2 курс / Гистология / Компьютерная_видеомикроскопия_живых_клеток_Дромашко_С_Е_,_Квитко

Таблица 2 – Изменения активности бета-гал в процессе культивирования стареющей и иммортализированной клеточных популяций

	Тип клеток		Срок куль-	Численность	Количество	Доля	бета-
			тивирования	клеток	бета-гал	гал	пози-
					позитивных	тивных
					клеток	клеток, %
	Стареющие	фибро-	6 суток	300	1	0,3±0,3
	бласты эмбриона че-		20 суток	179	26	14,5±2,6
	ловека		34 суток	142	104	73,2±3,7
	Иммортализированная		2 суток	151	37	24,5±3,5
	линия клеток	из эм-
			15 суток	92	24	26,1±4,6
	бриона мыши

Рисунок 13 – Гетерогенность клеток иммортализированной линии из эмбриона мыши по активности бета-гал

Наличие и относительное постоянство бета-гал позитивных клеток в нестареющей культуре свидетельствует о присутствии в иммортальных популяциях двух субпопуляций – стволовой линии и фракции стареющих клеток. Данному выводу соответствуют и результаты анализа клеточной генеалогии иммортальной культуры. Потомство одних клеток характеризовалось высокой пролиферативной активностью, в то время как потомство других в основном было представлено медленно делящимися клетками. Следовательно, в иммортализированной популяции могут существовать субклоны, в которых ослабление пролиферативной активности наследуется и прогрессирует, что

21

может положительно коррелировать с экспрессией маркера клеточного старения, каким является ген бета-галактозидазы.

Важным аспектом антираковой терапии является гетерогенность популяции раковых клеток. Клеточная фракция, представленная раковыми стволовыми клетками, может отвечать за неограниченную пролиферацию опухоли. Нами разработаны методы анализа клоновой структуры клеточных популяций на основе компьютерной видеомикроскопии живых клеток. Установлено, что часть клеток линии рака легкого А549 формирует клоны, которые после нескольких репликаций стареют и погибают, в то время как другие клетки (иногда небольшая часть) генерируют бесконечно растущие (потенциально бессмертные) клоны. В этой связи особый интерес имеет поиск средств, индуцирующих дифференцировку раковых стволовых клеток в направлении клеточного старения и гибели. Натуральные и синтетические полинуклеотиды (ДНК и РНК) являются перспективным источником для создания антираковых препаратов. Нами обнаружен резко выраженный ингибирующий эффект ДНК эритроцитов цыплят (100 мкг/мл), добавляемой в среду для культивирования клеток НеLа (рисунок 14).

а – культура НеLа (посевная плотность 5000 клеток на квадратный сантиметр); б – культура НеLа с добавлением ДНК (100 мкг/мл); культивирование в течение 7 суток; в – динамика плотности культуры НеLа (посев 10000 кл/см2) в контроле (1) и с добавлением ДНК эритроцитов цыплят (2)

Рисунок 14 – Антираковый эффект ДНК эритроцитов цыплят

Представляется целесообразной разработка клеточных систем для подбора полинуклеотидных препаратов (варьирующих по нуклеотидной после-

22

довательности и размеру фрагментов), направляющих эпигенетическую изменчивость раковых клеток в сторону пролиферативного старения и гибели.

Контрольные вопросы

1.Что такое конфокальная микроскопия?

2.Чем инвертированный световой микроскоп отличается от обычного?

3.Какой должна быть концентрация СО2 в атмосфере культурального сосуда для обеспечения нормального роста клеток?

4.Как длительность видеосъемки зависит от задачи исследования?

5.Для чего используется тест на экспрессию гена бета-галактозидазы в отдельных клетках?

6.Что такое «лимит Хайфлика»?

7.В чем проявляется ограниченность метода анализа фиксированных клеточных культур?

8.Как изменения клеточного фенотипа связаны с процессами старения

итрансформации клеток?

9.Какие параметры клеток можно исследовать с помощью прижизненной компьютерной видеомикроскопии?

10.Наследуются ли морфотипы в клеточных поколениях?

11.Что такое неозис?

12.Происходит ли немитотическое образование трансформированных

клеток?

13.Что такое иммортализированные линии клеток?

14.Какие нарушения митоза наблюдаются в иммортализированных ли-

ниях?

15.Стареют ли клетки в иммортализированных линиях?

2 ПРИМЕРЫ ПРИКЛАДНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОМПЬЮТЕРНОЙ ВИДЕОМИКРОСКОПИИ ЖИВЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

2.1 Медицинская трансплантология

Перспективы развития клеточных технологий для лечения ряда заболеваний во многом зависят от разработки нетравматичных и экономичных методов получения значительных количеств аутологичных (собственных) клеток, культивируемых in vitro. Применение именно аутологичных клеток особенно важно, поскольку при этом устраняются проблемы, связанные с иммунными реакциями, вызываемыми введением в организм генетически ино-

23

родного клеточного материала. В этом плане особый интерес представляет возможность наработки in vitro клеток из фолликулов волос человека.

Фолликулы волос человека являются источником мультипотентных стволовых клеток, способных в подобранных условиях культивирования дифференцироваться в клетки различных типов, включая нервные. Особый интерес с практической точки зрения вызывает возможность получения аутологичных клеток не из хирургически извлекаемого участка скальпа, а из фолликулов выщипываемых волос.

При получении культуры клеток из малого количества исходного материала тщательное исследование клеточных культур с помощью компьютерной видеомикроскопии значительно повышает эффективность работы, поскольку при отсутствии условий культивирования, оптимизированных для нового источника клеток, критически важным является обнаружение хотя бы одного небольшого размножающегося клеточного клона, из которого можно в дальнейшем получить клеточную линию. В процессе культивирования нескольких фолликулов волос затылка (извлеченных пинцетом) с помощью компьютерной видеомикроскопии нами было обнаружено несколько небольших клеточных клонов, которые вскоре прекратили делиться, причем началась убыль клеток в результате апоптоза. На этой стадии в культуральную среду была добавлена полученная в нашей лаборатории жидкость из фолликулов яичника коров, обладающая антиапоптозным и пролиферативным эффектом на клетки гранулезы из яичника коров. В результате регулярного просмотра клеточных культур в сочетании с видеосъемкой было обнаружено, что клетки одного из клонов продолжали делиться. После достижения этим клоном значительного размера некоторые одиночные клетки и небольшие клеточные агрегаты начали открепляться от ростового субстрата в культуральную среду, а затем давать начало новым клонам в различных местах ростовой поверхности, что также регистрировалось компьютерной видеозаписью (рисунок 15).

Таким образом, была получена полусуспензионная культура клеток, в которой клетки сохраняют жизнеспособность и пролиферативный потенциал как на субстрате, так и в культуральной среде. Благодаря этому свойству данную культуру удобно размножать без использования трипсина (который используется для снятия клеток с ростового субстрата) путем перенесения среды с клетками в новый культуральный сосуд.

24

100 мкм

а – 0 дней

б – 2 дня

в – 4 дня

г – 6 дней

Рисунок 15 – Рост клона клеток фолликулов волос человека

Для изучения способности полученной линии клеток из фолликулов волос к дифференцировке было использовано многократное компьютерное фотографирование многих участков ростовой поверхности в последовательные периоды культивирования клеток. В результате установлено, что некоторые клетки дифференцируются по нейральному типу (морфологическое сходство с нейронами и олигодендроцитами) (рисунок 16). Эти клетки являются постмитотическими, поскольку утрачивают способность к делению.

Для поиска удобного режима культивирования, при котором частота дифференцировки увеличивается, клетки культивировали при пониженной температуре (30оС). Этот прием мы использовали, опираясь на данные о дифференцировке стволовых клеток тератокарциномы мыши при температуре 31оС. Кроме того, понижение температуры после начального периода клеточной пролиферации при 37оС часто применяется для увеличения продукции

25

рекомбинантных белков. При этом клетки продолжительное время находятся в стационарной фазе, когда их деление прекращается.

а – 0 дней

б – 2 дня

100 мкм

в – 4 дня

г – 6 дней

Рисунок 16 – Дифференцировка клеток фолликулов волос человека

С помощью последовательного ежедневного компьютерного фотографирования многих участков культур клеток фолликулов волос, выдерживаемых при 30оС в течение нескольких дней, была обнаружена массовая нейральная дифференцировка клеток. После обратного перенесения культур в нормальные температурные условия (37оС) дифференцированные клетки никогда не делились и нередко достигали очень крупных размеров, существуя в культуре до нескольких десятков дней. При этом были установлены некоторые неизвестные ранее особенности процесса дифференцировки. Так, часто обнаруживались пары близко расположенных очень сходных по морфологии дифференцированных клеток, связанных друг с другом посредством межклеточных контактов. Это свидетельствует о симметричной дифференцировке,

26

при которой дифференцируются обе сестринские клетки. В этом плане следует отметить, что в последние годы появились работы, демонстрирующие случаи симметричной дифференцировки стволовых клеток, хотя ранее полагали, что дифференцировка происходит только асимметричным путем, когда одна из клеток остается недифференцированной. Нами был зарегистрирован также факт слияния двух сестринских дифференцированных клеток в двуядерную клетку (сохранивших связь в виде тонкой нитевидной цитоплазматической перетяжки), причем оба ядра располагались рядом. Данное наблюдение демонстрирует один из механизмов образования постмитотических полиплоидных клеток.

2.2 Клеточные технологии для животноводства

Важнейшим ресурсом повышения эффективности производства животноводческой продукции являются технологии, основанные на последних достижениях биологической науки. В этом плане особые надежды связаны с развитием биотехнологий, основанных на продукции in vitro эмбрионов для последующей трансплантации животным-реципиентам. Этот подход направлен на максимальное использование генетического потенциала отдельных, наиболее высокопродуктивных, доноров яйцеклеток для улучшения продуктивности популяций сельскохозяйственных животных. Однако достижения репродуктивной биотехнологии на основе производства эмбрионов in vitro во многом еще не реализованы в практике племенного дела и селекции сельскохозяйственных животных. Это в значительной степени связано с недостаточно высоким выходом зародышей, достигших стадии бластоцисты и пригодных для трансплантации. Для преодоления раннего блока дробления и развития эмбрионов до стадии бластоцисты представляется перспективным использование совместного культивирования зародышей с культурами соматических клеток, получаемых из репродуктивного тракта животных того же вида, что и яйцеклетки – например, клеток яйцевода, кумулюса или гранулезы, находящихся в фолликулярной жидкости, окружающей ооцит-кумулюсные комплексы. «Поддерживающие» культуры могут создавать благоприятный для развития зародышей сигнально-информационный фон путем продуцирования ростовых факторов. Это определяет актуальность разработки методов получения культур клеток гранулезы для использования в технологии продуцирования эмбрионов животных, в частности крупного рогатого скота.

Для получения культуры клеток гранулезы коров нами был принят модифицированный метод Langhout et al. (1991). Существенной особенностью нашего подхода является добавление в культуральную среду фолликулярной жидкости (стерилизованной фильтрацией через бактериальный фильтр). Этот

27

прием был использован на основании данных швейцарского исследователя Мишеля Хорисбергера (M. Horisberger) о том, что в фолликулярной жидкости содержатся вещества, ингибирующие апоптоз и стимулирующие пролиферацию клеток, хотя швейцарец работал с фолликулами свиней, а не крупного рогатого скота.

Культуры гранулезных клеток анализировали с помощью компьютерной видеосъемки (рисунок 17). Было обнаружено, что добавление фолликулярной жидкости в культуральную среду обеспечивает интенсивную пролиферацию клеток и возможность их продолжительного культивирования без признаков клеточного старения. Так, в течение первых 10 дней культивирования при добавлении в среду трети фолликулярной жидкости образовался густой клеточный монослой, а затем были получены длительно культивируемые культуры, поддерживаемые не только с помощью трипсиновых пересевов, но и менее трудоемким приемом – еженедельной сменой среды в одном и том же культуральном сосуде. В то же время без применения фолликулярной жидкости клетки сначала размножаются, но затем быстро стареют, т.е. увеличиваются в размерах и прекращают делиться.

а – 0 ч. 0 м.

б – 1 ч. 12 м.

в – 2 ч. 0 м.

г – 4 ч. 17 м.

Примечание. Одна из клеток принимает шаровидную форму (б) и делится на две дочерние клетки (в), которые затем распластываются на ростовом субстрате (г). Соседняя (справа) крупная клетка с высокой оптической плотностью не делится и крайне медленно изменяет форму. Анализ компьютерных видеозаписей позволяет заключить, что такие клетки являются исключительно постмитотическими, т.е. никогда не делятся – даже в присутствии омолаживающих факторов фолликулярной жидкости. Стрелками указаны материнская и сестринские клетки

Рисунок 17 – Митотическое деление крупной клетки в культуре с добавлением третьей части фолликулярной жидкости к культуральной среде

28

Особенно интересно, что фолликулярная жидкость оказалась эффективной не только при ее исходном добавлении в культуральную среду. Добавление одной трети фолликулярной жидкости обеспечивало ярко выраженный омолаживающий эффект на постаревшие клетки. Так, в одном из экспериментов клетки гранулезы после 13 дней культивирования без добавлении фолликулярной жидкости прекратили пролиферацию и приобрели увеличенный размер и морфологию, характерную для постаревших клеток. Однако добавление среды с содержанием третьей части фолликулярной жидкости после очередных 8 дней культивирования привело к возобновлению пролиферации, и количество клеток увеличилось. На компьютерных видеозаписях было обнаружено много митотических делений, причем в деление вступали не только мелкие, но и крупные постаревшие клетки. В дальнейшем (наблюдение до 40 дней) в данную культуру при еженедельной смене среды добавляли 10% фолликулярной жидкости. В течение этого срока в культуре увеличивалось количество густых монослойных участков, состоящих в основном из мелких клеток, хотя были также отдельные крупные постаревшие клетки, которые не делились даже в присутствии омолаживающих факторов фолликулярной жидкости.

Таким образом, с помощью компьютерной видеомикроскопии живых клеток разработан способ получение долговременной культуры клеток гранулезы из фолликулов яичника крупного рогатого скота на основе использования стерилизованной фильтрацией жидкости из фолликулов яичника коров.

2.3 Токсикологическое тестирование веществ, поступающих в окружающую среду

Культуры клеток человека находят широкое применение в практике токсикологических испытаний по выявлению способности ряда ксенобиотиков оказывать цитопатические и генотоксические эффекты. С помощью компьютерной видеомикроскопии, при соблюдении отработанных методических приемов, можно с высокой количественной точностью изучать воздействие изучаемых веществ на интенсивность пролиферации, апоптоз (клеточную гибель), дифференцировки и характер локомоторной активности клеток. Все эти характеристики связаны с рядом важных физиологических процессов. Например, только одна из перечисленных характеристик – локомоторная активность – важна в иммунном ответе, карциногенезе и метастазировании, заживлении ран и тканевой регенерации, а также в ряде процессов, происходящих при индивидуальном развитии организма.

Прижизненный анализ клеточных популяций может быть высокоэффективным подходом в токсикологическом и фармакологическом тестирова-

29

нии. Так, с помощью витального анализа клеток мы исследовали эффекты 24эпибрассинолида на пролиферацию эмбриональных фибробластов человека и мыши. Проведено также исследование действия противоопухолевого препарата диазиквона на клетки линии рака легкого человека А549 (рисунки

18 и 19).

100 мкм

Рисунок 18 – Линия рака легкого А549: воздействие 1 мгк/мл диазиквона в течение 2 суток резко интенсифицирует процесс клазматоза – отделения фрагментов цитоплазмы

Для выполнения экспериментов по количественному учету клеток в процессе культивирования мы выращиваем клетки при малой плотности (обычно 3–10 клеток на 1 мм2 ростовой поверхности). При этом клетки высеваются в культуральные сосуды со специально изготовленными стеклянными вкладышами (размер 2,5 х 1 см, толщина 1 мм) с квадратными (1х1 мм) ростовыми площадями, разделенными бороздками шириной 0,2 мм и глубиной 0,05 мм (бороздки замедляют перемещение клеток из одного квадрата в дру-

30