50 |
Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот |
лективности по остаткам цитозина, почти не затрагивая остатки тимина. Это позволяет получать производное, в котором на месте всех остатков цитозина находится апиримидиновый сайт. В общем случае фрагменты ДНК, лишен ные гетероциклического основания, называют апуриновыми/апиримидиновыми сайтами, или сокращенно АП-сайтами.
Избыточный положительный заряд на атоме С4 цитозина способствует замещению аминогруппы на различные нуклеофилы - амины (реакция переаминирования) и на анион ОН" (дезаминирование). Так, в частности, можно заместить С4 аминогруппу цитозина на радикал -NH(CH2)„NH2.
H2N NH(CH2)nNH2 |
NH(CH2)nNH2 |
NH2(CH2)nNH2
Таким образом, можно ввести в положение С4 цитозина алифатическую аминогруппу, которая может быть проацилирована производными, несущими различные функциональные группы - реакционноспособные, флуоресци рующие и т. п. Реакции с аминами требуют участия последних в непротонированной форме, чему благоприятствуют щелочные условия. Эти же условия приводят к увеличению дезаминирования цитозина. Следовательно, при вве дении радикалов, содержащих алифатическую аминогруппу, дезаминирова ние и переаминирование являются конкурентными процессами. В первом случае происходит превращение цитозина в урацил. При переаминировании образуются различные производные по остатку цитозина. Эти реакции осо бенно эффективно протекают, если по атому С6 введен остаток сульфита, который по окончании реакции может быть удален в щелочной среде. Суще ственно, что при переаминировании один атом Н при азоте N4 сохраняется, и тем самым сохраняется способность к Уотсон-Криковскому взаимодейст вию с комплементарным остатком G. Поэтому такие модифицированные ос татки цитозина могут служить компонентами двунитевой структуры нуклеи новой кислоты, а соответствующие нуклеозидтрифосфаты - субстратами при репликации и транскрипции. Замещение аминогруппы может быть особенно мягко проведено, если заменить 4-аминогруппу на остаток 1,2,4-триазола, связанного с атомом Ы4-цитозина по атому N4 триазола.
§ 2.2. Реакции по гетероциклическим основаниям |
51 |
2.2.5. Реакции по атомам N пиридинового типа. Метилирование гетеро циклов
Избыточный отрицательный заряд имеется также на атомах N пиридино вого типа, поэтому они легко реагируют с электрофильными алкилирующими реагентами. Наиболее широкое применение для алкилирования по этим атомам азота нашел в настоящее время диметилсульфат. Алкилирование, в частности метилирование, приводит к появлению на гетероцикле положи тельного заряда. Это существенно ослабляет гликозидную связь между гете роциклом и С-1’-атомом дезоксирибозы, в результате чего она легко гидро лизуется с отщеплением соответствующего метилированного гетероцикла. Если гидролиз гликозидной связи происходит в составе ДНК, то образуется вмонтированный в полинуклеотидную цепь фрагмент дезоксирибозы, не свя занный с каким-либо гетероциклом (апуриновый сайт). В щелочной среде реакция с диметилсульфатом приводит к расщеплению гетероцикла по его имидазольному фрагменту (рис. 11).
О
.О |
1 |
Г4 |
и |
|
HIMА>1-----N |
СН,— О- S —О—СН, |
|
||
h2n aJO |
|
3 |
II |
+ CH3S04 |
|
|
о |
||
|
|
|
|
|
+/сн3 |
О |
|
.СН, |
|
|
|
HNл |
|
|||
HN |
1 ----- N |
|
> j ---------N v |
|||
+ он |
i |
|||||
xJC |
II |
|
|
N |
||
СН |
|
A . I |
||||
|
|
|
c c h < 6 - 7 |
|||
H„N |
|
|
|
H0N |
|
I |
|
|
|
|
|
|
R |
Рис. 11. Схема превращений остатка гуанина при алкилировании диметилсульфа том в щелочной среде
Хорошим алкилирующим реагентом является также диазометан, который при присоединении протона становится донором карбкатионов СНз+ На
52_______ Гчава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот
рис. 12 приведена схема реакции с остатком урацила в качестве донора про тона. В этом случае на имеющем кислый характер атоме N3 возникает отри цательный заряд, и по этому атому происходит метилирование. Аналогично проходит алкилирование по атому N3 остатка гуанина. В водных условиях донором Н* становятся молекулы воды, и точками алкилирования становятся атомы пиридинового типа, например, N3 цитозина и N7 гуанина.
С Н , +
сн,
h2n'
CH2N2; Н20
Рис. 12. Схема метилирования гетероциклов диазометаном
При реакции с пероксидами (смесь Н2О2 с кислотой или надкислоты) ато мы N пиридинового типа могут превращаться в N-оксиды.
2.2.6. Реакции по NH-C=0 группам
В гетероциклы уридина, тимидина, гуанозина и некоторых минорных компонентов (инозин, псевдоуридин) входят атомы азота в виде -NH-CO- групп. Такие атомы азота в силу сопряжения с С=0 группой не обладают ос новными свойствами. Однако в слабощелочной среде группа N-H ионизуется с образованием нуклеофильного аниона, который может реагировать с электрофильным атомом С карбодиимидов с образованием продукта присоедине ния карбодиимида по этому атому N.
|
|
§ 2.2. Реакции по гетероциклическим основаниям |
53 |
||
|
|
|
|
н,с .. |
|
|
|
|
|
V A |
|
|
|
|
|
n h c h 2c h 2n |
|
И |
I |
+ C6H11N=C=NCH2CH2N4 |
г Л н - с / |
|
|
о |
|
|
|||
|
N |
|
N.л |
NC6H,1 |
|
|
I |
|
I |
|
|
|
R |
|
R |
|
|
Реакция проходит по атомам, которые при образовании дуплексных структур не участвуют в Уотсон-Криковских взаимодействиях, поэтому при веденная реакция не проходит по остаткам гуанина и урацила в двуспираль ных фрагментах нуклеиновых кислот, что делает ее полезной для выявления таких фрагментов в нуклеиновых кислотах. Реакция с UMP проходит в не сколько раз быстрее, чем с GMP. С наибольшей скоростью реакция проходит по остаткам инозина и псевдоуридина.
2.2.7. Окисление по двойной связи С5=С6
По связи С5=С6 пиримидиновых оснований могут проходить различные реакции окисления с образованием 5,6,-дигидроксипиримидиновых основа ний. Такие производные, в частности, получаются при окислении КМпС>4, однако подобные основания неустойчивы, и происходит деградация гетеро цикла. Достаточно устойчивы дигидроксипроизводные, получаемые при ис пользовании в качестве окислителя тетроксида осмия. Первой стадией реак ции является циклоприсоединение 0 s0 4 с последующим гидролизом, приво дящим к отщеплению OsC>2(ОН)г-
HN OsO.
«А Н
2.2.8. Реакции по экзоциклическим аминогруппам
Среди реакций по экзоциклическим аминогруппам в первую очередь сле дует отметить реакции ацширования, используемые для введения защит в целях последующего использования N-ацилнуклеозидов в качестве моно меров в химическом синтезе олигонуклеотидов (гл. 5). Ацилирование прово дится с помощью соответствующих хлорангидридов в пиридине.
Вторая важная реакция по экзоциклическим аминогруппам - дезаминиро вание под действием азотистой кислоты. Оно происходит через промежуточ ное образование диазония, который легко гидролизуется с образованием ОН-
54 |
Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот |
производного, находящегося в таутомерном равновесии с кетоформой. Эта реакция приводит к превращению цитозина в урацил, аденина в гипоксантин и гуанина в ксантин. Реакция может протекать в природных условиях под действием HNO2, образующейся при грозовых разрядах. Как будет видно при рассмотрении вторичной структуры нуклеиновых кислот, в случае ДНК это изменяет смысл генетической информации, т. е. приводит к мутациям.
2.2.9. Реакции с бифункциональнымиреагентами
Среди бифункциональных реагентов нашли широкое применение реакции
сгалогенальдегидами и диальдегидами. При pH 4-5 происходят реакции
сучастием экзоциклических аминогрупп, реакции с хлорацет- и бромацетальдегидами, приводящие к образованию интенсивно флуоресцирующих
этенопроизводных.
Механизм реакции полностью не установлен, но можно предполагать, что он происходит ступенчато: одной из стадий является алкилирование атомов N1 аденина или N3 цитозина С1СН2-фрагментом реагента, а другой - реакция
§ 2.2. Реакции по гетероциклическим основаниям |
55 |
альдегидной группы с экзоциклической аминогруппой. В результате проис ходит формирование пятичленного гетероцикла.
2.2.10. Фотохимические реакции пиримидиновых гетероциклов
Широкое применение нашли фотохимические реакции присоединения по двойной связи СН=СН. Детально изучена реакция циклодимеризации тиминов, происходящая между соседними остатками тимидина в составе ДНК и являющаяся одним из главных источников повреждения ДНК ультрафиоле товым светом. В результате реакции может образоваться четыре изомера
(рис. 13).
Рис. 13. Структура изомерных продуктов фотохимической циклодимеризации ос татков тимина
Если на комплементарных цепях в благоприятном взаимном расположе нии находятся два остатка тимина, то легко проходит циклоприсоединение в составе ДНК к псоралену и его производным. Особенностью этого реагента является его бифункциональность - фотохимическая реакция может проис ходить как по пироновому, так и по фурановому циклу псоралена. При этом циклоприсоединение по фурановому циклу не лишает способности произ водного псоралена участвовать в циклоприсоединении к тимину по пироно вому циклу. Наибольшее применение нашел 4,5’,8-триметилпсорален. На рис. 14 представлена схема последовательного взаимодействия этого произ водного с двумя остатками тимина.
56 |
Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот |
h v (365 нм)
Рис. 14. Схема последовательного взаимодействия двух остатков тимина с 4,5’,8- триметилпсораленом
Фотохимически активными являются также некоторые производные пи римидиновых нуклеозидов - 5-бромуридин, 5-иодуридин, 4-тиоуридин, 5-бромцитидин и 5-иодцитидин.
Еще одной группой бифункциональных реагентов, специфично модифи цирующих остатки гуанина в составе нуклеиновых кислот, являются глиоксалъ и его производные (чаще всего фенилглиоксаль). Альдегидные группы реагируют с атомом N 1 и экзоциклической аминогруппой.
>- Сч
НX
R - нуклеотид или |
Х=Н глиоксаль |
полинуклеотид |
Х=С*Нс фенилглиоксаль |
6 5
§ 2.2. Реакции по гетероциклическим основаниям |
57 |
Среди многочисленных производных нуклеозидов и нуклеотидов широ кое применение нашли производные, несущие фотоактивные группы. Они могут быть легко введены в исходные производные, если в них предвари тельно введена алифатическая аминогруппа, которая затем может быть проацилирована N-гидроксисукцинимидными эфирами фотоактивных производ ных. Аминогруппа может быть введена в положения 4 или 5. При связывании фотоактивной группы с атомом С5 остатка урацила реакция проходит по атому, который не участвует в Уотсон-Криковских взаимодействиях.
2.2.11. Реакции гетероциклических оснований со свободными радикалами
Рассмотренные превращения являются гетеролитическими и характери зуются высокой специфичностью. В отличие от них гомолитические превра щения оснований, происходящие при действии на них свободных радикалов, значительно менее специфичны и, следовательно, многообразны. Эти пре вращения особенно интенсивно изучались в связи с исследованием механиз ма воздействия проникающей радиации. Главным источником свободных радикалов в биологических системах при радиолизе является образование из воды свободных гидроксилов ЮН. Для радикалов ЮН характерны реакции отрыва атомов Н и реакции присоединения по двойной связи. Ниже приво дятся эти реакции по остаткам тимина.
о
•он
R
Аналогично проходят реакции по гетероциклам в случае урацила и цитозина. Образовавшиеся свободные радикалы либо рекомбинируют друг с другом с образованием соответствующих димеров, либо при наличии в среде окис
лителя (донора электронов) превращаются в высокореакционноспособный карбокатион. Последний, в частности, может реагировать с водой с образова нием соответствующих дигидроксипроизводных. Ниже эти превращения представлены для тимина в случае, если ОН-радикал присоединился к атому Сб.
58 |
Глава 2. Биоорганическая химия нуклеотидов и нуклеиновых кислот |
|||
|
|
|
О |
|
|
окисление |
+ Н 20 |
H N " ^ / o H 3 |
|
|
|
|
O ^ N |
н |
|
|
|
R |
|
Образующиеся дигидроксипроизводные могут претерпевать последую щую окислительную деградацию. Так, остаток 5,6-дигидрокситимина может превращаться в остаток 'И-формил-^-пирувилмочевины и далее в остаток N-формилмочевины и затем мочевины.
О |
О |
О |
|
|
|
||
|
IM H-C-C-CH3 |
n h 2 |
|
|
0 = C V |
— ► |
0 = С Ч |
|
N-CHO |
|
N-CHO |
I
R
Г
,n h 2
o=c(
NHR
Если процесс происходит в присутствии кислорода, то в первую очередь присоединяется молекула Ог с образованием пероксирадикала, который мо жет претерпевать разнообразные превращения, в частности, образование не устойчивого тетроксида. Последний может далее превращаться несколькими путями с регенерацией Ог, образованием Н2О2 или радикалов ЮН. В ряде случаев эти реакции сопровождаются расщеплением гетероцикла.
§ 2.3. Реакции по углеводным остаткам
ОН-группы углеводных фрагментов являются реакционноспособными группами. У свободных дезоксирибонуклеозидов таких групп две, а у рибонуклеозидов - три. В последнем случае две ОН-группы находятся в цисположении относительно друг друга (т. е. являются соседними), в связи с чем часто этот фрагмент называют цис-диольной группой. В нуклеотидах некото рые из ОН-групп соединены с остатком фосфорной кислоты. Если в состав нуклеотида входит один такой остаток, то в нуклеотиде остается одна (дезоксинуклеотиды) или две (рибонуклеотиды) свободных ОН-группы. В последнем случае если фосфат присоединен к 5’-ОН-группе, то в нуклео тиде сохраняется цис-диольный фрагмент. В полинуклеотидах, за исключе нием концевой группы в случае ДНК, ОН-группа сохраняется в единствен ном числе на нефосфорилированном конце. В РНК ОН-группа присутствует
§ 2.3. Реакции по углеводным остаткам |
59 |
в каждом мономерном звене, а если на ее 3’-конце остатки фосфорной кисло ты отсутствуют, то на этом конце сохраняется цис-диольный фрагмент.
Широкое применение нашли реакции по цис-диолъной группе, которая легко окисляется перйодатом с разрывом С-С связи и образованием диальдегидного производного. По альдегидным группам могут быть проведены раз личные превращения, например, реакции с аминами. При этом образуются легко гидролизуемые основания Шиффа, однако они могут быть стабилизи рованы обработкой боргидридом натрия с превращением оснований Шиффа в амины. На рис. 15 в качестве примера приведены соответствующие пре вращения АТР.
P ‘ P ’ P l ^ ' ° |
' v ^ |
A d e |
Р " Р Р 1 ^ ° |
\ |
A d e |
|
у |
|
У + НЮ4 — |
\ |
/ |
+ ню3+ н 2о |
|
Г |
|
Т |
|
0*сн |
сн *о |
|
он он |
|
|
2RNH, |
|||
|
V |
|
|
|||
Р-Р-Р |
Ade |
|
|
|
||
|
|
О ^ |
|
|
|
NaBH
СН2 СН2
NHR NHR
Рис. 15. Превращения рибозного фрагмента в АТР
Такие же превращения могут происходить с 3’-концевыми цисдиольными группами олигорибонуклеотидов и молекул РНК.
По ОН-группам в водном растворе может быть проведено ацилирование. Поэтому обработкой уксусным ангидридом можно получить полимерную молекулу РНК, ацетилированную по ОН-группе каждого звена. Наличие ОНгрупп в углеводном фрагменте создает определенные затруднения при введе нии ацильных защит по экзоциклическим аминогруппам, поскольку оно со провождается ацилированием ОН-групп пентозного фрагмента. Однако это затруднение легко преодолевается, поскольку сложноэфирные связи можно гидролизовать в щелочной среде в условиях, не затрагивающих ациламидные связи. Более мягкой процедурой является предварительная обработка нуклеозида триметилхлорсиланом, приводящая к введению по ОН-группам (CH3)3Si-ocTaTKa. После ацилирования аминогрупп гетероциклов триметилсилильные группы легко удаляются мягкой щелочной обработкой.
Пентозные фрагменты могут реагировать со свободными радикалами, в частности с *ОН, образующимися при радиолизе. Взаимодействие пред ставляет собой отрыв атомов Н. Реакционная способность радикалов ЮН по отношению к С-Н-связям остатков пентоз в несколько раз ниже, чем по от