6 курс / Гастроэнтерология / Российский_журнал_гастроэнтерологии,_гепатологии,_колопроктологии (38)

5, 2006	Лекции и обзоры

УДК 616.36-008.811.6-092.18

Молекулярные механизмы апоптоза и некроза гепатоцитов. Особенности гибели гепатоцитов при обструктивном холестазе

В.Г. Давыдов1, С.В. Бойчук2, Р.Ш. Шаймарданов1, М.М. Миннебаев2

(1Казанская государственная медицинская академия последипломного образования, кафедра общей и неотложной хирургии,

2Казанский государственный медицинский университет, кафедра патологической физиологии)

Обзор содержит информацию об основных молекулярных механизмах апоптоза и некроза гепатоцитов. Рассмотрены каскады реакций, приводящих к гибели клеток печени и запускаемых активацией Fas , TNF и TRAIL рецепторов, которые в патологических условиях экспрессируются на гепатоцитах. Освещена также роль митохондриальных факторов гибели клеток. Особое внимание уделено механизмам гибели гепатоцитов в условиях обструктивного холестаза. Показано ведущее значение гидрофобных желчных кислот в гибели гепатоцитов при нарушении оттока желчи.

Ключевые слова: гепатоциты, апоптоз, некроз, желчные кислоты, холестаз.

Внастоящее время установлены генетические основы и важнейшие биохимические механизмы, приводящие к гибели клетки.

Выделяют два вида клеточной смерти: некроз и апоптоз. Для апоптоза характерны межнуклеосомальная деградация ДНК, разрушение белков цитоскелета, уменьшение объема клетки и ее органелл, фрагментация клетки на мембранные везикулы, называемые «апоптозными тельцами». Известно, что в этом процессе роль главных эффекторных молекул играют каспазы. Они синтезируются в виде неактивных предшественников, которые в результате протеолиза преобразуются в активные ферменты, ответственные за осуществление клеточной гибели. Тканевые макрофаги и соседние клетки фагоцитируют апоптозные тельца, не вызывая воспалительной реакции. Гибель клетки по механизму некроза сопровождается набуханием клетки и ее органелл с последующим разрывом цитоплазматической мембраны и попаданием содержимого клетки в межклеточное пространство, что приводит к воспалительной реакции.

Исследования последних десятилетий показывают, что в патогенезе большинства заболеваний печени ведущую роль играет апоптоз гепатоцитов, а не их некроз, как считали ранее [1]. Однако это не означает, что некроз вовсе не имеет места при

гибели гепатоцитов. В патологических условиях, где клетк и испытывают воздействия многих токсических агентов, разные по силе и длительности, выделить какой-либо из вариантов клеточной смерти как единственный не представляется возможным. Можно говорить лишь о преимущественном характере поражения. Поэтому делаются попытки ввести в использование такой термин, как «некроапоптоз» [35]. Выделяют два основных механизма, ответственных за активацию процесса гибели клеток: внутренний путь, реализуемый через митохондрии и запускаемый специфическими внутриклеточными стимулами (повреждение ДНК, недостаток факторов роста, повышение концентрации внутриклеточного Са2+), и внешний, связанный с активацией рецепторов смерти, расположенных на поверхности клеточных мембран. Оба пути нередко тесно взаимосвязаны. В частности, активация рецепторов смерти может приводить не только к апоптозу клеток, как считалось ранее, но и к их некрозу [13]. Ниже рассматриваются роль рецепторов смерти и митохондрий в гибели гепатоцитов, а также особенности гибели гепатоцитов при обструктивном холестазе.

Рецепторы смерти в силу сходства их молекулярной структуры объединены в суперсемейство TNF-рецепторов. Суперсемейство включает около 30 членов, однако не все из них участвуют в регу-

11

Лекции и обзоры

5, 2006

ляции процессов клеточной гибели. Установлено, что гепатоциты экспрессируют следующие разновидности рецепторов данного семейства: TNF-рецептор 1 (TNF-R1), Fas, TRAIL-рецеп- тор 1 (DR4), TRAIL-рецептор 2 (DR5) [58].

Перечисленные рецепторы характеризуются наличием гомологичного внутриклеточного участка, называемого доменом смерти (death domain, DD), который активируется после связывания рецептора со специфическим лигандом или иным родственным агонистом. Активация рецепторов достигается за счет связывания (олигомеризации) трех соседних молекул. Специфическими лигандами для вышеуказанных рецепторов являются

TNFα, FasL и TRAIL соответственно [58].

Механизмы Fas индуцированной гибели гепатоцитов

Показано, что повышение экспрессии Fasрецептора на гепатоцитах имеет место при холестазе, гепатитах вирусной и другой этиологии, болезни Вильсона, алкогольной болезни печени. Fas-индуцированный апоптоз гепатоцитов может привести к фульминантной печеночной недостаточности и даже к летальному исходу. Так, внутрибрюшинное введение мышам 10–100 мкг антител к Fas-рецептору вызывало гибель животных в течение 4–6 ч. Биохимические, гистологические исследования и данные электронной микроскопии подтверждали тяжелое поражение печени, возникающее в результате апоптоза гепатоцитов [43].

Fas-индуцированный апоптоз гепатоцитов протекает по традиционному пути. Вследствие олигомеризации Fas-рецептора активируется его внутриклеточный участок – домен смерти. Последний взаимодействует с гомологичным С-терминальным участком адаптерного белка FADD (Fas-associated death domain, Fas-ассоциированный домен смерти). N-терминальный участок FADD содержит эффекторный домен смерти (DED, death effector domain) или инициатор каспаз, который взаимодействует со специфическим доменом прокаспазы-8 (и прокаспазы-10), вызывая олигомеризацию и самоактивацию каспаз в результате аутокатализа. Образуется так называемый смерть-индуци- рующий сигнальный комплекс (death-inducting signaling complex, DISC), что приводит к актива-

ции инициирующей каспазы-8 и является ключевым моментом Fas-индуцированной гибели гепато-

цитов [31, 47, 58].

Дальнейшее развитие пути, по которому запускается программа гибели клеток, определяется их типом. В соответствии с этим выделяют два типа клеток [47]. В клетках I типа активированная инициирующая каспаза вызывает активацию эффекторных каспаз (каспаза-3/6/7), ответст­ венных за деградацию ДНК, разрушение белков цитоскелета и другие события, приводящие к апо-

птозу. В клетках II типа активация эффекторных каспаз реализуется через вовлечение митохондриального пути гибели клетки. Различные варианты индукции Fas-опосредованного апоптоза исследователи объясняют неодинаковой активностью и/или экспрессией каспазы-8 в этих типах клеток [37, 47, 58]. Конституционально существующие

вцитоплазме клеток белки, названные апоптоз-

ингибирующими (inhibitor-of-apoptosis proteins, IAPs), блокируют активацию каспазы-3. Высокая активность каспазы-8 в клетках I типа позволяет преодолеть действие этих ингибиторов. Тогда как в клетках II типа индуцируется выделение митохондриальных проапоптотических факторов,

втом числе Smac/DIABLO, который инактивирует IAPs. Это создает условия для активации каспазы-3 при участии каспазы-8. Кроме того, возникают альтернативные механизмы активации каспаз с помощью цитохрома с, также выделяемого из митохондрий. В цитоплазме цитохром с

вприсутствии АТФ взаимодействует с кофактором – Apaf-1 (апоптоз-активирующий фактор 1, apoptosis-activating factor 1), что облегчает ему связывание с прокаспазой-9. Указанные белки формируют так называемые, «апоптосомы», способные к активации ряда эффекторных каспаз, в том числе каспазы-3, ответственной за реализацию программы гибели клетки [31, 57].

Выявлено, что гепатоциты относятся к клеткам II типа [31]. Активация инициирующих каспаз при Fas-индуцированном апоптозе гепатоцитов приводит к расщеплению проапоптогенного белка Bid с образованием его активной формы – tBid. tBid мигрирует к митохондриям и вызывает выделение из них вышеперечисленных проапоптотических факторов. Ключевая роль Bid

вгибели гепатоцитов подтверждается их резистентностью к Fas-индуцированному апоптозу у Bid-нокаутных мышей in vitro и in vivo [59].

Механизмы TNF R1 индуцированной гибели гепатоцитов

Повреждения печени, вызванные активацией TNF-R1-рецептора, наблюдаются при полиорганной недостаточности, в результате эндотоксинемии, при алкогольной болезни печени и ишемических/реперфузионных поражениях. Активирующим агентом при этом является фактор некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor alpha, TNFα) [58].

После связывания лиганда с рецептором происходит олигомеризация последнего. Активирующий сигнал от рецептора через адаптерный белок

TRADD (TNF-R1-associated death domain) пере-

дается на FADD и затем на каспазу-8, как было описано выше. Так же как и для Fas-индуциро- ванного апоптоза, активация каспазы-3 каспазой-8 подавляется активностью IAPs. Поэтому после

12

5, 2006	Лекции и обзоры

образования FADD также реализуется митохондриальный путь активации эффекторных каспаз, являющийся ключевым моментом в гибели гепатоцитов как для Fas-опосредованного, так и для TNF-R1-опосредованного пути [58]. Однако М. Schuchmann и соавт. показали, что доминант- но-негативные по FADD-белку трансгенные мыши не являются устойчивыми к Fas- и TNFα-индуци- рованному апоптозу гепатоцитов, что свидетельствует о существовании механизмов клеточной гибели, независимых от FADD и каспазы-8 [49].

Многочисленные пути, приводящие к гибели клетки, при воздействии TNFα обусловлены строением TNF-R1-рецептора. Последний содержит три функциональные области, которые при взаимодействии с различными внутриклеточными адаптерными белками передают сигналы внутрь клетки [19]. Выделяют С-терминальный участок рецептора, ассоциированный с вышеуказанным доменом смерти, средний участок, содержащий

A-SMase (acidic sphingomyelinase)-активирующий домен (ASD) и N-терминальный участок, содер-

жащий N-SMase (neutral sphingomyelinase)-акти-

вирующий домен (NSD). Несмотря на многообразие путей передачи первичного сигнала, эффекты большинства из названных посредников имеют конечной целью активизацию митохондриального пути гибели клетки.

N-SMase и A-SMase являются областями TNF-R1-рецептора, участвующими в деградации сфингомиелина и образовании церамида. Причем действие N-SMase осуществляется при посредничестве адаптерного протеина FAN (factor associated with neutral sphingomyelinase activation). Предполагаемая роль сфинголипидов,

вчастности церамида, заключается в передаче внутриклеточных сигналов при воздействии TNFα [19, 54]. Показано, что церамид является индуктором некроза гепатоцитов, сопровождающегося нарушением функции митохондрий, снижением трансмембранного потенциала, генерацией активных форм кислорода и уменьшением уровня АТФ

вклетках [9, 22].

Известно, что в осуществлении процесса гибели клетки важную роль играют лизосомальные протеиназы. Установлено, что при инкубации культуры гепатоцитов с TNFα в цитоплазме клеток повышается активность лизосомального фермента катепсина В. В то же время, гепатоциты мышей, нокаутных по гену катепсина В, являются устойчивыми к TNFα-индуцирован- ному апоптозу. Выявлена корреляция между уровнями активности катепсина В, цитохрома с и эффекторных каспаз (каспаза-9/3) в цитоплазме гепатоцитов. Таким образом, участие катепсина В в процессе гибели клетки реализуется через вовлечение митохондриальных факторов [24, 25]. Дальнейшие исследования показали, что повышение проницаемости мембран лизосом осущест-

вляется при участии FAN, а также каспазы-8 и активируемого ей Bid. Предполагается, что FAN индуцирует образование в клетках церамида, который конвертируется в сфингозин. Сфингозин

всилу своего детергентного действия способен дестабилизировать лизосомальные мембраны. Также предполагается участие FAN в активации каспазы-8 и, как следствие, Bid, что, возможно, вызывает повышение проницаемости мембран митохондрий и лизосом по сходным механизмам. Кроме того, TNFα способен активировать каспа- зу-8 и Bid при посредничестве TRADD и далее

FADD [55, 56]. Участие FADD, каспазы-8 и Bid

вактивации катепсина В указывает на то, что этот механизм реализуется и при Fas-индуциро- ванной гибели гепатоцитов.

Обнаружено, что собственно TNFα не оказывает повреждающего воздействия на гепатоциты как in vivo, так и in vitro. Этот факт обусловлен тем, что кроме токсического воздействия TNFα способен стимулировать гепатопротективный механизм, реализуемый через транскрипционный ядерный фактор (nuclear factor kappa В, NF-kВ).

Активация NF-kВ вызывает экспрессию генов, ответственных за синтез протекторных белков,

включая IAPs, Bcl-ХL и др.

NF-kВ представляет собой семейство из пяти белков: р65 (RelA), RelB, c-Rel, р50/р105 (NFkВ1) и р52/р100 (NF-kB2), которые в нестимулированных клетках в виде гомо- и гетеродимеров

находятся в неактивном состоянии из-за связи с клеточным белком I-kВα [27]. Освобождение активной формы NF-kВ осуществляется при фосфорилировании I-kВα комплексом IKK (I-kВ kinase), который состоит из нескольких субъединиц: IККα, IККβ и IKKγ/NEMO. В свою очередь, IKK активируется комплексом TRAF2/ RIP1 при участии митоген-активируемой протеинкиназы МЕКК3 [27]. Следовательно, для того чтобы вызвать гепатотоксический эффект TNFα, необходима предварительная сенсибилизация клеток. С этой целью наиболее часто применяются ингибиторы транскрипции и трансляции (D-галактозамин и циклогексемид), которые могут использоваться как in vitro, так и in vivo. Кроме того, применяют мутантные формы I-kВα

– I-kВα sr (super represser) и ∆N-I-kВα, которые не могут быть фосфорилированы IKK, что не позволяет TNFα активировать NF-kВ. В условиях патологии, по-видимому, также образуются сенсибилизирующие агенты, которые способствуют проявлению гепатотоксического действия TNFα. Одним из таких факторов при состояниях, сопровождающихся ишемией и/или эндотоксинемией, может стать дефицит АТФ, который подавляет процессы транскрипции и трансляции [58].

Механизмы, по которым активация TNFR1 приводит к гибели клетки или к экспрессии цитопротективных факторов, недостаточно изуче-

13

Лекции и обзоры

5, 2006

ны. О. Micheau и J. Tschopp предложили гипотезу о формировании двух комплексов, способных активировать NF-kВ или FADD и каспазу-8 [38]. Стимуляция TNF-R1 приводит к формированию комплекса I, состоящего из TRADD, TRAF2, RIP1 и, возможно, других, еще не идентифицированных, белков. Комплекс I связан с TNF-R1, он не содержит FADD и каспазу-8 и способен активировать NF-kВ по вышеописанному механизму. После диссоциации с TNF-R1 происходит модификация компонентов комплекса I, приводящая к высвобождению фрагмента TRADD, взаимодействующего с гомологичным участком FADD, что обусловливает формирование в цитоплазме комплекса II. Формирование комплекса II и активация входящих в него FADD и каспазы-8 запускает гибель клетки.

Гепатопротективная роль NF-kВ при Fas-инду- цированном апоптозе подтверждается тем, что инкубация гепатоцитов с актиномицином D или циклогексемидом приводит к тотальной гибели клеток. При отсутствии ингибиторов транскрипции и трансляции погибает менее 20% культивируемых гепатоцитов [42].

Механизмы TRAIL индуцированной гибели гепатоцитов

Семейство TRAIL-рецепторов также играет важную роль в гибели гепатоцитов. Запуск эффекторных механизмов при активации TRAILрецепторов происходит по принципу, сходному с Fas-индуцированным апоптозом, т. е. с вовлечением FADD, каспазы-8 и митохондриальных факторов. Активирующим агентом для этого семейства рецепторов является TRAIL (TNFrelated apoptosis-inducting ligand) [58]. Кроме цитотоксического эффекта, TRAIL способен активировать цитопротективные механизмы, реализуемые через индукцию экспрессии ряда регуляторных белков, ингибирующих гибель клетки: IAPs, Bcl-xL и cFLIP. В частности, cFLIP (cellular (FADD-like ICE)-inhibitory protein) имеет сход-

ное строение с каспазой-8 и каспазой-10, но не обладает протеазной активностью. Замещая инициирующие каспазы, входящие в состав смертьиндуцирующего сигнального комплекса (DISC), cFLIP инактивирует его [34].

Роль митохондрий в гибели гепатоцитов

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что в гепатоцитах все внешние стимулы имеют конечной целью активацию митохондриальных факторов гибели клетки. Роль митохондрий в данном процессе нельзя объяснить только нарушением их функции, сопровождающимся дефицитом энергетических субстратов. Это актив-

ный многокомпонентный регулируемый процесс. Основные события, происходящие в митохондриях, которые могут привести к гибели клетки, можно объединить в три группы [3]: 1) разобщение процессов электронного транспорта, окислительного фосфорилирования и образования энергии; 2) изменение окислительно-восстанови- тельного потенциала клетки, сопровождающееся генерацией активных форм кислорода (АФК); 3) высвобождение из митохондрий апоптогенных факторов, способных активировать каспазы и переводить процесс гибели клетки в необратимую стадию. Эти события часто происходят одновременно, сопровождаются повышением проницаемости мембран митохондрий и снижением трансмембранного потенциала. Причем от интенсивности процессов, происходящих в митохондриях, зависит и вариант клеточной гибели. Так, при быстром повышении проницаемости мембран митохондрий и соответственно быстром снижении уровня АТФ происходит лизис клетки (некроз). Если проницаемость мембран повышается медленно и запасы АТФ в клетках достаточны, то создаются условия для реализации программы апоптоза. Выбор варианта клеточной гибели зависит от силы повреждающего воздействия [36].

Особенности гибели гепатоцитов при обструктивном холестазе

Любой патологический процесс в печени может сопровождаться холестазом, который в общем виде представляет собой нарушение синтеза, секреции и оттока желчи. Исходя из причин выде-

ляют внутрипеченочный и внепеченочный холес-

таз. В свою очередь, внутрипеченочный холестаз может развиваться при повреждении паренхимы печени (гепатоцеллюлярный холестаз) и при нарушении секреции и тока желчи на уровне желчных канальцев. Внепеченочный (подпеченочный) холестаз развивается в случае нарушения оттока желчи по внепеченочным желчевыводящим путям. Причинами этого могут служить конкременты желчевыводящих путей, опухоли желчных путей, поджелудочной железы, большого дуоденального сосочка, острый и хронический панкреатит, воспалительные и посттравматические стриктуры, врожденные атрезии желчевыводящих путей [7, 41]. Повреждения гепатоцитов, развивающиеся в результате нарушения оттока желчи по желчевыводящим путям (внепеченочный холестаз), являются вторичными по отношению к причине холестаза, в то время как нарушения синтеза и секреции желчи (внутрипеченочный холестаз) могут быть следствием первичного повреждения гепатоцитов. В рассмотренных ниже исследованиях механизмы гибели гепатоцитов in vivo изучены на модели обструктивного (внепеченочного) холестаза. Это позволяет судить о роли

14

5, 2006	Лекции и обзоры

собственно холестаза как фактора, приводящего к повреждению клеток печени.

Патогенез повреждения гепатоцитов при подпеченочном холестазе включает все вышеописанные механизмы. Это обусловлено тем, что обструктивные заболевания желчевыводящих путей сопровождаются не только прекращением экскреции желчи, но и ишемией гепатоцитов, а также эндотоксинемией. Тем не менее, ведущим фактором повреждения клеток печени при обструктивном холестазе следует признать накопление в них компонентов желчи, а именно солей желчных кислот [21]. Показано, что внутривенная инфузия солей желчных кислот в эксперименте приводит к токсическому повреждению гепатоцитов, сопровождающемуся повышением в крови маркеров цитолиза [48]. Механизмы, в результате которых желчные кислоты вызывают гибель гепатоцитов, вряд ли можно объяснить лишь их детергентными свойствами [6, 10]. Установлено, что гидрофобные желчные кислоты вызывают гибель гепатоцитов, в то время как гидрофильные оказывают цитопротекторное действие [4, 11].

Инкубация гепатоцитов с солями гидрофобных желчных кислот приводит к повышению внутриклеточной концентрации Са2+ в клетках и сопровождается снижением в них уровня АТФ [8, 51, 60]. Желчные кислоты способны выполнять роль ионофоров и тем самым способствовать проникновению ионов Са2+ в гепатоциты из окружающего пространства и мобилизации его из внутриклеточных депо. Показательно, что соли моногидроксихолановых желчных кислот мобилизуют внутриклеточные запасы Са2+ [17], а соли дигидроксихолановых кислот способствуют проникновению в клетку ионов Са2+ из окружающей среды [51]. Повреждающее действие высокой концентрации Са2+ реализуется через активацию внутриклеточных кальцийзависимых протеаз, фосфолипаз, эндонуклеаз [5, 53]. Уменьшение уровня АТФ в гепатоцитах может быть вызвано нарушением функции митохондрий и процесса окислительного фосфорилирования и/или подавлением гликолиза под влиянием солей гидрофобных желчных кислот. Однако при воздействии желчных кислот синтез АТФ в гепатоцитах из фруктозы, которая является более эффективным субстратом для гликолиза, чем глюкоза, не нарушается. Доказано, что инкубация гепатоцитов с нетоксичной урсодезоксихолевой кислотой не приводит к снижению уровня АТФ и цитолизу, хотя сопровождается повышением уровня Са2+ в цитоплазме. Вместе с тем воздействие гликохенодезоксихолевой кислоты вызывает гибель гепатоцитов на фоне снижения содержания АТФ. Добавление к среде фруктозы ингибирует цитолиз, несмотря на высокую концентрацию Са2+ [51], тогда как использование Са2+-связывающих хелатирующих агентов (ВАРТА/АМ) не умень-

шает цитотоксический эффект гидрофобных желчных кислот [16]. Следовательно, ведущим гепатотоксическим эффектом желчных кислот следует признать истощение энергетических субстратов. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ лишь потенцирует токсическое действие гидрофобных желчных кислот на гепатоциты.

Дальнейшие исследования выявили, что вариант гибели гепатоцитов (апоптоз или некроз) при воздействии солей гидрофобных желчных кислот зависит от их концентрации. Инкубация гепатоцитов в среде с концентрацией гликохенодезоксихолевой кислоты более 250 µmol/L вызывает некроз клеток, тогда как при меньшей концентрации индуцируется их апоптоз [12, 18, 44]. Установлено, что апоптоз гепатоцитов сопровождается повышением активности катепсина B в цитоплазме [45]. Однако экспрессия катепсина В при апоптозе является поздним событием

изависит от активности инициирующих механизмов, а именно каспазы-8 и Bid. Это означает, что гидрофобные желчные кислоты могут вызывать активацию рецепторов семейства TNF. Обнаружено, что гепатоциты обладают высокими уровнями экспрессии Fas, TRAIL-R1, TRAIL-R2

иTNF-R1. В то же время гепатотоксическое действие желчных кислот реализуется через Fas- и TRAIL-R2- рецепторы, но не через TNF-R1 [31].

Под влиянием гидрофобных желчных кислот происходит FasL-независимая олигомеризация Fas-рецептора и запуск дальнейшего каскада реакций, приводящих к гибели клетки [20]. Механизмы лиганд-независимой олигомеризации Fas-рецептора при воздействии желчных кислот недостаточно изучены. Предполагается возможность самоагрегации рецепторов в результате значительного увеличения их экспрессии. Кроме того, не исключается повышение чувствительности рецепторов к конституционально существующим на поверхности клеток небольшим количествам FasL, а также к другим агонистам [50]. Увеличение экспрессии Fas-рецептора на поверхности гепатоцитов наблюдается при их инкубации с солями цитотоксичных желчных кислот. Повышение концентрации солей желчных кислот в гепатоцитах приводит к активации протеинкиназы С при участии ионов Са2+ [14, 15]. Протеинкиназа С является ферментом, участвующим в экзоцитозе внутриклеточных везикул, в том числе секвестрированного в комплексе Гольджи пула Fas-рецептора (trafficing). Применение специфических ингибиторов, бло-

кирующих экзоцитоз (brefeldin A, nocodazole, chelerythrine), уменьшает экспрессию Fas-рецеп- тора на поверхности гепатоцитов и, как следствие, предотвращает их гибель.

Однако активация Fas-индуцированного апоптоза не является единственной точкой приложения токсического действия гидрофобных желчных

15

Лекции и обзоры

5, 2006

кислот. Так, при перевязке общего желчного протока у Fas-нокаутных мышей наблюдается апо­ птоз гепатоцитов [39]. В то же время подавление активности Bid предупреждает гибель клеток [32]. Это обусловлено тем, что путь FADD–кacпa- зa-8–Bid является общим для семейства TNFрецепторов. Блок на любом из этих уровней подавляет рецептор-опосредованный апоптоз гепатоцитов [31]. Инкубация трансгенных по Fas гепатоцитов с гликохенодезоксихолевой кислотой вызывает усиление транскрипции мРНК TRAILR2, сопровождающееся повышением экспрессии рецептора на поверхности клеток, что приводит к усилению чувствительности гепатоцитов к TRAIL-индуцированному апоптозу. Активация этих рецепторов также, вероятно, обусловлена самоагрегацией либо повышением чувствительности к агонистам, в частности к конституционально существующему на поверхности клеток TRAIL [30]. Установлено повышение экспрессии TRAILR2 на гепатоцитах у мышей после перевязки общего желчного протока. Инъекция рекомбинантного TRAIL вызывала апоптоз гепатоцитов у этих животных. Повреждение печени сопровождалось повышением активности аминотрансфераз в крови, чего не наблюдалось в контрольной группе [29]. Как было указано выше, TRAIL способен индуцировать ряд цитопротективных механизмов, в том числе синтез cFLIP, блокирующего DISC. Показано, что желчные кислоты способствуют фосфорилированию cFLIP и, там самым, его инактивации [28].

Выявлено, что в высоких концентрациях желч­ ные кислоты вызывают также и некроз гепатоцитов. Механизм цитотоксического действия при этом отличается от такового при апоптозе. In vitro показано, что важное значение в гибели гепатоцитов имеют окислительный стресс и повышенное образование активных форм кислорода [16]. В аэробной клетке любая из ферментных систем, принимающая участие в передаче электронов, в результате их «утечки» может оказаться источником АФК. Основным генератором АФК являются митохондрии, в которых их образуется до 1–2% от общего количества молекулярного кислорода. Антиоксидантные ферментные системы, существующие в клетке (каталаза, супероксиддисмутаза и глутатионпероксидаза), защищают ее от повреждающего действия АФК [2, 52].

Установлено, что инкубация первичной культуры гепатоцитов с гликохенодезоксихолевой кислотой приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона в клетках. Причем потери глутатиона зависят от концентрации кислоты и длительности инкубации. Причины снижения уровня глутатиона при этом не до конца выяснены. Предполагается несколько возможных механизмов: 1) повышенное образование окисленной формы глутатиона; 2) связывание

восстановленной формы глутатиона желчными кислотами; 3) внеклеточные потери восстановленной и/или окисленной формы глутатиона. Уменьшение уровня глутатиона наблюдается как при высоких (500 µmol/L), так и при низких (125 µmol/L) концентрациях гидрофобных желчных кислот. Это означает, что снижение концентрации глутатиона в клетке не является решающим в выборе варианта клеточной гибели. В то же время предварительное полное связывание глутатиона галогеналканом или 1-бромгептаном вызывает некроз гепатоцитов независимо от концентрации желчной кислоты, но не в контроле [26]. Интересен тот факт, что прямой и непрямой билирубин выполняет в гепатоцитах роль акцептора АФК. Показано, что при инкубации первичной культуры гепатоцитов со 100 µmol/L гликохенодезоксихолевой кислоты добавление в среду 100 µmol/L прямого или непрямого билирубина почти полностью блокирует образование АФК. Апоптоз гепатоцитов снижается при этом только на 25–35% [23].

Таким образом, гидрофобные желчные кислоты являются основным токсическим агентом, приводящим к различным вариантам гибели гепатоцитов при холестазе. Они активируют рецепторы смерти и запускают каскад реакций, приводящих к гибели клетки. Неотъемлемыми компонентами этого процесса являются повышение проницаемости мембран митохондрий, выделение проапоптотических факторов, генерация активных форм кислорода, нарушение окислительного фосфорилирования и образования энергии. Наиболее ранний признак нарушения функции митохондрий – снижение трансмембранного потенциала. Кроме того, соли гидрофобных желчных кислот способны напрямую нарушать функцию митохондрий. Инкубация изолированных митохондрий гепатоцитов с желчными кислотами вызывает повышение проницаемости митохондриальных мембран и снижение трансмембранного потенциала, зависящие от концентрации кислоты и продолжительности инкубации [46]. Оба процесса ингибируются при добавлении к среде циклоспорина А, который специфически блокирует повышение проницаемости митохондриальных мембран, а также выделение цитохрома с и активацию каспазы-3, т. е. как апоптоз, так и некроз гепатоцитов. Причем циклоспорин А блокирует активацию митохондриальных факторов как при Fas-, так и при TNFα-индуцированной гибели клеток [35].

Тем не менее, кроме активации факторов, приводящих к гибели гепатоцитов, желчные кислоты способны индуцировать цитопротективные механизмы. В гепатоцитах мышей, после перевязки общего желчного протока, повышается экспрессия NF-kВ. Подавление активности NF-kВ с помощью I-kВα sr усиливает активацию

16

5, 2006	Лекции и обзоры

каспазы-3 в 2,5 раза, а соответственно и гибель клеток. Как было отмечено выше, основным механизмом активации NF-kВ является путь

TNF-R1–TRAF2–RIP1, инициируемый TNFα.

В то же время установлено, что у нокаутных по гену TNF-R1 мышей при обструктивном холе­ стазе повышается экспрессия NF-kВ, сравнимая с таковой у интактных животных. Это дает основания­ предполагать, что роль активаторов NF-kВ при этом играют желчные кислоты [40].

Обструктивные заболевания желчевыводящих путей нередко осложняются эндотоксинемией и повышением уровня провоспалительных цитокинов в крови, в частности TNFα [33]. Как уже было сказано, рецепторы к TNFα экспрессируются на поверхности гепатоцитов. Повышение уровня TNFα в крови запускает каскад реакций, связанных с активацией TNF-R1-рецепто- ров. Показано, что эндотоксинемия при холе­

Список литературы

1.Аруин Л.И. Апоптоз и патология печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 1998. – Т. 8,

№2. – С. 6–11.

2.Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения). – М.: Медицина, 1989. – 368 с.

3.Бойчук С.В. Механизмы апоптоза лимфоцитов при

атопических заболеваниях: Дис. … д-ра мед. наук.

–Казань, 2002. – 234 с.

4.Данченко Е.О. Влияние препаратов желчных кислот на биосинтез ДНК, апоптоз и некроз гепатоцитов in vitro // Вопр. мед. химии. – 2001. – Т. 47, № 2. – С. 236– 242.

5.Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с.

6.Мачулин Е.Г. Механическая желтуха неопухолевого генеза. – Минск: Харвест, 2000. – 160 с.

7.Серов В.В., Лапиш К. Морфологическая диагностика заболеваний печени / АМН СССР. – М.: Медицина, 1989. – 336 с.

8.Anwer М.S., Zimniak P., Lester R. Hepatotoxic bile acids increase cytosolic Ca++ activity of isolated rat hepatocytes // Hepatology. – 1988. – Vol. 8, N 4.

–P 887–891.

9.Arora A.S., Jones B.J., Patel T.C. et al. Ceramide induces hepatocyte cell death through disruption of mitochondrial function in the rat // Hepatology. – 1997.

–Vol. 25, N 4. – P. 958–963.

10.Attili A.F., Angelico М., Catafora A. et al. Bile acidinduced liver toxicity: relation to the hydrophobichydrophilic balance of bile acids // Med. Hypotheses.

–1986. – Vol. 19, N 1. – P. 57–69.

11.Azzaroli F., Mehal W., Boyer J.L. Ursodeoxycholic acid diminishes Fas-ligand-induced apoptosis in mouse hepatocytes // Hepatology. – 2002. – Vol. 36, N 1.

–P. 49–54.

12.Benz C., Stiehl A. Effect of tauroursodeoxycholic acid on bile-acid-indused apoptosis and cytolysis in rat hepatocytes // J. Hepatol. – 1998. – Vol. 28, N 1. – P. 99–106.

13.Berghe Т.V., van Loo G., Saelens X. et al. Differential signaling to apoptotic and necrotic cell death by Fasassociated death domain protein FADD // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, N 9. – P. 7925–7933.

14.Beuers U., Probst I., Paumgartner G. Modulation of protein kinase С by taurolithocholic acid in isolated rat hepatocytes // Hepatology. – 1999. – Vol. 29, N 2. – P. 477–482.

стазе усиливает процессы апоптоза гепатоцитов и способствует развитию их некроза [44]. Гибель клеток при воздействии TNFα происходит по вышеописанным механизмам.

На основании вышеизложенного можно заключить, что гибель гепатоцитов в патологических условиях может протекать по варианту как апо­ птоза, так и некроза. Вариант клеточной смерти зависит от характера, силы и длительности повреждающего воздействия. Это характерно и для гибели гепатоцитов в условиях холестаза, когда на клетки оказываются множественные влияния. Однако следует признать ведущую роль солей желчных кислот в гибели гепатоцитов при заболеваниях печени, сопровождающихся нарушением оттока желчи, так как накопление их в печеночных клетках является специфичным признаком холестаза.

15.Beuers U., Throckmorton D.C., Kullak-Ublick G.A. et al. Tauroursodeoxycholic acid activates protein kinase C in isolated rat hepatocytes // Gastroenterology. – 1996.

–Vol. 110, N 5. – P. 1553–1563.

16.Borgognone M., Roma M.G. Signaling modulation of bile salt-induced necrosis in isolated rat hepatocytes // Toxicol. Sci. – 2005. – Vol. 83, N l. – P. 114–125.

17.Combettes L., El-linger S., Claret M. Release of calcium from the endoplasmatic reticulum by bile acids in rat liver cells // J. Biol. Chem. – 1988. – Vol. 263, N 5.

–P. 2299–2303.

18.Danchenko E., Dargel R. Effect of bile acids on the proliferative activity and apoptosis of rat hepatocytes // Exp. Toxicol. Pathol. – 2001. – Vol. 53, N 2–3. – P. 227–233.

19.Ding W.X., Yin X.M. Dissection of the multiple mechanisms of TNF-a-induced apoptosis in liver injury // J. Cell Mol. Med. – 2004. – Vol. 8, N 4. – P. 445–454.

20.Faubion W.A., Guicciardi M.E., Miyoshi H. et al. Toxic bile salts induce rodent hepatocyte apoptosis via

direct activation of Eas // J. Clin. Invest. – 1999.

–Vol. 103, N l. – P. 137–145.

21.Fricker G., Landmann L., Meier P.J. Extrahepatic obstructive cholestasis reverses the bile salt secretory polarity of rat hepatocytes // J. Clin. Invest. – 1989.

–Vol. 84. – P. 876–885.

22.Garcia-Ruiz C., Colell A., Mart M. et al. Direct effect of ceramide on the mitochondrial electron transport chain leads to generation of reactive oxygen species // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272, N 17. – P. 11369–11377.

23.Granato A., Gores G., Vilei M.Т. et al. Bilirubin inhibits bile acid induced apoptosis in rat hepatocytes // Gut. – 2003. – Vol. 52. – P. 1774–1778.

24.Guicciardi M.E., Miyoshi H., Bronk S.F. et al. Cathep­ sin В contributes to TNF-α-mediated hepatocyte apoptosis by promoting mitochondrial release of cytochrome с // J. Clin. Invest. – 2000. – Vol. 106, N 9. – P. 1127–1137.

25.Guicciardi M.E., Miyoshi H., Bronk S.F., Gores G.J.

Cathepsin В knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury // Am. J. Pathol. – 2001. – Vol. 159, N 6. – P. 2045–2054.

26. Gumpricht E., Devereaux M.W., Dahl R.H., Sokol R.J. Glutathione status of isolated rat hepatocytes affect bile acid-induced cellular necrosis but not apoptosis // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2000. – Vol. 164.

– P. 102–111.

17

Лекции и обзоры

5, 2006

27.Hayden M.S., Ghosh S. Signaling to NF-kВ // Genes Dev. – 2004. – Vol. 18. – P. 2195–2224.

28.Higuchi H., Bronk S.F., Gores G.J. Bile acids stimulate cFLlP phosphorylation enhancing TRAIL-mediated apoptosis // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, N 1.

–P. 454–461.

29.Higuchi H., Bronk S.F., Gores G.J. Cholestasis increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-R2/DR5 expression and sensitizes the liver to TRAIL-mediated cytotoxicity // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2002. – Vol. 303, N 2. – P. 461–467.

30.Higuchi H., Bronk S.F., Takikawa Y. et al. The bile acid glycochenodeoxycholate induces TRAIL-receptor 2/ DR5 expression and apoptosis // J. Biol. Chem. – 2001.

–Vol. 276, N 42. – P. 38610–38618.

31.Higuchi H., Gores G. Bile acid regulation of hepatic physiology IV. Bile acids and death receptors // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2003. – Vol. 284.

–P. 734–738.

32.Higuchi H., Miyoshi H., Gores G. Bid antisense attenuates bile acid-induced apoptosis and cholestatic liver injury // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2001. – Vol. 299, N 3. – P. 866–873.

33.Kimmings A.N., van Deventer S.J.H., Obertop H. et al. Endotoxin, cytokines, and endotoxin binding protein in obstructive jaundice and after preoperative biliary drainage // Gut. – 2000. – Vol. 46. – P. 725–731.

34.LeBlanc H.N., Ashkenazi A. Apo2L/TRAIL and its death and decoy receptors // Cell Death. Diff. – 2003.

–Vol. 10. – P. 66–75.

35.Lemasters J.J. Mechanisms of hepatic toxicity V. Necroapoptosis and the mitochondrial permeability transition: shared pathways to necrosis and apoptosis // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 1999. – Vol. 276. – P. 1–6.

36.Lemasters J.J., Qian Т., Bradham C.A. et al. Mitochondrial dysfunction in the pathogenesis ofnecrotic

and apoptotic cell death // J. Bioenerg. Biomembr.

– 1999. – Vol. 31, N 4. – P. 305–319.

37.Li S., Zhao Y., He X. et al. Relief of extrinsic pathway inhibition by the Bid-dependent mitochondrial release of Smac in Fas-mediated hepatocyte apoptosis // J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277, N 30. – P. 26912–26920.

38.Micheau O., Tschopp J. Induction of TNF-receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complex // Cell. – 2003. – Vol. 114, N 2. – P. 148–150.

39.Miyoshi H., Rust C., Gores G.J. Hepatocyte apoptosis after bile duct ligation in the mouse involves Fas // Gastroenterology. – 1999. – Vol. 117, N 3. – P. 732– 736.

40.Miyoshi H., Rust C., Guicciardi M.E., Gores G.J. NFkВ is activated in cholestasis and functions to reduce liver injury // Am. J. Pathol. – 2001. – Vol. 158, N 3. – P. 967–975.

41.Moazzam F.N., Gamelli R.L., Ding J.W. Endotoxin potentiates hepatocyte apoptosis in cholestasis // J. Am. Coll. Surg. – 2002. – Vol. 194, N 6. – P. 731–739.

42.Ni R., Tomita Y., Matsuda K., Nagata S. Fas-mediated apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes // Exp. Cell Res. – 1994. – Vol. 215, N 2. – P. 332–337.

43.Ogasawara J., Watanabe-Fukunaga R., Itoh N. et al. Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice // Nature.

–1993. – Vol. 364, N 6440. – P. 806–809.

44.Patel T. Apoptosis in hepatic pathophysiology // Clin. Liver Dis. – 2000. – Vol. 4, N 2. – P. 295–317.

45.Roberts L.R., Мао F., Gores G.J. Cathepsin В contributes to bile salt-induced apoptosis of rat hepatocytes // Gastroenterology. – 1997. – Vol. 113, N 5. – P. 1714–1726.

46.Rolo A.P., Oliveira P.J., Moreno A.J.M., Palmeira

С.М. Bile acids affect liver mitochondrial bioenergetics: possible relevance for cholestasis therapy // Toxicol. Sci. – 2000. – Vol. 57, N l. – P. 177–185.

47.Scaffidi С., Fulda S., Debatin K.M. et al. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways // EMBO J. – 1998.

–Vol. 17, N 6. – P. 1675–1687.

48.Schmucker D.L., Ohta M., Kanai S. et al. Hepatic injury induced by bile salts: correlation between biochemical

and morphological events // Hepatology. – 1990.

– Vol. 12, N 5. – P. 1216–1221.

49.Schuchmann M., Varfolomeev E.E., Rueckert F. et al. Dominant negative MORT1/FADD rescues mice from

CD95 and TNF-induced liver failure // Hepatology.

–2003. – Vol. 37, N 1. – P. 129–135.

50.Sodeman Т., Bronk S.F., Roberts P.J. et al. Bile salts mediate hepatocyte apoptosis by increasing cell surface trafficking of Fas // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2000. – Vol. 278. – P. 992–999.

51.Spivey J.R., Bronk S.F., Gores G.J.

Glycochenodeoxycholate-induced lethal hepatocellular injury in rat hepatocytes // J. Clin. Invest. – 1993.

–Vol. 92. – P. 17–24.

52.Thannickal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signaling // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. – 2000. – Vol. 279. – P. 1005–1028.

53.Trump B.F., Berezesky I.K. The role of cytosolic Ca2+ in cell injury, necrosis and apoptosis // Curr. Opin. Cell Biol. – 1992. – Vol. 4, N 2. – P. 227–232.

54.Wajant H., Pfizenmaier K., Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling // Cell Death. Diff. – 2003.

–Vol. 10. – P. 45–65.

55.Werneburg N.W., Guicciardi M.E., Bronk S.F., Gores G.J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin В dependent // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2002. – Vol. 283.

–P. 947–956.

56.Werneburg N.W., Guicciardi M.E., Yin X.M., Gores G.J. TNF-α-mediated lysosomal permeabilization is FAN and caspase 8/Bid dependent // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2004. – Vol. 287. – P. 436–443.

57.Yin X.M. Signal transduction mediated by Bid, a prodeath Bcl-2 family proteins, connects the death receptor

and mitochondria apoptosis pathways // Cell Res.

– 2000. – Vol. 10. – P. 161–167.

58.Yin X.M., Ding W.X. Death receptor activationinduced hepatocyte apoptosis and liver injury // Curr. Mol. Med. – 2003. – Vol. 3. – P. 491–508.

59.Yin X.M., Wang K., Korsmeyer S.J. Bid-deficient mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis // Nature. – 1999. – Vol. 400, N 6747. – P. 886–891.

60.Zimniak P., Little J.M., Oelberg D.G. et al. Taurineconjugated bile acids act as Ca2+ ionophores // Biochemistry. – 1991. – Vol. 30, N 35. – P. 8598– 8604.

Molecular mechanisms of apoptosis and necrosis

of hepatocytes. Features of destruction of hepatocytes in obstructive cholestasis

V.G. Davydov, S.V. Boychuk, R.Sh. Shaymardanov, M.M. Minnebayev

The review presents information on main molecular mechanisms of apoptosis and necrosis of hepatocytes. Cascades of the reactions causing destruction of liver

18

5, 2006	Лекции и обзоры

cells and initiated by Fas , TNF and TRAIL receptors activation, which are expressed in hepatocytes in pathological conditions are discussed. The role of mitochondrial factors of death of cells is evaluated. The special attention is given to mechanisms of hepatocyte destruction in obstructive cholestasis. Leading role of hydrophobic bile acids in destruction of hepatocytes is demonstrated at disorders of bile outflow.

Key words: hepatocytes, apoptosis, necrosis, bile acids, cholestasis.

19

Оригинальные исследования

5, 2006

УДК 616.36-002.14:578.891]-036.85-074:616.153.915(045)

Состояние структурных и функциональных показателей

биомембран у реконвалесцентов с острым гепатитом В

В.И. Кузнецов1, Н.Д. Ющук2, В.В. Моррисон1

(1Саратовский государственный медицинский университет, 2Московский государственный медико-стоматологический университет)

У 39 реконвалесцентов, перенесших неосложненный острый гепатит В, в ходе проведенного исследования выявлены сдвиги структурно-функциональных характеристик эритроцитарных биомембран, указывавшие на свертывание цитолитического синдрома в гепатоцитах: при среднетяжелой форме – в промежутке 3–6 мес реконвалесценции, при тяжелой форме – на 9–12-м месяцах периода выздоровления, что обосновывает сроки применения мембраностабилизирующих и антиоксидантных лекарственных средств.

Ключевые слова: острый гепатит В, цитолиз гепатоцитов, биомембраны, фосфолипиды, хемилюминесценция, свободнорадикальное окисление.

ри

гепатите В в осно-

(СРО) в крови и биомембранах,

20 – со среднетяжелой и 8 –

ве

формирования пато-

главным образом за счет интен-

с тяжелой формой болезни).

Плогических изменений в

сификации

липопероксидации,

Исследования проведены в 1–2-й

печени

лежит

цитолитический

что определяет

возможность

месяц, 3–6-й и 9–12-й меся-

синдром,

характеризующий-

оценки

данных

процессов для

цы

периода

реконвалесценции.

ся повышением

проницаемости

индикации

цитолиза гепатоци-

В качестве контрольной группы

мембран гепатоцитов, выходом в

тов [1, 2, 5, 12, 13, 15, 18].

обследованы 20 здоровых лиц.

кровь индикаторных ферментов

В связи с изложенным целью

Для

изучения структурных

и различных

внутриклеточных

работы явилось изучение про-

компонентов мембран, полу-

метаболитов, развитием дистро-

цессов

СРО

с

параллельным

чения эритроцитов, выделе-

фических

и некробиотических

определением структурных фос-

ния

эритроцитарных

мембран

процессов

в

гепатоцитах

[4,

фолипидов

в

эритроцитарных

использовались

биохимические

7, 23].

мембранах

у

реконвалесцентов

методы, включая тонкослойную

В механизме

повреждения

с различными формами неос-

хроматографию [14, 16, 21].

клеток, в том числе гепатоцитов,

ложненного острого гепатита В,

Основываясь на предположе-

одно из ведущих мест прина-

что позволило, с одной сторо-

нии, что эритроцитарные мемб-

длежит

избыточному

накопле-

ны, оценить степень поражения

раны косвенно отражают струк-

нию активных форм кислорода,

гепатоцитов, с другой, провес-

турно-функциональные харак-

образуемых в результате перок-

ти индикацию полноты восста-

теристики биомембран

клеточ-

сидного

окисления

ненасыщен-

новления структурно-функцио-

ного пула организма (так как

ных жирных кислот в структур-

нальных характеристик биомем-

значительная

часть

структуры

ных липидах мембран [6, 10,

бран.

плазматических

и

внутренних

11, 17].

мембран

представлена

фосфо-

Рядом

авторов

при

острых

Материал и методы

липидами) [3,

22],

определяли

и хронических

формах гепати-

общие

фосфолипиды

(ОФЛ)

исследования

та В установлен факт изменения

и их фракции: лизофосфати-

интенсивности

процессов

сво-

Обследовано 39 реконвалес-

дилхолин (ЛФХ), сфингомие-

боднорадикального

окисления

центов

(11

человек с легкой,

лин

(СМ),

фосфатидилхолин

20