6 курс / Кардиология / Хламидийно_ассоциированные_инфекции_Хворик_Д_Ф_
.pdf
|
стоящей инструкции и производителя тест- |
|
систем. |
Противопоказания |
Данный метод для широкого использования не |
для применения |
рекомендуется, предлагается для использования в |
метода |
научных целях и судебной практике. |
Серологические методы диагностики. Единственное достоинство данных методов – это возможность получения результата в день забора материала. В.И. Бедновой и соавт. были предприняты попытки использовать для идентификации трихомонад РИФ. Однако данную реакцию в широкой практике не применяют ввиду сложности, длительности постановки и невозможности стандартизировать антиген, а также субъективизма при оценке результата реакции [4].
Г.А. Дмитриев и соавт. (2005) указали на возможность использования ИФА для диагностики УТ. Выявление иммуноглобулинов класса G в сыворотке проводили с помощью тест-системы ЗАО «Вектор-бест» (Новосибирск). При этом получены данные о перспективности использования данного метода для диагностики трихомониаза[39].
Значительный интерес для выявленияУТ представляет прямой ИФА с целью диагностики антигена в соскобах и в моче. Предварительные исследования продемонстрировали высокий процент положительных результатов ИФА на антиген по сравнению с другими методами диагностики при различных локализациях трихомонад: в уретре, цервикальном канале, влагалище. Однако говорить о широком практическом применении данных методик преждевременно [39].
Молекулярно-биологические методы диагностики. К
недостаткам ПЦР-анализа и ДНК-гибридизации в качестве отборочного теста при массовых скрининговых обследованиях относится дороговизна исследования и недостаточная информированность специалистов, к преимуществам – высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость, а также простота выполнения анализа и короткое время получения результата (Дмитриев Г.А. и соавт., 2007; Бочарова Е.Н. и соавт., 2001). Чувствительность ПЦР составляет 97%,
специфичность – 98% (Nascvimeto М.С. et al., 1998; Nath К. et al., 2000).
101
Методика молекулярно-биологической диагностики УТ представлена в таблице 24 (приложение №5 к приказу МЗ РБ № 487 от 20 мая 2009 г.).
Таблица 24 – Методика молекулярно-биологической диагностики УТ
Название |
|
|
Описание |
|
Принцип |
Диагностика T.vaginalis посредством обнаружения в |
|||
|
образцах первичных проб нуклеиновых кислот воз- |
|||
|
будителя. Основные принципы организации ПЦР – |
|||
|
лабораторий |
и |
проведения |
молекулярно- |
|
биологического метода диагностики изложены в ин- |
|||
|
струкции МЗ РБ «Организация работ в лабораториях, |
|||
|
использующих метод полимеразной цепной реакции |
|||
|
(ПЦР)» per. № 090-1008 от 13.11.2008 г. |
|
||
Биологический |
Соскоб эпителиальных клеток из уретры. |
|||
материал для |
Отделяемое из заднего свода влагалища. |
|||
исследования |
Моча. |
|
|
|
Подготовка |
В случае хранения проб в морозильной камере |
|||
проб к иссле- |
пробирки с образцами первичных проб следует |
|||
дованию |
выдержать при комнатной температуре до их |
|||
|
полного оттаивания. Не допускается повторное |
|||
|
замораживание – оттаивание проб. |
|
||
Оборудование, |
1) ПЦР-боксы |
для |
проведения ПЦР-исследований |
|
инструменты и |
(не менее 2 шт.); |
|
|
|
материалы |
2) холодильники на 2–8°С морозильной камерой (не |
|||
|
менее 3 шт.); |
|
|
|
3)твердотельные термостаты для микропробирок (не менее 2 шт.);
4)высокоскоростная (до 14000 об/мин) микроцентрифуга для пробирок типа «eppendorf»;
5)микроцентрифуги-вортексы для микропробирок (не менее 3 шт.);
6)амплификатор (термоциклер) или амплификатор с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени;
7)ПЦР-детектор флуоресценции;
8)источник постоянного тока для электрофореза;
9)камера для горизонтального электрофореза с плашками и гребенками для приготовления геля;
10)трансиллюминатор для детекции продуктов амплификации в агарозном геле;
11)видеосистема для регистрации изображений;
12)компьютер;
102
13)микроволновая печь для приготовления агарозного геля или магнитная плитка-мешалка;
14)одноразовые пластиковые микропробирки типа
«Eppendorf» 1,5 мл;
15)одноразовые пластиковые микропробирки 0,5 или 0,2 мл;
16)наборы автоматических дозаторов переменного объема (отдельно для этапа выделения, амплификации выделенной нуклеиновой кислоты и детекции продуктов амплификации методом гельэлектрофореза);
17)одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема, тестированные на отсутствие ДНК/РНК;
18)одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для дозаторов переменного объема, тестированные на отсутствие ДНК/РНК;
19)стеклянные стаканы;
20)стеклянные колбы;
21)цилиндры;
22)стеклянные палочки;
23)штативы для микропробирок;
24)штативы для автоматических дозаторов;
25)емкости для дезинфекции;
26)дезинфицирующие средства;
27)бактерицидные облучатели;
28)контейнеры для транспортировки образцов первичных проб;
29)средства индивидуальной защиты
Реагент набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для выделения нуклеиновых кислот из проб первичных образцов;
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для проведения амплификации нуклеиновых кислот с детекцией методом гель-электрофореза;
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для проведения амплификации нуклеиновых кислот с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени;
набор реагентов, зарегистрированных в МЗ РБ, для детекции продуктов амплификации методом гель-электрофореза;
дистиллированная вода;
70% этиловый спирт.
103
Подготовка |
к |
Все работы проводятся с использованием одноразо- |
|||||
проведению |
|
вых расходных материалов, спецодежда меняется |
|||||
анализа |
|
при переходе из одного помещения (зоны) в другое. |
|||||
Процедура |
|
Процедура включает в себя следующие этапы: |
|
||||
анализа |
|
— пробоподготовка (выделение нуклеиновых кислот |
|||||
|
|
и удаление ингибиторов ПЦР) из образцов |
|||||
|
|
первичных |
проб |
или |
чистой |
культуры |
|
|
|
микроорганизма; |
|
|
|
|
|
|
|
— проведение амплификации; |
|
|
|
||
|
|
— детекция и учет продуктов амплификации. |
|||||
|
|
Технология проведения этапов анализа описана в |
|||||
|
|
соответствующих инструкциях |
и рекомендациях |
||||
|
|
производителей тест-систем. |
|
|
|
||
|
|
Организацию работ на всех этапах, а также обезза- |
|||||
|
|
раживание проб необходимо проводить в соответст- |
|||||
|
|
вии с инструкцией МЗ РБ «Организация работ в ла- |
|||||
|
|
бораториях, использующих метод полимеразной |
|||||
|
|
цепной реакции (ПЦР)» per. № 090-1008 от |
|||||
|
|
13.11.2008 г. |
|
|
|
|
|
Учет и оценка |
Результаты амплификации анализируют с помощью: |
|
|||||
результатов |
|
гель-электрофореза, |
флуоресцентного |
ПЦР- |
|||
|
|
детектора или с использованием амплификатора с |
|||||
|
|
детекцией продуктов амплификации в режиме ре- |
|||||
|
|
ального времени. |
|
|
|
|
|
|
|
Проведение учета и оценки полученных результатов |
|||||
|
|
осуществляется согласно инструкциям производите- |
|||||
|
|
лей тест-систем. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Заключение |
|
Нуклеиновая кислота, специфичная для T.vaginalis, |
|||||
лабораторного |
обнаружена. |
|
|
|
|
|
|
исследования |
Нуклеиновая кислота, специфичная для T.vaginalis, |
||||||
|
|
не обнаружена. |
|
|
|
|
|
Контроль |
ка- |
На преаналитическом этапе оценивается: |
|
|
|||
чества |
|
взятие биологического материала в соответствии с |
|||||
|
|
требованиями; |
|
|
|
|
|
выполнение требований хранения и доставки материала в лабораторию;
выполнение требований маркировки проб и соответствия маркировки пробы маркировке направления;
контроль реагентов (внешнее состояние, срок годности), условия и сроки хранения;
качество лабораторной посуды.
104
Мероприятия аналитического этапа:
включение официально зарегистрированных контрольных материалов;
соблюдение технологии выполнения процедуры в соответствии с инструкцией производителя тестсистем;
учет результатов с контрольным материалом и испытуемым образцом в соответствии с официально признанными критериями.
Внутренний контрольный образец, добавляемый на стадии выделения нуклеиновой кислоты, позволяет судить о наличии в пробах веществ, ингибирующих ПЦР, а также о качестве пробоподготовки.
Технология проведения реакции амплификации подразумевает обязательную постановку наряду с опытными пробами положительных и отрицательных контрольных образцов. Положительный контроль этапа амплификации включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца, прошедшего пробоподготовку, вносится контрольный препарат нуклеиновой кислоты.
Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца, прошедшего пробоподготовку, вносится буфер или деионизованная вода. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них специфической нуклеиновой кислоты или клеток возбудителя вследствие контаминации, и для исключения получения ложноположительных результатов. Внутри лабораторный контроль качества проводят не реже 1 раза в месяц путем исследования шифрованных контрольных панелей, содержащих «положительные» и «отрицательные» пробы. Контрольные панели могут быть приготовлены в лаборатории или использованы ре- ференс-панели, зарегистрированные в МЗ РБ.
В рамках внутри лабораторного контроля качества 1 раз в месяц, а также при подозрении и для выявления возможной контаминации лаборатории нуклеиновыми кислотами, следует проводить исследования смывов с рабочих поверхностей и оборудования. Для обеспечения внешнего контроля качества проводимых исследований используются референс-панели, разрешенные к применению на территории РБ.
Мероприятия постаналитического этапа:
105
—правильность внесения результатов в бланк исследования и формулировка лабораторного заключения;
—своевременное доведение информации до врача, назначившего исследование.
Перечень |
|
Появление специфической полосы в отрицательном |
возможных |
|
контроле свидетельствует о наличии контаминации |
ошибок |
при |
реактивов или проб. В этом случае результаты ана- |
выполнении и |
лиза по всем пробам считаются недействительными. |
|
пути их устра- |
Контаминация может быть спорадическая (появле- |
|
нения |
|
ние ложноположительных результатов в некоторых |
|
|
пробах) и тотальная (появление ложноположитель- |
|
|
ных результатов в каждой пробе). Требуется повто- |
|
|
рить анализ проб, а также предпринять меры по вы- |
|
|
явлению источника контаминации. |
|
|
Появление неспецифических продуктов амлифика- |
|
|
ции при их детекции методом электрофореза: допол- |
|
|
нительные полосы. Появление в дорожках неспеци- |
|
|
фических полос на разных уровнях свидетельствует |
|
|
о неверном температурном режиме в ячейках ампли- |
|
|
фикатора, или об отсутствии «горячего старта». При |
|
|
этом необходимо отрегулировать температурный |
|
|
режим в ячейках амплификатора и использовать «го- |
|
|
рячий старт» до начала циклов амплификации. От- |
|
|
сутствие в пробе полос внутреннего контроля и спе- |
|
|
цифического фрагмента амплификации ДНК свиде- |
|
|
тельствует об ошибке в процедуре подготовки кли- |
|
|
нического материала, а результаты, полученные по |
|
|
данной пробе, считаются недействительными. Тре- |
|
|
буется повторить анализ пробы, начиная с этапа вы- |
|
|
деления. |
|
|
При проведении детекции в режиме реального вре- |
|
|
мени значение порогового цикла в пробе выше пара- |
|
|
метра, указанного производителем тест-системы. |
|
|
Следует повторить анализ пробы, начиная с этапа |
|
|
пробоподготовки. |
Однако, учитывая распространенность смешанных инфекций, частой встречаемости «атипичных» трихомонад, при сомнительных результатах культурального исследования для дополнительного контроля следует проводить ПЦРдиагностику в комплексе с микроскопией [39, 134].
106
Заслуживает внимания алгоритм диагностики УТ у мужчин и женщин (рисунки 4 и 5), предложенный Р.А. Раво-
диным (2005).
Рисунок 4 – Алгоритм диагностики УТ у мужчин
107
Рисунок 5 – Алгоритм диагностики УТ у женщин
Клинический протокол диагностики пациентов с УТ в РБ (приложение к приказу МЗ РБ № 1020 от 29.10.2009 г.) представлен в таблице 25 [68].
108
Таблица 25 – Клинический протокол диагностики пациентов с УТ [68]
ЛПУ |
Обязательная |
|
|
Дополнительная |
|
||||
|
|
(по показаниям) |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||
В условиях |
Физикальный осмотр. |
|
Бактериологическое |
иссле- |
|||||
поликлиники |
Исследование |
крови |
на |
дование отделяемого моче- |
|||||
|
антитела к T. pallidum. |
|
половых |
органов |
на |
||||
|
ИФА-ВИЧ. |
|
|
|
T.vaginalis, |
микроскопиче- |
|||
|
ИФА-Hbs антиген, ИФА- |
ское, |
бактериологическое |
||||||
|
HCV. |
|
|
|
исследование, |
МАНК, |
|||
|
Микроскопическое |
ис- |
РИФ, ИФА (на антигены) |
||||||
|
следование |
отделяемого |
на |
ИППП |
(применяется |
||||
|
мочеполовых органов. |
|
один из предложенных ме- |
||||||
|
Микроскопическое |
ис- |
тодов). |
|
|
|
|||
|
следование |
|
нативного |
Исследование |
секрета |
||||
|
мазка отделяемого моче- |
предстательной железы. |
|
||||||
|
половых органов. |
|
Общий анализ крови. |
|
|||||
|
Бактериологическое |
ис- |
Общий анализ мочи. |
|
|||||
|
следование |
отделяемого |
Флюорография. |
|
|
||||
|
мочеполовых органов на |
|
|
|
|
|
|||
|
N.gonorrhoeae. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
МАНК на T.vaginalis. |
|
|
|
|
|
|
||
В условиях |
Физикальный осмотр. |
|
Бактериологическое |
иссле- |
|||||
стационара |
Исследование |
крови |
на |
дование отделяемого моче- |
|||||
|
антитела к T. pallidum. |
|
половых органов |
на |
T. |
||||
|
ИФА-ВИЧ. |
|
|
|
vaginalis, |
микроскопиче- |
|||
|
ИФА-Hbs антиген, ИФА- |
ское, |
бактериологическое |
||||||
|
HCV. |
|
|
|
исследование, |
МАНК, |
|||
|
Микроскопическое |
ис- |
РИФ, ИФА (на антигены) |
||||||
|
следование |
отделяемого |
на |
ИППП |
(применяется |
||||
|
мочеполовых органов. |
|
один из предложенных ме- |
||||||
|
Микроскопическое |
ис- |
тодов). |
|
|
|
|||
|
следование |
|
нативного |
Исследование |
секрета |
||||
|
мазка отделяемого моче- |
предстательной железы. |
|
||||||
|
половых органов. |
|
|
|
|
|
|
||
|
Бактериологическое |
ис- |
|
|
|
|
|
||
|
следование |
отделяемого |
|
|
|
|
|
||
|
мочеполовых органов на |
|
|
|
|
|
|||
|
N.gonorrhoeae. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Общий анализ крови. |
|
|
|
|
|
|
||
|
Общий анализ мочи. |
|
|
|
|
|
|
||
|
Флюорография. |
|
|
|
|
|
|
||
|
МАНК на T.vaginalis. |
|
|
|
|
|
|
109
5.2 Урогенитальныйкандидоз
Урогенитальный кандидоз – грибковое заболевание слизистой оболочки и кожи мочеполовых органов, вызванное грибами рода Candida. Первые упоминания о кандидозе появились еще в трудах Гиппократа и Галена. Впервые клиническая картина вульвовагинита была описана в 1792 г. (Frank), а в 1794 г. (Wilkinson) впервые установил ее грибковую этиологию.
Распространенность урогенитального кандидоза.
Урогенитальный кандидоз чаще встречается у женщин, реже
– у мужчин. Заболевание составляет до 40% в структуре инфекционной патологии нижнего отдела гениталий (Прилепская В.Н., Байрамова Г.Р., 1995). Подсчитано, что из 100 млн ежегодных визитов к врачам по поводу вагинита около 20– 25% обусловлены вульвовагинальным кандидозом [31]. Установлено, что 75% женщин переносят в течение своей жизни по крайней мере хоть один эпизод вульвовагинального кандидоза, а у 40–50% из них развивается один рецидив за-
болевания (Harley R., De Louvois J., 1979; Reed B.D., 1992).
Заболеваемость вульвовагинальным кандидозом в США насчитывает около 13 млн случаев в год, что составляет около 10% женского населения страны. Урогенитальный кандидоз наиболее часто регистрируется в странах с жарким климатом и низкими санитарно-гигиеническими условиями. В последние годы появились стертые и атипичные формы данной патологии, а также хронические, резистентные к проводимой терапии разновидности заболевания [3, 40, 48, 66, 191].
В США в 1990 г. зарегистрировано около 8 млн посещений женщинами акушера-гинеколога в связи с кандидозным вагинитом. Отмечается, что в 1980–1990 гг. количество случаев грибковых вагинитов удвоилось, что связано с увеличением кандидозов, вызванных не-albicans видами Candida. Проведенный опрос женщин в США показал, что 6,5% женщин старше 18 лет имели, по крайней мере, один эпизод предполагаемого грибкового вагинита в течение последних двух месяцев, 8% респондентов имели четыре или более эпизодов в течение года [3, 32, 86].
110