно-методических документов по государственным СО

(ГСО):

•разработка технического задания для новых СО, программы аттестации для новых серий СО/продление срока годности текущих серий СО;

•проведение экспериментальных работ по изготовлению и аттестации СО, исследованию

имониторингу стабильности СО;

•оформление отчета о разработке/аттестации СО с включением всех первичных данных,

разработка документов на СО (паспорт, макеты этикеток, а также инструкции по применению СО);

•проведение экспертизы материалов по разработке и аттестации СО;

•утверждение и регистрация СО [144,146].

Так как разработка ЛП ИГЧ против COVID-19 проводилась одновременно с разработкой подобных ЛП другими мировыми производителями, отсутствовали отраслевые или международные СО по показателю специфической активности [147-148]. Также отсутствовали