4 курс / Акушерство и гинекология / Ботвиньева_И_А_Иммунорегуляторные_белки_и_цитокины_при_беременности

31

теплового шока, находящийся на наружной мембране). Критериями диагностики активной формы хламидийной инфекции является совместное обнаружение антител класса G к рекомбинантным белкам МОМР и плазмидному каркасному антигену — pgp3. Критериями диагностики персистентной формы хламидийной инфекции является обнаружение антител класса G в сыворотке крови к рекомбинантному белку теплового шока – HSP60 (Михнина Е.А., 2012).

1.3.Роль белковых компонентов врожденного иммунитета

впатогенной инвазии

Контакт патогена с клетками системы врожденного иммунитета (моноцитами/макрофагами, нейтрофилами, эозинофилами и эпителиальными клетками), имеющими PAMP-распознающие рецепторы на своей поверхности является ключевым моментом в реализации первой линии иммунной защиты (Ярилин А.А., 2010). Однако, помимо клеточного врожденного иммунитета, существуют белковые компоненты врожденного иммунитета, воздействующие непосредственно или опосредованно на патоген, либо путем его маркирования и презентации иммунокомпетентным клеткам. Большую роль в реализации этого механизма врожденного иммунитета у человека играют альфа-2-макроглобулин (а2-МГ) и лактоферрин (ЛФ).

Данные белки различаются по структуре, молекулярной массе, происхождению, но имеют ряд общих лигандов, сходный механизм фиксации, включающий изоляцию лиганда от внешних воздействий через конформационную трансформацию (Baker E.N., Baker H.M. 2005), а также сродство к основному рецептору эндоцитоза (CD91/low-density lipoprotein receptor-related protein или ЛРП-рецептор) (Suzuki Y.A., et al., 2005, Dolmer K., Gettins P.G., 2006; French R., et al., 2008). Оба белка относятся к металлопротеинам, являются белками-

32

транспортерами и играют существенную роль не только в первичной защите организма от патогенной инвазии, но и в развитии воспаления при распространении инфекции, если первичная защита была не эффективна (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Альфа-2-макроглобулин (а2-МГ) относится к высокомолекулярным гликопротеинам (720 кДа) и состоит из четырех субъединиц (Petersen C.M., 1993). Каждая субъединица имеет три центра связывания: гидрофобный центр, связывающий липиды, ферменты, нуклеотиды и крупные протеогликаны; тиоэфир, локализованный внутри молекулы (Doan N, Gettins P.G., 2007, 2008) и связывающий гидролазы; а также ионы цинка, образующие металл-хелатные взаимосвязи. А2-МГ синтезируется преимущественно клетками печени, а также в небольших количествах локально клетками различных типов. Средняя концентрация в крови у взрослого человека колеблется в пределах 2-3 г/л, в меньших концентрациях обнаруживается в синовиальной и спинномозговой жидкостях, лимфе, семинальной плазме, слюне и моче (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Лактоферрин (ЛФ) также является гликопротеином (80 кДа), структурным гомологом трансферрина (Baker E.N. et al., 2005, Legrand D., et al., 2005) и состоит из 2

доменов, каждый из которых может связывать по иону металла. Кроме железа, ЛФ связывает ионы цинка, меди, ванадия, магния, алюминия, цезия, кобальта и др. Считается, что гликозилирование защищает молекулу ЛФ от протеолиза (Baker E.N. et al., 2005), но может влиять и на взаимодействие с патогенами. Наибольшие концентрации ЛФ определяются в молозиве (7 г/л) и молоке (1 г/л), меньшие - в слюне, слезе, семинальных, муказальных и других секретах, а в крови здоровых лиц его концентрация не превышает уровень 0,1-2,0 мг/л (Baker E.N. et al., 2005, Legrand D., et al., 2005). Синтезируется ЛФ клетками эпителия,

а также нейтрофилами при клеточной дифференциации, затем депонируется в гранулах и высвобождается только при активации клеток (Legrand D., et al., 2005).

33

Как а2-МГ так и ЛФ имеет высокое сродство к ЛРП-рецептору эндоцитоза

(Suzuki Y.A., et al., 2005, Legrand D., et al., 2005, Dolmer K., Gettins P.G., 2006, French R., et al., 2008) и даже может конкурировать за связывание с ним. Данный рецептор локализован в мембранах на поверхности клеток, а также на мембранах их внутренних органелл (Suzuki Y.A., et al., 2005, Dolmer K., Gettins P.G., 2006).

Взаимодействие с ЛРП позволяет а2-МГ и ЛФ осуществлять модуляторное воздействие на клетки, а направленность и выраженность этих реакций зависит не только от количества ЛРП на поверхности клеток, но конформационного состояния а2-МГ и ЛФ, а также от свойств, транспортируемых данными белками биоактивных веществ (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Слизистые оболочки и кожа являются основными объектами бактериальной инвазии в организме человека, однако содержание а2-МГ в них ограничено. В небольших количествах белок поступает из циркуляции, эпителиальные и иммунокомпетентные клетки могут синтезировать а2-МГ, но в очень ограниченных концентрациях. И напротив, лактоферрин синтезируется преимущественно эпителиальными клетками и присутствует в достаточном количестве во всех секретах и на слизистых (Legrand D., et al., 2005).

Способность ингибировать ферменты-гидролазы бактерий и является основным защитным механизмом а2-МГ (Budd A., et al., 2004, French R., et al., 2008, Franke G.C., et. al., 2010). Бактериальные гидролазы успешно атакуют клетки организма хозяина только в условиях локального дефицита их ингибиторов, в первую очередь серпинов и а2-МГ (Franciosa G., et. al., 2009). Связавшись с бактериальной протеиназой, а2-МГ быстро выводится из циркуляции через ЛРП рецептор (Scharfstein J. 2006), и далее может либо расщепляться в лизосомах (Armstrong P.B., 2006), либо депонироваться в эндосомах (Smith D.C., et. al. 2006) либо, в

виде отдельных фрагментов, транспортироваться к ядру клетки (Carter C.J., 2010), либо презентироваться на поверхности иммунокомпетентных клеток (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013). Установлено, что а2-МГ является транспортером антигенов

34

бактерий в дендритные клетки, а презентация бактериальных антигенов лимфоцитам активирует адаптивный специфический иммунный ответ по Th-1 или Th-2 типу (Bowers E.V., et. al., 2009). Известно, что образование комплексов бактериальных антигенов с а2-МГ усиливает антителогенез более чем в 1000 раз (Huson L.E., et. al., 2009), а комплексы белка с бактериальными гидролазами активируют мононуклеары (Bowers E.V., et. al., 2009). Кроме того, молекулы а2-МГ могут связываться с продуктами оксидативного стресса и белками теплового шока, удаляя дефектные молекулы из циркуляции через ЛРП (French R., et al., 2008).

Помимо взаимодействия с ЛРП, комплекс а2-МГ - бактериальная гидролаза может присоединяться к сигнальному клеточному рецептору (глюкозо-регулирующий протеин, grp78, маннозный рецептор или Fc-рецептор

(Gonzalez-Gronow M., et. al, 2009) и индуцировать каскад реакций фосфорилирования. Это приводит к экспрессии дополнительных сигнальных рецепторов и усилению интенсивности сигнала, угнетению апоптоза клеток на уровне блокирования генов пре-каспаз, активации секреции гидролаз в клеткахмишенях, выбросу провоспалительных цитокинов, обеспечению реакции митоза клеток-мишеней при достижении сигналом их ядра, а также к активации экспрессии рецепторов эндоцитоза, способствующих распознаванию транспортируемых а2-МГ компонентов патогена (Birkenmeier G., 2001, GonzalezGronow M., et. al, 2009).

Защитная функция а2-МГ обусловлена также его способностью транспортировать цитокины. Синтез белка взаимосвязан с синтезом транспортируемых им IL-6 и трансформирующего фактора роста 1β (TGF-1β), оказывающими в свою очередь влияние на синтез негативных и позитивных реактантов острой фазы воспаления (плазминоген, альбумин, трансферин, либо IL-1β, TNF-α, IL-8, фибриноген, С-реактивный протеин, гаптоглобин, ЛФ,

35

орозомукоид и т.д.) направленных на развитие воспалительного ответа и нейтрализацию инфекции даже после инвазии (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Вышеперечисленные механизмы позволяют эффективно блокировать инвазию, либо вовремя активировать специфический иммунный ответ и воспалительную реакцию. Однако ряд патогенов в процессе эволюции выработал защитные механизмы. Синтезируемые бактериями эндотоксины могут связываться с а2-МГ, изменяя его конформацию, что позволяет проникать через ЛРП-рецептор в клетки и повреждать их (Smith D.C., et. al. 2006, Franke G.C., et. al., 2010). Несовершенство механизма нейтрализации эндотоксинов столь универсальным фактором защиты как а2-МГ объясняет их чрезвычайную токсичность и опасность для заражаемого организма. Кроме того, относительно недавно в бактериях обнаружены тиоэфирсодержащие гомологи а2-МГ, возникшие от единого древнего предшественника, которые также могут способствовать инвазии и «колонизации», путем доставки факторов роста и других соединений, необходимых для жизнедеятельности бактерий, через рецепторы эндоцитоза (Budd A., et al., 2004; Armstrong P.B., 2006, Doan N, Gettins P.G., 2008, Kantyka T., et. al., 2010).

Необходимо учитывать, что некоторые ферменты патогенов способны лизировать молекулы а2-МГ организма-хозяина, что приводит к наращиванию общего гидролазного потенциала среды, поскольку домен CUB этого белка содержит две интегрированных в него гидролазы. Интегрированный там же эмбриональный фактор роста также может косвенно способствовать распространению заболевания (Doan N, Gettins P.G., 2007). Помимо а2-МГ, мишенью бактериальных гидролаз бактерий являются неактивные предшественники ферментов, такие как протромбин, прекаликреины и плазминоген, причем последний, связываясь после активации с а2-МГ, косвенно способствует инвазии патогена за счет быстрого выведения комплекса МГплазминоген из циркуляции и последующего обеднения локального пула а2-МГ

36

(Franciosa G., et. al., 2009). Кроме того, бактерии защищаются от а2-МГ чисто механически, синтезируя гилауроновую кислоту как Stafilococcus piogenes,

маскируя эпитопы (GRAB или Protein G-related alpha2M-binding protein),

распознаваемые а2-МГ (Dinkla K., et. al., 2007).

Лактоферрин - в отличие от а2-МГ, несмотря на меньшие размеры и отсутствие способности влиять на гидролазы патогена, имеет целый ряд других способов воздействия, что делает его даже более эффективным против большинства известных бактерий и вирусов (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Прежде всего, данный белок блокирует жизнедеятельность бактерий путем простого связывания железа в их микроокружении. Высокое сродство к ионам металлов и подвижность молекулы, закрывающей металл от внешних воздействий после связывания, эффективно снижает инвазию, хотя и не блокирует ее полностью (Berlutti F., et al. 2011). ЛФ также связывается с липополисахаридами (ЛПС) бактерии, блокируя проникновение эндотоксинов в клетку (Legrand D., et al., 2005). Помимо этого, высокозаряженный участок молекулы ЛФ взаимодействует с мембраной грамположительных бактерий при помощи электростатических и гидрофобных связей и активно повреждает ее. Кроме того, ЛФ вызывает осмотический шок у грамотрицательных бактерий, связывая ионы кальция через мембранные порины бактерий, а также обладает протеолитической активностью против ряда бактерий и влияет на их агрегацию

(Legrand D., et al., 2005, Berlutti F., et al. 2011). ЛФ ингибирует процесс проникновения бактерии внутрь клетки и активно подавляет жизненный цикл целого ряда патогенных вирусов (особенно эффективен на внеклеточном этапе), эффективен также против грибковой инфекции и паразитарной инвазии (Puddu P., et al., 2011). Показано, что ЛФ может напрямую взаимодействовать с ядром клетки и активировать ее транскрипцию (Legrand D., et al., 2005, Berlutti F., et al. 2011). При массированном выбросе протеиназ часть лактоферрина может разрушаться, однако образующиеся при этом пептиды (лактоферрицин и пр.)

37

еще более эффективны против ряда бактерий (Streptococcus pneumoniae и других), чем нативный ЛФ (Mirza S., et al., 2011). Установлено, что ЛФ активно участвует в реализации такого защитного механизма как «кислородный взрыв» - провоцируя выброс NO-, продукцию супероксидов (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Являясь компонентом врожденного иммунитета, ЛФ способен, прямо или опосредовано, оказывать воздействие на адаптивный иммунный ответ, регулируя пролиферацию, дифференциацию и активацию иммунокомпетентных клеток (Legrand D., et al., 2005). Показано, что лактоферрин способствует дифференциации моноцитов в дендритные клетки, активирующие в свою очередь Тh1 – лимфоциты (Puddu P., et al., 2011). Снабжая Т-клетки железом, ЛФ индуцирует их пролиферацию. Помимо этого, белок может активировать и В- клетки, способствовать увеличению количества NK-клеток, а также усиливать фагоцитоз, хемотаксис нейтрофилов, модулировать миелопоэз, стимулировать гиперчувствительность и взаимодействовать с кератиноцитами (Legrand D., et al., 2005).

Как ЛФ, так и а2-МГ, способны воздействовать на синтез ряда цитокинов. Так, апо-форма ЛФ (без железа) и холо-форма белка могут, как стимулировать продукцию TNF-α, IL-1β и IL-6, так и подавлять. Установлено подобное воздействие ЛФ и на синтез IFN-γ, IL-10, IL-4 и IL-5. Данная регуляция осуществляется на ядерном уровне, через взаимодействие с фактором транскрипции NFκB (Legrand D., et al., 2005).

Защитные механизмы бактерий против ЛФ, выработанные в процессе эволюции заключаются в их способности синтезировать железо-связывающие сидерофоры. Некоторые виды Streptococcus могут даже использовать апо-форму ЛФ для своего развития (Зорина В.Н., Зорин Н.А., 2013).

Помимо «классического» воспаления патогены могут провоцировать развитие аутоиммунных процессов. Это связано с тем, что ряд белков человека обладает эволюционной консервативностью и имеет антигенные детерминанты

38

сходные с антигенными детерминантами бактерий. В частности человеческий белок теплового шока Hsp 60 гомологичен хламидийному что, как упоминалось ранее, приводит к перекрестным реакциям и синтезу аутоантител (Gammazza AM., et. al., 2012). Повреждаемые (окисляемые) продуктами воспалительной реакции молекулы а2-МГ изменяют свои свойства (Wu S.M. et. al., 1998 Chiabrando, G.A.,2002) сами могут становиться иммуногенными (Зорина В.Н., и др. 2001).

Необходимо отметить, что функции а2-МГ и ЛФ не ограничиваются их участием в воспалительной реакции и защите от патогенной инвазии. Так, а2МГ активно задействован в процессах оплодотворения, имплантации эмбриона и развитии плода (Зорин Н.A., и др., 2005). Лактоферрин, помимо проявления антиоксидантных свойств, а также иммуномодулирующего воздействия на синтез цитокинов (Legrand D., et. al.,2005), обнаруживается в постакросомальном регионе сперматозоидов, где дозозависимо ингибирует взаимодействие гамет (Zumoffen C.M., et. al.,2013), предположительно в целях предотвращения полиспермии. Его повышенные уровни ассоциированы с инфертильностью

(Маркина Л.А. и др., 2008).

39

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика групп обследованных женщин

Для решения поставленных задач обследовано 197 беременных женщин, поступивших в структурные подразделения МБЛПУ “Зональный перинатальный центр” г. Новокузнецка: консультативно-диагностическое отделение Центра планирования семьи и репродукции и клинический родильный дом (рис.1).

КОНТРОЛЬНУЮ ГРУППУ составили 60 беременных: подгруппа из 23 практически здоровых женщин (средний возраст 27,3±4,6 лет), в сроке 13-24 недели и подгруппа из 37 практически здоровых женщин (средний возраст 28,0±5,2 лет) в гестационном сроке 38-40 недель.

Критерии включения в программу исследования: 1) отсутствие антител

кCh. trachomatis; 2) неосложненное течение беременности; 3) отсутствие отклонений в развитии плода; 4) благоприятный исход родов (оценка плода по шкале Апгар 7-9 балов, физиологическое течение раннего неонатального периода); 5) отсутствие осложнений в послеродовом периоде.

ОСНОВНАЯ ГРУППА - 137 беременных носительниц антител класса G

кCh. trachomatis, без клинических проявлений заболевания, средний возраст 27,7±5,8 лет, относящихся к группе риска по развитию внутриутробного инфицирования плода. Из них 55 женщин находились в сроке гестации 13-24 недель с титром IgG-антител 1:5 - 1:160 и 82 женщины были в сроке 38-40 недель с низким титром антител (1:5-1:40).

По данным ретроспективного анализа роженицы основной группы были разделены на 2 подгруппы: 1-я подгруппа (n=46) – с благоприятным перинатальным исходом родов и рождением здорового ребенка (оценка по шкале Апгар 7-9 балов) и 2-я подгруппа (n=36) – рождение ребенка, имеющего осложнения в раннем неонатальном периоде (оценка по шкале Апгар менее 7

40

балов, у всех новорожденных имелись признаки внутриутробного инфицирования).

Критерии включения в программу исследования: 1) наличие IgG

антител к Chl. tr; 2) наличие IgG антител к МОМР+pgp3 Chl. tr; 3) отсутствие ДНК Chl. tr. в эпителии шейки матки; 4) отсутствие клинических признаков хламидийной инфекции; 5) естественные роды в сроке гестации 38-40 недель; 6) отсутствие специфического лечения хламидийной инфекции в течение беременности.

Критерии включения для 2-ой подгруппы: 1) морфологические признаки повреждения плаценты инфекционного генеза (восходящая инфекция I степени, гнойный/серозно-гнойный хорионамнионит); 2) наличие осложнений в раннем неонатальном периоде (клинические проявления внутриутробного инфицирования - задержка внутриутробного развития, лихорадка, лейкоцитоз и/или сдвиг лейкоцитарной формулы влево, гепатоспленомегалия, дыхательные расстройства, срыгивание).

Критерии исключения для контрольной и основной групп: 1)

признаки ВУИ и ВПР у плода при ультразвуковом исследовании; 2) проявления общей воспалительной реакции у беременной (лихорадка более 38˚С, лейкоцитоз); 3) бактериологически доказанная урогенитальная инфекция при беременности; 4) наличие в крови IgM-антител и/или низкоавидных IgGантител к одному или нескольким патогенам из числа Torch-инфекций; 5) наличие онкологических, аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний органов малого таза в анамнезе; 6) наличие декомпенсированной сердечно-сосудистой, дыхательной, печеночной либо почечной недостаточности; 7) наличие сахарного диабета 1 или 2 типа.

У женщин во II триместре беременности, были взяты образцы сыворотки крови. От рожениц, участвовавших в исследовании, получены образцы венозной сыворотки крови (ВС), пуповинной сыворотки (ПС) и околоплодных