6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Стандартизация_аналитических_технологий_лабораторной_медицины_Выпуск

«Метод жидкостной цитологии»

71

диагноза); архивирование препаратов; контроль качества исследований (внутрилабораторный и внешний).

Ключевые слова: жидкостная цитология, цитоцентрифуга, монослойный цитологический препарат, фиксация и окрашивание цитологических мазков, окрашивание по Папаниколау.

1.Цель исследования

Цель исследования – стандартизация технологии приготовления цитологических препаратов. Жидкостная цитология (ЖЦ) – способ получения монослойных цитологических препаратов из фиксирующего раствора с использованием методов центрифугирования, осаждения и∕или фильтрации.

Обоснование. Цитологическое исследование является одним из основных методов морфологического анализа. Оно состоит в оценке особенностей морфологического строения отдельных клеток и их структур в цитологическом препарате с целью выявления и установления характера изменений различной природы: неопухолевых заболеваний, доброкачественных и злокачественных опухолей.

Одним из основных условий адекватного цитологического диагноза является высокое качество полученного, приготовленного и окрашенного материала, а также возможность использования при исследовании дополнительных методов диагностики.

Метод ЖЦ позволяет стандартизировать технологию приготовления цитологического материала из жидкой клеточной суспензии и получить препараты с монослойно и локально расположенным материалом. Полученный любым способом цитологический материал, помещенный в контейнер со стабилизирующим раствором, при необходимости, можно использовать для повторного приготовления препаратов, проведения молекулярно-диагностических исследований (определение маркеров неопластической трансформации, различных инфекций и т. д.). Стабилизирующий раствор обеспечивает сохранность морфологических, иммуноцитохимических и генетических свойств клеток в течение длительного времени (от 1 месяца до 1 года в зависимости от состава стабилизирующего раствора).

ЖЦ может быть использована для исследования любого клеточного материала и в ряде случаев повышает информативность цитологической диагностики. ЖЦ является информативным методом скрининга заболеваний шейки матки (ШМ) и в некоторых странах рекомендована к использованию для проведения скрининговых исследований.

Выпуск 2

72	Стандартизованная аналитическая технология

Для скрининга заболеваний ШМ метод ЖЦ может применяться как в сочетании с традиционным, так и самостоятельно. Однако для диагностических исследований ЖЦ как правило не заменяет традиционный метод, а дополняет его. ЖЦ способна расширить возможности цитологической диагностики за счет использования дополнительных методов (молекулярных, генетических и др.).

Материалом для использования метода жидкостной цитологии могут служить:

•соскоб с шейки матки, полученный с помощью специальных инструментов – цитощетки, шпатели и др.;

•аспират из полости матки;

•мокрота;

•моча;

•выпотные и кистозные жидкости;

•спинномозговая жидкость;

•материал, полученный при аспирационной пункционной биопсии тонкой иглой (АПТИ) патологических образований в различных органах и тканях;

•смыв с иглы и шприца, которыми выполнена АПТИ;

•клеточная взвесь, полученная при помещении пункционного материала в жидкую среду для сохранения и/или транспортировки;

•смыв или соскоб с биопсийного материала;

•соскобы и отпечатки с различных патологических образований.

Цель внедрения настоящей технологии определяется необходи-

мостью установления единых правил в соответствии с положениями системы менеджмента качества в медицинской лаборатории (ГОСТ Р ИСО15189) [ 1]. (Это касается требований к качеству получения и доставки материала в лабораторию, приготовления высококачественных, стандартных монослойных препаратов, фиксации и окрашивания мазков, оценки результатов исследования).

Стандартизация и соблюдение указанных правил обеспечивают получение полноценной диагностической информации.

2.Требования к обеспечению выполнения

технологии

2.1.Требования к специалистам и вспомогательному персоналу

Перечень специалистов с высшим и средним образованием, участвующих в выполнении технологии:

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

«Метод жидкостной цитологии»

73

––врач клинической лабораторной диагностики, прошедший подготовку по клинической цитологии;

––биолог с высшим образованием, имеющий специализацию по клинической лабораторной диагностике, прошедший подготовку по клинической цитологии;

––специалист со средним медицинским образованием, имеющий подготовку по лабораторной диагностике: медицинский технолог, медицинский лабораторный техник, фельдшер-лаборант, лаборант.

Требования к образованию специалистов

Цитологическое исследование монослойных препаратов, приготовленных методом ЖЦ, имеют право проводить врачи клинической лабораторной диагностики, прошедшие специализацию и повышение квалификации в установленном порядке и имеющие сертификат специалиста. Предварительный просмотр препаратов может выполнять биолог с высшим образованием, прошедший подготовку и повышение квалификации в установленном порядке. Подготовительную работу выполняет специалист со средним медицинским образованием, имеющий соответствующий сертификат (медицинского технолога, медицинского лабораторного техника, фельдшера-лаборанта или лаборанта).

Работа по выполнению указанной методики в лаборатории распределяется следующим образом:

а) персонал со средним медицинским образованием проводит прием, регистрацию и приготовление препаратов методом жидкостной цитологии; фиксацию и окрашивание мазков, регистрацию заключения, архивирование препаратов;

б) в случае выполнения скрининговых исследований (материала, полученного при гинекологических профилактических осмотрах) персонал со средним медицинским образованием, прошедший соответствующую подготовку, проводит по распоряжению заведующего лабораторией первичный просмотр цитологических препаратов и скрининг-сортировку на «норму» и «патологию» для последующего исследования отобранного материала с отклонениями от «нормы» врачом;

в) биолог с высшим биологическим образованием, имеющий общее усовершенствование по клинической лабораторной диагностике и прошедший подготовку по цитологии, проводит по распоряжению заведующего лабораторией просмотр цитологического материала в монослойных препаратах;

Выпуск 2

74	Стандартизованная аналитическая технология

г) врач клинической лабораторной диагностики (цитолог) проводит анализ цитологического материала в монослойных препаратах с выявленными при первичном просмотре патологическими изменениями, устанавливает цитологический диагноз.

Требования к знаниям, умениям и навыкам специалистов, выполняющих технологию, должны соответствовать образовательным стандартам.

2.2.Требования к обеспечению безопасности труда медицинского персонала

Требования по безопасности труда при выполнении технологии соответствуют общим правилам безопасности при работе в клинико-диагностической лаборатории согласно ГОСТ Р ИСО 52095 [2]. Должны соблюдаться правила биологической безопасности, правила сбора и удаления отходов, правила работы с электроприборами и реактивами, правила организации вентиляции, пожарной безопасности. Системы отопления, вентиляции и кондиционирования воздуха должны обеспечивать нормируемые параметры микроклимата и воздушной среды помещений, в которых осуществляется медицинская деятельность [5].

Требования биологической безопасности

Все образцы, содержащие биологический материал (цитологический материал, помещенный в контейнер со стабилизирующим раствором и полученные мазки), являются потенциальными источниками инфекции. Для соблюдения биологической безопасности выполняют следующие правила [3]:

––регистрация и окраска присланного в лабораторию биологического материала проводится в индивидуальных средствах защиты (халаты, резиновые перчатки);

––после окончания работы проводят дезинфекцию расходных материалов, рабочих мест и помещений лаборатории в резиновых перчатках, для обеззараживания используются средства, обеспечивающие уничтожение вирусной и бактериальной флоры, реко-

мендуемые для дезинфекции [4].

Потенциально опасные отходы, загрязненные остатками биологического материала, образующиеся в процессе выполнения технологии, дезинфицируют, затем собирают в герметическую одноразовую упаковку и удаляют из лаборатории в контейнерах, установленных в определенных местах на территории лечебного учреждения [5].

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

«Метод жидкостной цитологии»

75

Правила работы со специальным оборудованием и пожарной безопасности

Все сотрудники должны выполнять инструкции и правила техники безопасности, изложенные в технических паспортах к электрическим приборам. Все сотрудники лаборатории, работающие с реактивами, должны быть обучены обращению с ними.

2.3.Материальные ресурсы, необходимые для выполнения технологии

Существует множество систем для приготовления препаратов методом ЖЦ, основанных на различных методах нанесения клеточного материала на стекло: центрифугирование, осаждение, фильтрация с различной степенью автоматизации – ручной способ, полуавтоматический и автоматический, с разным набором операций. Существуют разные системы для обогащения клеточной суспензии перед нанесением клеточного материала на предметное стекло, в том числе фильтрация клеточного материала во время центрифугирования через специальный реагент (плотный реагент).

Приборы, изделия медицинской техники, оборудование:

1.Цитоцентрифуга с цитокамерами.

2.Лабораторная центрифуга – необходима в тех случаях, когда получено большое количество малоклеточного жидкого материала (моча, выпотные жидкости) и необходимо провести дополнительно центрифугирование в центрифужных пробирках для получения осадка. В системах, предусматривающих обогащение клеточного материала перед переносом на предметное стекло, лабораторная центрифуга обеспечивает фильтрацию клеточной суспензии через плотный реагент, в результате чего возникает возможность механического удаления остающихся в надосадочной жидкости элементов, потенциально способных ухудшить качество препарата (эритроцитов, детрита, элементов воспаления).

3.Аспиратор входит в комплект некоторых систем и применяется для удаления надосадочной жидкости в ходе процесса обогащения клеток.

4.Аппаратные средства для обеспечения формирования монослойного и в то же время достаточно насыщенного клеточного кружка. Нефелометр входит в комплект некоторых систем. Позволяет определить клеточность жидкого материала для более точного выбора необходимого количества клеточного материала для цитоцентрифугирования.

Выпуск 2

76	Стандартизованная аналитическая технология

5.Шейкер входит в комплект некоторых систем.

6.Устройство для нанесения нативной клеточной суспензии поверх плотного реагента (в системах с обогащением).

7.Пипетки объемом: 0,1, 1,0, 5 мл (или автоматические дозаторы с изменяющимся объемом).

8.Цитокамеры или осадочные камеры (для некоторых систем).

9.Кюветы или рельсы для фиксации и окраски мазков (при неавтоматизированном способе окрашивания препаратов) и/или устройство для фиксации и окрашивания препаратов (автоматическое) – автоматический мультистейнер (для некоторых систем).

10.Управляющий компьютер для автоматического мультистейнера. Применение управляющего компьютера позволяет достигнуть нескольких целей: реализация сложных алгоритмов окраски (в частности по Папаниколау), достижение воспроизводимости результатов окраски, экономия трудозатрат персонала лаборатории, управление концентрацией клеточной суспензии.

11.Микроскоп бинокулярный с иммерсионной системой и встроенным осветителем и/или микроскоп биологический с цифровой видеокамерой.

12.Аппарат для получения дистиллированной воды.

13.Контейнер переносной для транспортировки биологического материала.

14.Штатив-контейнер для предметных стекол.

15.Таймер лабораторный.

Стеклянные и пластиковые изделия:

1.Стекла предметные с адгезивным покрытием.

2.Стекло предметное (с матовым полем для маркировки), размер 23×76×1,1 мм.

3.Бумажные фильтры (для систем с бумажными фильтрами).

4.«Клеящий» раствор (для систем без бумажных фильтров).

5.Плотный реагент для обогащения клеточной суспензии (для некоторых систем).

6.Наконечники на пипетки соответствующего объема.

7.Покровные стекла размером не менее 20×20 мм (необходимы для препаратов, окрашенных по Папаниколау).

8.Стаканы химические низкие 40, 400 мл.

9.Стаканы без метки 200 мл.

10.Цилиндры мерные высокие 100, 500 мл.

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

«Метод жидкостной цитологии»

77

2.4.Реактивы

1.Набор реактивов для окраски по Папаниколау (табл. 1).

2.Фиксаторы-красители эозин метиленовый синий по Май-Грюн- вальду или Лейшману.

3.Краситель азур-эозин по Романовскому.

4.Азур II*.

5.Эозин калия или натрия водорастворимый*.

6.Набор реагентов для приготовления буферного раствора с определенным pH (для некоторых систем).

7.Дигидрофосфат калия.

8.Гидрофосфат натрия.

9.Этанол 95° или 100° (расход этанола на одно предметное стекло 2 мл).

10.Эфир диэтиловый во флаконах.

11.Реагент для регулярной промывки аппаратных средств, предотвращающий развитие в полостях и трубочках приборов микроорганизмов.

12.Уксусная кислота 3,5%.

13.Иммерсионное масло.

14.Стабилизирующий раствор (транспортная среда) – консервирующие жидкости, которые обладают разными свойствами, имеют

различный состав, как правило, запатентованный фирмой-из- готовителем. Стабилизирующие растворы для получения проб как правило представляют собой многокомпонентные растворы, в которые входят:

––фиксирующие спиртовые смеси 30–50% (этанол, метанол, изопропанол), которые также способствуют денатурации;

––муколитические вещества;

––2–3% растворы кетонов и альдегидов (фиксаторы клеточных структур);

––водно-солевые буферные растворы;

––полиолы и детергенты (дезагреганты и стабилизаторы жидких суспензий).

15.Бальзам для заключения препаратов под покровное стекло.

16.Ксилол.

17.Вода дистиллированная (для некоторых технологий буферизованная).

*При приготовлении азур-эозиновой смеси в лаборатории.

Выпуск 2

78	Стандартизованная аналитическая технология

2.5.Прочий расходуемый материал

1.Перчатки хирургические, резиновые.

2.Вата хирургическая, марлевые салфетки или бинты.

3.Характеристика выполнения исследования методом жидкостной цитологии

Технология исследования включает следующие последовательные этапы:

1.Получение материала для исследования методом жидкостной цитологии.

2.Доставка, прием и регистрация биологического материала.

3.Перемешивание (встряхивание) материала на шейкере (для некоторых систем).

4.Стандартизация пробы клеточной суспензии с помощью нефелометра (для некоторых систем).

5.Полная или частичная очистка пробы клеточной суспензии от элементов, уменьшающих информативность клеточного материала (эритроциты, элементы воспаления, детрит) (для некоторых систем).

6.Приготовление монослойных препаратов.

7.Фиксация и окрашивание препаратов.

8.Микроскопическое исследование морфологии клеток.

9.Описание цитограммы.

10.Установление цитологического диагноза.

11.Оценка правильности цитологического заключения (внутрилабораторный и внешний контроль качества цитологического исследования).

12.Регистрация заключений.

13.Архивирование препаратов.

При необходимости проведение дополнительных методов исследования – иммуноцитохимического, цитогенетического исследований, гибридизация in situ, проточной цитометрии.

3.1.Получение материала для исследования методом жидкостной цитологии

Получение материала для ЖЦ не требует особых условий. Как правило, материал получают теми же инструментами, которые традиционно используются в цитологической диагностике [6]. Принципы взятия материала для цитологического исследования одинаковы, независимо от метода:

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины

«Метод жидкостной цитологии»

79

•При гинекологическом исследовании используются различные специальные щетки, в том числе имеющие съемную головку, щетка вводится в цервикальный канал и поворачивается на 360º. После получения материала щетка отсоединяется от ручки и помещается в контейнер с транспортной средой.

Примечание. При скрининге материал можно получать с помощью щеток, захватывающих экто-, эндоцервикс и зону трансформации. При использовании ЖЦ в качестве диагностического метода можно брать материал раздельно из экто- и эндоцервикса в разные контейнеры (виалы). Возможно приготовление традиционных мазков до помещения приспособления для взятия материала

вконтейнер.

•Пунктаты образований любой локализации осторожно «выдувают»

втранспортную среду, затем среду аспирируют обратно в шприц,

чтобы смыть весь оставшийся на стенках клеточный материал и окончательно «выдувают» все в тот же контейнер со средой.

•Материал в виде жидкости (биологические жидкости, ликвор, моча, смывы) предварительно распределяют по центрифужным пробиркам (V=10мл) и центрифугируют на лабораторной центрифуге в режиме 3000 об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадки собирают в контейнер с транспортной средой. Крышку контейнера с полученным материалом плотно закручивают, флакон подписывают и отправляют в лабораторию.

•Материал в виде жидкости можно сразу собирать в контейнеры с эквивалентным количеством транспортной среды.

•Предельно допустимое время между взятием материала и началом фиксации материала зависит от локализации клеточного материала, температуры воздуха, но не должно превышать нескольких часов.

3.2.Доставка, прием и регистрация биологического материала

Материал, помещенный в транспортную среду, устойчив к колебаниям температуры; в зависимости от характеристик среды его можно хранить в течение нескольких недель или месяцев и использовать для повторного приготовления мазков или проведения молекулярногенетических исследований [7].

Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:

––правильность оформления направления, которое должно соответствовать утвержденной Минздравом РФ форме (Форма № 203/ у-02 «Направление на цитологическое диагностическое исследование и результат исследования», утверждена приказом Минздрава России от 24.04.2003 г. № 174);

Выпуск 2

80	Стандартизованная аналитическая технология

––в бланке-направлении ФИО и возраст пациента, № истории болезни или амбулаторной карты, отделение, диагноз, происхождение материала: откуда и как был взят материал; данные анамнеза, сведения о проводимой терапии;

––маркировку контейнеров со стабилизирующим раствором (на них должны быть нанесены код или фамилия пациента, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для исследования). Лаборант должен зарегистрировать доставленный материал в установленном порядке.

3.3.Перемешивание (встряхивание) материала на шейкере (для некоторых систем)

Для получения клеточной суспензии, на первом этапе методика предусматривает встряхивание контейнеров с помощью шейкера; для этого контейнеры с полученным материалом помещаются на поднос шейкера и перемешиваются (встряхиваются); все манипуляции необходимо проводить в строгом соответствии с инструкцией производителя.

3.4.Стандартизация пробы клеточной суспензии с помощью нефелометра (для некоторых систем)

Внекоторых системах для получения препаратов со стандартизованным содержанием клеток необходимо провести предварительную оценку клеточности материала. Пробы с низким содержанием клеток должны быть предварительно сконцентрированы, пробы с очень высоким содержанием – разведены [8].

Оценка клеточности суспензии выполняется с помощью нефелометра, который позволяет классифицировать образцы в зависимости от концентрации клеточной суспензии. При нефелометрии определяется плотность клеточной взвеси по интенсивности рассеянного

вней света, которая пропорциональна количеству клеток в образце. В зависимости от класса клеточности, который показывает нефелометр, для приготовления стандартного образца необходимо брать определенный объем пробы. Условно принята градация образцов по концентрации клеточной суспензии на несколько классов. Чем больше мутность (класс клеточности), тем меньший объем пробы необходимо взять для приготовления стандартного препарата. В качестве разба-

вителя используют по одной капле буферного солевого раствора или стандартной среды для культуры тканей или две капли сывороточного бычьего альбумина, которые способствуют адгезии клеток на стекле.

Стандартизация аналитических технологий лабораторной медицины