6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Флуоресцентные_методы_диагностики_в_медицине_Колтовой_Н_А_Краевой
.pdf1960 - Москва - МГУ - Факультет фундаментальной медицины - кафедра медицинскиой
биофизики - Владимиров Юрий Андреевич - академик РАМН, дбн.
1960 - Владимиров Ю.А. Бурштейн Э.А. Спектры люминесценции ароматических аминокислот и белков. Биофизика. I960. т.5. № 4. с.385-392.
1961 - Владимиров Ю.А. О люминесценции ароматических аминокислот в молекуле белка.
ДАН СССР, 1961. 136(4): p.960-963.
1962 - Владимиров Ю.А. Чиньго Л. Спектры люминесценции белков и ароматических аминокислот при различных рН. Биофизика, 1962. т.7. №3. с.270-280.
1965 - Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. 1965. Москва. Наука. 232 с. 1965 - Владимиров Ю.А. Зимина Г.М. Люминесценция некоторых белков и триптофана при монохроматическом возбуждении в растворах с различными рН. Биохимия, 1965. т.30. №6.
с.1105-1114.
1969 - Vladimirov U.A. Photochemistry and luminescence of proteins. AEC-tr 1969, Jerusalem,: Israel Program for Scientific Translations available from the U.S. Dept. of Commerce, Clearinghouse for
Federal Scientific and Technical Information, Springfield, Va. iii, 207 p.
1972 - Клебанов Г.И. Сороковой В.И. Владимиров Ю.А. Исследования конформационных свойств биологических мембран методом измерения белковой люминесценции. Молекулярная биология. 1972. №6. с.705.
1964 - Пущино - ИТЭБ - Бурштейн Эдуард Аронович
1961 - Бурштейн Э.А. Люминесценция ароматических аминокислот и белков в растворах при возбуждении в коротковолновой ультрафиолетовой области. Биофизика. 1961. т.6. №6. с.753. 1964 - Бурштейн Эдуард Аронович. Применение спектральных методов в исследовании функциональных состояний белков Диссертаци Кандидата. 1964. 160c. Научные руководители: чл. корр. Франк Г.М. к.б.н. Владимиров Ю.А.
1966 - Бурштейн Э.А. Зимина Г.М. Владимиров Ю.А. Применение люминесцентного метода для определения состояния ароматических аминокислот (тирозина и триптофана) в белках и ферментных системах. Журнал прикладной спектроскопии, 1966. 4(2): p.142-146.
1968 - Бурштейн Э.А. Тушение-флуоресценции белков. I.Принципы метода. Растворы триптофана, тирозина и денатурированных белков. Биофизика, 1968, т.13, выл.3, с.433-442. 1970 - Веденкина Н.С. Бурштейн Э. А. Триптофановая флуоресценция белков в растворах. Положение максимума спектра флуоресценции. Молекулярная биология. 1970. № 4. с.743-748. 1971 - Пермяков Е.А. Бусел Е.П. Бурштейн Э.А. Люминесценция и состояние производных индола в замороженных водно-солевых растворах. Ж. структ. химии, 1971, т.12, № I, с.79-86. 1973 - Юмакова Е.М. Атанасов Б.П. Бурштейн Э.А. Пермяков Е.А. рН-индуцированные конформационные изменения нативного состояния производных миоглобина. Спектрофлуориметрическое исследование. В сборнике "Конформационные изменения биополимеров в растворе", Москва, Наука, 1973, с.113-120.
1973 - Бурштейн Э.А. Люминесценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. т.3. М. ВИНИТИ. 1973. с.127.
1970 - Веденкина, Н.С. и Э.А. Бурштейн. Триптофановая флуоресценция белков в растворах. Положение максимума спектра флуоресценции. Молек. биол. 1970. 4:743-748.
1972 - Веденкина, Н.С. М.Н. Ивкова, и Э.А. Бурштейн. Положения максимума спектра флуоресценции поверхностных остатков триптофана в белках. Молек. биол. 1972. №6. с.467-
470.
1975 - Пермяков Е.А. Люминесцентные исследования динамики структуры белка при низких температурах. Дисс. канд. ИБФ АН СССР, Пущино, 1975.
1976 - Бурштейн Э.А, Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования). В кн.: Биофизика, М. ВИНИТИ, 1976, т.7, 213 с. (Итоги науки и техники).
1976 - Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белков (Природаи применение). В кн.: Биофизика, М. ВИНИТИ, 1977, т.7, 190 с. (Итоги науки и техники).
1983 - Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка как метод изучения быстрой структурной динамики. Молекулярная биология 1983, т.17, $ 3, с.455-467.
41
2000 - Решетняк Яна Константиновна. Взаимосвязь между параметрами флуоресценции триптофановых остатков и структурно-физическими особенностями микроокружения индольных колец в белках. Диссертация кандидата физико-метаематических наук. 2000. Пущино. 184с.
1998 - Емельяненко, В.И. и Э.А. Бурштейн. Аналитическое описание спектров флуоресценции ароматических аминокислот и белков. Ж. Прикл. Спектроск. 1998. т.65. с.360-365.
2000 - Емельяненко, В.И. Я.К. Решетняк, О.А. Андреев, и Э.А. Бурштейн. Анализ логнормальных компонент спектров флуоресценции связанных с белками продана и акрилодана. Биофизика. 2000. 45.
2007 - Емельяненко Виктор Иванович. Компонентный анализ спектров флуоресценции как метод исследования структурных и физико-химических переходов в белках. Диссертация кандидата физико-математических наук. Пущино. 2007. 109 с.
1966 - Санкт-Петербург - Институт Цитологии АН
Баренбойм Григорий Матвеевич - дбн, ген дир ГЦ водохозяйственного мониторинга МПС РФ 1966 - Баренбойм Г.М. Доманский А.И. Туроверов К.К. Люминесценция биополимеров и клеток. М. Л. Наука. 1966. 233 с.
1970 - Туроверов К.К. Щелчков Б.В. Исследование тепловой денатурации белков с помощью двухволнового метода регистрации изменений спектра их ультрафиолетовой флуоресценции.
Биофизика. 1970. т.15, №6. с.965-970.
1998 - Туроверов К.К. Кузнецова И.М. (Санкт-Петербург, Институт Цитологии) Собственная УФ-флуоресценция белков как инструмент для изучения их динамики. Цитология. 1998. т.40.
№8/9. с.735-746.+ 1998 - Туроверов К.К. Кузнецова И.М. (Санкт-Петербург, Институт Цитологии) Что определяет
характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и собственной локализации их триптофановых остатков. 1998. т.40. №8/9. с.747-753.+ 1999 - Туроверов Константин Константинович, Собственная флуоресценция белков: Структура
и динамика макромолекул. Диссертация доктора физико-математических наук. СанктПетербург. 1999. 209с.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------
1967 - Зеленин А.В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. М. Наука. 1967.
1973 - Бусел Е.П. Люминесцентные свойства основных хромофоров белка. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. М. ВИНИТИ. 1973. т.3. с.85-126.
1980 - Марков И. Б. Цымбал Л. Н. Немцева Г. Е. (Рига) Изучение возможности флуориметрического количественного определения белков в плазме крови. В сб. Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. Рига. 1980. с.23.
1989 - Драган А.И. Храпунов С.Н. (Киев, КГУ) Адсорбционные и люминесцентные исследования межмолекулярных взаимодействий тирозинового хромофора. I. Анализ спектров поглощения и флуоресценции. Биофизика. 1989.
1989 - Драган А.И. Храпунов С.Н. (Киев, КГУ) Адсорбционные и люминесцентные исследования межмолекулярных взаимодействий тирозинового хромофора. II. Влияние полярности растворителя на спектры флуоресценции хромофора. Биофизика. 1989. т.34, №2.
с.187-194.+
1993 - Шепотиновская И.В. Назарова И.Н. Уманская Н.Я. (Ростов-на Дону, РГУ) Флюорометрический метод определения амидных групп белков. Лабораторное дело. 1993. с.18. 1993 - Аборнев, С.М. 1993. Разложение составных спектров триптофановой флуоресценции.
1996 - Векшин Н.Л. Разделение тирозиновой и триптофановой компонент флуоресценции методом синхронного сканирования. Биофизика. 1996. т.41, №6. с.1176-1179.
42
1.3 Флуоресценция порфиринов.
Порфирины (Porphyrin)- природные макрогетероциклические пигменты, в основе которых лежит порфирин, макроцикл из четырех колец пиррола.
Рис. 1-40. Структура порфирина.
Повышенное содержание порфирина в крови (порфирия) наблюдается при недостатке железа (при интоксикации (свинец, сульфазол, барбитураты)), авитаминозах (пеллагра), перниционной анемии, некоторых заболеваниях печени.
Гемоглобин - это железопорфирины, связанные с белком глобином. Однако гемоглобин не флуоресцирует.
Всю группу можно разделить на собственно порфирины, дигидропорфирины (хлорины) и тетрагидропорфирины (бактериохлорины), отличающиеся степенью гидратации двойных связей. Изучение свойств хлоринов и бактериохлоринов привлекательно с точки зрения их использования в качестве экзогенных фотосенсибилизаторов при фотодинамической терапии.
Определить количество порфирина в крови можно с помощью флуоресцентного микроскопа. Необходимо просчитать количество флуоресцирующих эритроцитов в поле зрения.
Собственная флуоресценция клеток крови и костного мозга незначительна. Цитоплазма лейкоцитов крови и ядерных элементов костного мозга обладает тусклым, едва заметным зеленоватым свечением. Ядра клеток почти не флуоресцируют.
Вэритроцитах содержится – протопропорфирин (ПП), копропорфирин (КП) и уропорфирин
(УП),
ПП-Э - протопорфирин в эритроцитах, КП-Э - копропорфирин в эритроцитах, УП-Э - уропорфирин в эритроцитах,
Всыворотке крови содержится копропорфирин.
ПП-С - протопорфирин в сыворотке, КП-С - копропорфирин в сыворотке, УП-С - уропорфирин в сыворотке,
Эндогенные свободные порфирины образуются в результате распада гемов и миоглобинов. Все порфирины появляются за счет химического изменения этилпорфирина в организме. Порфирин IX, являясь одним из основных порфиринов в организме, соединяясь с железом, образует гем. В костном мозге за сутки синтезируется 250-300 мг порфирина, и он используется в синтезе гема. Наибольшее количество свободных порфиринов (50 мг) проникает в эритроциты. В патологическом состоянии количество порфиринов внутри эритроцитов увеличивается в 10-15 раз.
Протопорфирины.
Протопорфирины - часть молекулы гемоглобина, найдены в свободной форме в эритроцитах, что придает им красную флуоресценцию низкой интенсивности. При отравлении
43
свинцом содержание протопорфиринов в эритроцитах возрастает в 40 раз, при недостатке железа - в 20 раз. Протопорфирин IX имеет максимумы поглощения 405 и 621 нм, максимумы флуоресценции - 623, 675, 705 и 800 нм. Максимум 675 нм соответствует димерам протопорфирина IX. Раствор протопорфирина IX в эфире обнаруживает полосы поглощения с максимумами при 403 (полоса Соре), 504 (I), 535 (II), 575 (III) и 633 нм (IV).
Копропорфирины.
Экзогенные порфирины вместе с мясными и растительными продуктами попадают в организм, всасываясь через кровь, проникают в печень и превращаются в копропорфирины. Основная часть копропорфиринов вместе с желчью выделяется в кишечник, а остальная часть попадает в кровь и через почки вместе с мочой выделяется наружу.
Основным порфирином, присутствующим в норме в моче и кале, является копропорфирин. Примерно половина корпропорфирина в свежей моче находится в не флуоресцирующей форме. При довольно мягких условиях окисления не флуоресцирующая форма переходит во флуоресцирующую. В результате распада порфиринов, проходящего в несколько этапов, образуется уробилиноген, часть которого из производных желчного сока вновь всасывается через стенки кишечника и удаляется из кровотока с кровью, но при некоторых патологических процессах выводится с мочой. На воздухе уробилиноген окисляется до уробилина, который флуоресцирует. Копропорфирин III ( растворитель - эфир) - при 392 (полоса Соре), 495 (I) 528 (II), 568 (III) и 623 нм (IV).
Считается, что полоса Соре и полосы I и III обусловлены электронными переходами. Полосы II и IV имеют колебательное происхождение.
Для большинства порфиринов характерно наличие четырех полос поглощения в видимой области спектра и более интенсивной полосы Соре с максимумом около 400нм.
Максимумы спектра поглощения протопорфиринов составляют 337, 370, 405, 532, 632
нм.
Металлопорфирины.
В организме человека биологически-активными являются металлопорфирины. они, как правило, флуоресцируют слабо. При образовании комплексов с белками (гемоглобин) они даже гасят флуоресценцию. При отрыве атома железа от простетической группы внутриклеточные гемопорфирины начинают флуоресцировать. В тканях и препаратах ферментов, способных к осуществлению начальных этапов синтеза порфиринов, наблюдается усиление интенсивности флуоресценции.
44
Рис. 1-41. Спектр поглощения различных металлопорфиринов в THF. Максимум поглощения (полоса Соре) для различных металлопорфиринов:
H2P - 412,5 / ZnP - 422,3 / PdP - 415,9 / CuP - 410,3 / NiP - 413,4.
Таблица 1-5. Спектральные характеристики некоторых порфиринов. |
|
|||
|
Возбуждение |
Флуоресценция |
Поглощение |
|
Копропорфирин III |
401,531,498,573 |
625,690 |
392,568,495,623,528 |
|
Протопорфирин IX |
408,538,506,580 |
635,700 |
403,575,504,633,535 |
|
Копропорфирин III-д |
400,548 |
596,651 |
400,547,590 |
|
Протопорфирин IX-д |
410,560 |
606,662 |
407,554,600 |
|
Znкопропорфирин III |
409,542 |
578,628 |
407,540,576 |
|
Zn-протопорфирин IX |
418,550 |
588,638 |
417,548,585 |
Порфирин-д обозначает дикатион (димер).
Рис. 1-42. Типичный спектр поглощения порфиринов.
Рис. 1-43. 1-спектр пропускания отсекающего светофильтра, 2-спектр возбуждения порфиринов, 3-спектр флуоресценции порфиринов.
45
2005 - Al-Daghri. A, "Spectral characterization of cancer patients' blood". Thesis of Master of Science in Physics, 2005. В работе исследуется спектр флуоресценции порфиринов.
Рис. 1-44. Спектр флуоресценции порфирина при возбуждении светом 400 нм.
Рис. 1-45. Синхронный спектр флуоресценции порфирина. Сдвиг между длиной волны возбуждения и регистрации 10 (сплошная линия) и 70 нм (пунктирная линия).
46
Рис. 1-46. Двумерный спектр флуоресценции протопорфирина и копропорфирина.
Усиление флуоресценции порфиринов.
Интенсивность флуоресценции порфиринов существенным образом зависит от рН раствора. При увеличении рН интенсивность флуоресценции растет. Увеличивая рН можно увеличить интенсивность флуоресценции.
Рис. 1-47. Зависимость интенсивности флуоресценции порфиринов от рН для различных порфиринов. 1-гематопорфирин, 2-изоуропорфирин, 3-уропорфирин.
47
Fink H. разработал метод инентификации порфиринов на основе анализа зависимости флуоресценции от рН.
1930 - Fink H. Weber K. Флуоресценция порфиринов и концентрация Н-ионов. Naturwiss. 18. 16
(1930).
1937 - Fink H. Выделение порфиринов и их идентифокация по кривым рН интенсивности флуоресценции. Ber. Dt. Chem. Ges. 70. 1477 (1937).
1938 - Theil F. Метод определения порфиринов в моче, удобный в клинических условиях. Biochem. Zs. 298. 436 (1938).
Литература по порфиринам.
1972 - Москва - ВНИИ биосинтеза белковых веществ.
1972 - Манешин С.К. Аревшатян А.А. Люминесценция порфиринов в дрожжах р. Candida, выращенных на углеводородах. Биофизика, 1972, т.17, 352-354.
1973 - Манешин С.К. Денисова т.С. Аревшатян А.А. Исследование особенностей и природы порфирииов, синтезируемых дрожжами. Биофизика живой клетки, т.4. Пущино, 1973, с.59-66. 1973 - Манешин С.К. Аревшатян А.А. Способ определения соотношения живых и мертвых клеток микроорганизмов. Патент 351892, 1973.+ Клетки облучают светом с длиной волны 400420 нм. Затем регистрируют собственную флуоресценцию окисленной и восстановленной форм порфиринов на длине волны 580 и 630 нм.
1971 - Кубатиев А.А. Рак и порфирины Вопросы онкологии. 1971. т.17. №7. с.86.
1973 - Кубатиев А.А. Порфирины, витамин В12 и рак. Тула. Приокское книжное издательство. 1973. 224с.
1974 - Добротина Н.А. Кривошеев Б.Н. Содержание и функциональная активность протеинов сыворотки крови и некоторые вопросы патогенеза дерматозов с нарушением порфиринового обмена. Вестн. дерматол. 1974. № З. с.42-48.
1985 - Соловьев К.Н. Гладков Л.Л. Старухин А.С. Шкирман С.Ф. Спектроскопия порфиринов. Колебательные состояния. Минск. Наука и техника. 1985. 415 с.
1985 - Порфирины: структура, свойства, синтез. М. Наука. 1985. 333 с.
1987 - Ениколопян Н.С. Порфирины: спектроскопия, электрохимия, применение. М. Наука. 1987. 384с.
1995 - Химическая энциклопедия. Порфирины. Наука. М. 1995. 4. с.44-149.
1999 - Решетников А.В. Швец В.И. Пономарев Г.В. Успехи химии порфиринов. т.2. СПб.: Издво НИИ Химии СПбГУ. 1999. Гл.4. Водорастворимые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака. с.70-114.
2001 - Хелевина О.Г. Чижова H.B. Успехи химии порфиринов. т.З. СПб.: Изд-во НИИ Химии СПбГУ, 2001. Гл.4: Реакции замещения тетразапорфиринов. с.72-86.
2004 – Кривошеев Александр Борисович (Новосибирск, НГМУ) Заболевания внутренних органов и нарушения порфиринового обмена. Диссертация доктора медицинских наук. Новосибирск. 2004.
2006 - Рогаткин Д.А. Любченко П.Н. Карпов В.Н. Горенков Р.В. (Москва, МОНИКИ) Способ диагностики свинцовой интоксикации организма. Патент 2283036. 2006.+
48
2007 - Савенкова Наталья Сергеевна, (Томск, ТГУ) Спектрально-люминесцентные свойства тетрапиррольных соединений. Диссертация кандидата химических наук. Томск. 2007. 163с.
2007 - Вдовин Ю.А. Марколия А.А. Гончуков С.А. Курочкин В.И. (Москва, МИФИ) Спектры флуоресценции порфиринов при возбуждении источником света с перестраиваемой длиной волны. Научная сессия МИФИ. 2007. с.29.+
2007 - Юдина Марина Владимировна (Екатеринбург, УГМА) Клинико-лабораторная характеристика и показатели порфиринового обмена у детей с анемиями, лечение. Диссертация кандидата медицинских наук. Екатеринбург. 2007. 124 с.
Зарубежная литература по порфиринам.
1961 - Lipson R.A. Baldes E.J. Olsen A.M. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection / J. Nat. Cancer Inst. 1961. Vol. 26. p.1-11.
1975 - Porphyrins and metalloporphyrins. Ed. by K.M. Smith. Elsevier: Oxford, 1975. 890 p.
1978 - Gouterman M. Optical spectra and electronic structure of porphyrins and related rings. In: The porphyrins. Ed. by D. Dolphin. Acad. Press: London, 1978. V. 3. p.1-165.
1983 - Aizava R. Endoscjpic detection of Hematoporphirin derivative fluorescein tumors. Lasers and Hematoporphirin derivative in Cancer.Tokio. 1983. P.21-24.
1988 - Profio, A. E. 1988. Review of fluorescence using porphyrins. Proc. SPIE 905:150–156.
1999 - J.W. Meng, X.J. Wang, H.P. Ma, X.G. Ren, X.R. Xu, W.M. Ren, Protoporphyrin IX fuorescence from the plasma of tumor-implanted mouse, J. Luminsc. 83–84. (1999) 251–254.
2000 - The porphyrin handbook. Ed. by Kadish K.M. Smith K.M. Guilard R. Academic Press: New York, 2000-2003. Vol. I-XX.
49
1.4Различные эндогенные флуорофоры.
А- Общие таблицы флуорофоров
Б - Общие двумерные спектры флуорофоров
В - Коферменты никотинамидадениндинуклеатид - НАД (NAD) Г - Коферменты флавины Д - Витамин В2 (рибофлавин)
Д1 – Витамин В9 - Фолиевая кислота (folic acid). Пик (360,450).
Д2 – Билирубин (460,515)
Е - Скатол Ж - Индол З - Серотонин
И - Адреналин К - Хинидин Л - Меланин
Л1 – фибрин (280,344)
М - Коллаген I и II Н - Эластин О - Кератин П - Каротин
Р - Липофусцин С - Нуклеиновые кислоты - ДНК, РНК
Т - Продукты окислительно-восстановительных реакций. У- ионы железа.
А - Общие таблицы флуорофоров.
Таблица 1-6. Длины волн возбуждение/флуоресценция для различных флуорофоров.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
250 / 282 -аминокислота - фенилаланин Phe
-------------------------------------------300 -фиолетовый----------------------------------------
280 / 303 - аминокислота - тирозин -Tyr-(tyrosine)
/310 - нейтральный возбужденный радикал гидроксила (ОН*)
230 / 335 - индол (Indole) (1)
(274, 280) / (330)348 - аминокислотатриптофан - Trp - (tryptophan)
231 / 350 - аминокислота - триптофан - Trp - (tryptophan)
290 / 360 - возникает при окислении свободными радикалами остатка гистидина
230 / 370 - скатол (Skatole)
337 / 397 -белок коллаген I, II (collagen)
--------------------------------------------400 синий-----------------------------------------------
325/400 - коллаген
360 / 410 - белок эластин (elastin)
325/416 – битирозин – продукты окисления белков 250-310 / 360-420 - флуоресценция активных форм кислорода в чистой воде ?/415 - битирозин - продукт окисления тирозина
280 / 420 - кофермент NAD - окисленная форма
340 / 440 - кератин (keratin)
280 и 350 / 460 - кофермент NADH - восстановленная форма
340 / 450 (465, 480) - коферменты NADPH (НАДФ) 360/450 – фолиевая кислота – витамин В9, 335/480 - витамин К 390/480 - витамин Д
50