2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология от Насти

Лабораторная диагностика вирусных инфекций.

Используют методы экспресс-диагностики для обнаружения возбудителя или его антигенов в клиническом материале (ИФА, РИА, метод молекулярной гибридизации, ИФА, ПЦР, ВИЭФ, РПГА, электронной микроскопии, иммуно электронной микроскопии).

Выделение вируса и его индикацию и идентификацию проводят в вирусологическом методе диагностики.

С этой целью необходимо обеспечить взятие материла от больного, правильную транспортировку его в лабораторию и грамотного заполнения сопроводительных документов.

Выделение вируса из клинического материала проводят путем заражения культур клеток куриных эмбрионов и лабораторных животных.

Индикацию вирусов проводят по гибели эмбрионов, постановке РГА, ЦПД в культуре клеток. Идентификацию вирусов проводят с помощью серологических методов (постановки РТГА, РСК, ИФА, РИА, РН).

Серологическая диагностика вирусных инфекций проводится с парными сыворотками больного, взятыми в острой фазе заболевания и через 10-14 дней.

Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител рассматривается как диагностический признак острой вирусной инфекции.

2. Вакцины. Определение. Современная классификация вакцин. Требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам. (69)

Вакцинация – целенаправленное введение в организм человека заданного антигена в неагрессивной форме и в иммуногенных дозах с целью индукции защитного иммунного ответа и формирования иммунологической памяти (клеток памяти) для профилактики реального инфекционного заболевания в будущем.

Взависимости от состояния иммуногена выделяют различные виды вакцин: живые,

инактивированные, химические, а также анатоксины.

1. Живые вакцины готовятся из апатогенных возбудителей, ослабленных (аттенуированных) в искусственных или естественных условиях.

Вакцинные штаммы утрачивают свои патогенные свойства и теряют способность вызывать у человека инфекционное заболевание, но сохраняют способность размножаться в месте введения, а в дальнейшем в лимфатических узлах и внутренних органах.

Инфекция, искусственно вызванная введением вакцины, продолжается в течение определенного времени, не сопровождается клинической картиной заболевания и стимулирует образование иммунитета к патогенным штаммам микроорганизмов.

Вединичных случаях могут возникнуть заболевания, вызванные непосредственно введением вакцины. Иногда причиной является ослабленный иммунитет прививаемого, иногда — остаточная вирулентность вакцинного штамма. Живые вакцины создают более длительный и прочный иммунитет, чем инактивированные и химические вакцины.

Следует соблюдать ряд требований для сохранения вакцин.

•живые вакцины следует хранить и транспортировать при температуре 4-8 °С;

•замораживание живых вакцин не оказывает существенного влияния на их активность;

•живые вакцины быстро утрачивают иммуногенные свойства в результате нагревания и иногда при комнатной температуре;

•потеря вакуума (нарушение целостности ампул) может привести к гибели препарата, вызванной проникновением воздуха и влаги; если содержимое ампулы изменило свой внешний вид или на ампуле заметны трещины, такие ампулы следует уничтожить;

•в процессе работы с вакцинами (то есть при вскрытии ампул, растворении вакцин и обработке инструментов) обязательно нужно следить за тем, чтобы препарат не подвергался воздействию повышенной температуры и не соприкасался с дезинфицирующими веществами, которые способны инактивировать микроорганизмы.

•эффективность вакцинации может быть значительно понижена вследствие применения иммуноглобулинов, сульфаниламидов и антибиотиков за несколько дней до введения вакцины и через месяц — полтора после.

Живыми являются вакцины против гриппа, кори, эпидемического паротита, полиомиелита, сибирской язвы, туберкулеза, туляремии, чумы, бруцеллеза и др.

111

2. Инактивированные (убитые) вакцины. Пполучают путем полного обезвреживания бактерий и вирусов с сохранением их иммуногенных свойств. Различают цельноклеточные, субъединичные, рекомбинантные вакцины и сплит-вакцины.

Цельноклеточные (цельновирионные) вакцины приготовляют путем лиофилизированного высушивания (при низкой температуре в условиях вакуума), нагревания или обработки химическими веществами (формалином, формальдегидом).

К ним относятся вакцины против коклюша (АКДС), вирусного гепатита А («Вакта», «Аваксим», «ГЕП-А-ин-ВАК»), клещевого энцефалита («Концентрированная сухая вакцина»), «Инактивированная цельновирионная гриппозная вакцина», «Холерная вакцина», «Лептоспирозная концентрированная жидкая вакцина» и др.

Субъединичные вакцины содержат только поверхностные антигены, что позволяет уменьшить в вакцине содержание белка и, следовательно, снизить ее аллергеность.

Рекомбинантные вакцины относятся к новому поколению иммунных препаратов, произведенных посредством встраивания антигена вируса в геном дрожжевых клеток.

Представителем данной группы является вакцина против вирусного гепатита В.

Хранение и применение инактивированных вакцин:

•эта группа препаратов теряет свою иммуногенность и увеличивает реактогенность при замораживании;

•вакцины должны храниться при температуре 4-8°С;

•для создания длительной защиты требуется неоднократное введение инактивированных вакцин (так как их эффективность ниже, чем у живых).

3. Химические вакцины. Препараты, содержащие наиболее активные по иммунологическим свойствам антигены (протективные), извлекаемые из микробных клеток путем выделения изолированных антигенных комплексов.

Преимущества химических вакцин:

1)они менее реактогенны;

2)стабильны и лучше стандартизируются.

Анатоксин - это экзотоксин, лишенный токсических свойств, но сохранивший антигенные свойства. Они легко дозируются и комбинируются с другими вакцинами. При введении анатоксинов вырабатывается антитоксический иммунитет. Используют дифтерийный, столбнячный,

стафилококковый анатоксины, а также анатоксины против ботулизма и газовой гангрены.

Различают:

•моновакцины, предназначенные для профилактики одного инфекционного заболевания (противокоревая, против гепатита В, брюшнотифозная и т. д.);

•поливалентные вакцины, в состав которых входят антигенные комплексы из разных штаммов одного вида микроорганизмов (противогриппозная);

•комбинированные или ассоциированные вакцины, которые содержат антигенные комплексы несколько видов микроорганизмов, обеспечивающие формирование иммунитета против нескольких заболеваний одновременно (АКДС – адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина).

Требования, предъявляемые к вакцинам:

•иммуногенной, т. е. должна обеспечивать длительную и надежную противоинфекционную защиту;

•безопасной (ареактогенной), т. е. должна индуцировать протективный иммунитет с минимальными побочными эффектами для большинства вакцинированных;

•доступной для массового использования, что определяется низкой себестоимостью и простым способом введения;

•должна обладать достаточной биологической стабильностью при транспортировке и хранении.

3. Возбудители ОРВИ. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболеваний. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение. (135)

ОРВИ – заболевания органов дыхания.

1.Вирусы гриппа А, В, С (Orthomyxoviridae).

2.Парамиксовирусы (Paramyxoviridae):

•род Paramyxovirus – вирус парагриппа человека, птиц, паротита и болезни Ньюкасл;

•род Pneumovirus – респираторно-синтициальный вирус;

•род Morbillivirus – вирус кори.

3.Респираторные коронавирусы (Coronaviridae).

112

4.Респираторные реовирусы (Reoviridae).

5.Пикорнавирусы (Picornaviridae):

•род Rhinovirus (более 100 сероваров)

•род Enterovirus (вирусы Коксаки и ЕСНО). II. ДНК-вирус

1.Респираторные аденовирусы (Adenoviridae).

Структура:. Средние размеры, сферическую, палочковидную или нитевидную формы. Большая часть возбудителей ОРВИ содержит однонитчатую РНК, кроме реовирусов, обладающих двунитчатой РНК, и ДНК-содержащих аденовирусов. Некоторые из них окружены суперкапсидом.

Антигенная структура: сложная. У вирусов каждого рода есть общие антигены. Вирусы имеют типоспецифические антигены, по которым можно проводить идентификацию возбудителей с определением серотипа. Большинство вирусов ОРВИ обладает гемагглютинируюшей способностью. РТГА основана на блокировании активности гемагглютининов вируса специфическими антителами. Культивирование: Оптимальная— культуры клеток. Для каждой группы вирусов подобраны наиболее чувствительные клетки (для аденовирусов —эмбриональные клетки почек; для коронавирусов — эмбриональные клетки и клетки трахеи).

В зараженных клетках вирусы вызывают ЦПЭ (цитопатический эффект).

Культуры клеток используют также при идентификации возбудителей с цитолитической активностью (например, аденовирусов) - применяют реакцию биологической нейтрализации вирусов в культуре клеток (РБН или РН вирусов).

В основе — нейтрализация цитолитического действиявирусов типоспецифическми антителами. Иммунитет: вируснейтрализующие специфические IgA (обеспечивают местный иммунитет) и клеточный иммунитет. Местная выработка аинтерферона, появление которого в носовом отделяемом приводит к значительному снижению количества вирусов.

Особенность ОРВИ - формирование вторичного иммунодефицита.

Постинфекционный иммунитет - нестойкий, непродолжительный, типоспецифический. Микробиологическая диагностика. Материал для исследования носоглоточная слизь, мазкиотпечатки и смывы из зева и носа.

Экспресс-диагностика. Обнаруживают вирусные антигены в инфицированных клетках. Применяют РИФ (прямой и непрямой методы) с использованием меченных флюорохромами

специфических антител, а также ИФА. Для труднокультивируемых вирусов используют генетический метод (ПЦР).

Вирусологический метод. Индикацию вирусов в зараженных лабораторных моделях проводят по ЦПЭ, а также РГА и гемадсорбции (для вирусов с гемагглютинирующей активностью), по образованию включений (внутриядерные включения при аденовирусной инфекции, цитоплазматические включения в околоядерной зоне при реовирусной инфекции и т. п.), а также по образованию «бляшек», и «цветной пробе».

Идентифицируют вирусы по антигенной структуре в РСК, РПГА, ИФА, РТГА, РБН вирусов. Серологический метод. Противовирусные антитела исследуют в парных сыворотках больного, полученных с интервалом в 10 дней. Диагноз ставят при увеличении титра антител как минимум в 4 раза. При этом определяется уровень IgG в таких реакциях, как РБН вирусов, РСК, РПГА, РТГА. Лечение: эффективного этиотропного - нет; неспецифическое – аинтерферон, оксолин (глазные капли), при вторичной бактериальной инфекции – антибиотики.

Основное лечение - симптоматическое/патогенетическое. Антигистаминные препараты. Профилактика: Специфической – нет, неспецифическая – противоэпидемические мероприятия. Для профилактики аденовирусов – пероральные живые тривалентные вакцины.

4. Биологический метод исследования. (90)

Биологический метод исследования - совокупность способов искусственного воспроизведения клинической картины инфекционных болезней или их синдромов на лабораторных животных.

Этот метод преследует также ряд других целей:

1.Диагностика инфекционных болезней.

2.Выделение и идентификация чистой культуры.

3.Определение вирулентности.

4.Выделение и идентификация экзотоксинов.

5.Культивирование вирусов.

6.Получение иммунопрепаратов.

113

7.Проверка безвредности и эффективности лечебных препаратов (в т.ч. химиопрепаратов, иммунопрепаратов) и другие.

Этапы метода:

1.Забор материала.

2.Обработка материала.

3.Выбор лабораторного животного, исходя из его чувствительности к предполагаемому возбудителю, его стандартизация и маркировка.

4.Заражение животных одним из способов (подкожный, внутрикожный, внутрибрюшинный, внутримышечный, интрацеребральный, внутривенный, в желудок, интраназальный и др.) в зависимости от тропизма микроба.

5.Регистрация признаков болезни зараженного животного или его смерти.

6.Прижизненный забор материала от животного и проведение бактериологического и серологического исследования, постановка аллергической пробы.

7.Вскрытие, изучение патологоанатомической и патоморфологической картины, протокольный посев органов павших или убитых животных (для выявления обсемененности и выделения чистой культуры). Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов.

8.Идентификация выделенной культуры.

9.Заключение по результатам исследования.

Оценка метода: Метод высокочувствителен, может быть использован на ранних этапах болезни, но не всегда доступен, дорог, длителен, небезопасен.

Билет 30 1. Бактериофаги. Определение, типы взаимодействия с бактериальной клеткой. Понятие о лизогении. (30)

Бактериофаги – вирусы, которые инфицируют только бактерии. Они имеют смешанный тип симметрии капсида.

Бактериофаг состоит из:

капсидная головка – внутри нуклеиновая кислота

шейка

хвостовой отросток – заканчивается базальной пластинкой с шипами

фибриллы

Бактериофаги взаимодействуют с клетками бактерий по тем же механизмам, что и другие вирусы с клетками человека и животных.

Продуктивный способ взаимодействия бактериофагов с бактериями

1.Адсорбция вируса на клетке бактерии

2.Проникновение НК бактериофага в клетку бактерии Отличие бактериофагов от других вирусов состоит в том, что они никогда сами не проникают в клетку. После адсорбции на бактерии они впрыскивают свою нуклеиновую кислоту внутрь, капсид остается снаружи.

3.Репликация вирусной НК

4.Синтез вирусных белков

5.Самосборка вирионов

6.Выход вирионов из клетки

Еще одно отличие бактериофагов от других вирусов состоит в том, что они всегда разрушают бактерию при выходе из клетки, то есть подвергают бактерию лизису.

Абортивный точно также начинается, как продуктивный, но завершается на одном из этапов:

либо из-за резистентности бактерии к данному бактериофагу,

либо из-за неразрешающих условий, либо из-за дефектных бактериофагов.

Интегративный способ взаимодействия бактериофагов с бактериями (лизогения)

Начинается так же, как и продуктивный, но после впрыскивании НК репликации генома вируса не происходит. Нуклеиновая кислота встраивается в нуклеоид бактерии, и начинается их совместная репликация.

114

Профаг – вирусная НК, встроенная в нуклеоид бактерии.

Лизогенная культура – новая культура бактерий со встроенным профагом.

Одна из наиболее важных функций лизогении с медицинской точки зрения – это синтез некоторых экзотоксинов бактерией, например дифтерийный, ботуллотоксин, холероген и эритрогенные токсины кодируются генами интегрированного профага.

Фаговая конверсия – получение бактерией новых свойств в результате экспрессии интегрированных генов профага. Она запускается трансдукцией бактериальных генов от бактерии-донора к бактерии реципиента с помощью бактериофага.

Эта особенность передачи генетической информации бактерии с помощью бактериофага используется в генной инженерии для образования бактерий с новыми/нужными свойствами. Если бактерия подвергается определенным воздействиям, например ультрафиолету, ДНК профага вырезается из бактериальной ДНК и фаг продолжает уже литический цикл, который заканчивается продукцией новых дочерних фагов.

Применение бактериофагов

1.В генной инженерии:

для трансдукции – естественной передачи генов между бактерии

как векторы, переносящие участки ДНК

115

с помощью фагов можно конструировать направленные изменения в геноме хозяйской ДНК

2.В пищевой промышленности:

в массовом порядке фагосодержащими средствами обрабатывают готовые к употреблению продукты из мяса, мяса птицы

применяют на производстве продуктов питания из мяса, мяса птицы, сыров, растительной продукции

3.В с/х:

распыление фагопрепаратов для защиты растений и урожая от гниения и бактериальных заболеваний

для защиты скота и птицы от инфекций и бактериальных заболеваний

4.В медицине:

для лечения бактериальных инфекций, вызванных антибиотикорезистентными бактериями

Преимущества использования бактериофагов в медицине:

1. Бактериофаги – антибактериальные агенты и природные антисептики 2. Безопасны и не токсичны, не имеют побочных эффектов, применяются у новорожденных детей, беременных и кормящих женщин

3. Действие бактериофагов не затрагивает полезную микрофлору организма, в отличие от антибиотиков 4. Бактериофаги совместимы со всеми лекарственными препаратами. Применение бактериофагов не ограничивает использование других лекарств и не влияет на их эффективность 5. Воздействует лишь на чувствительные к ним болезненные бактерии, вызывающие инфекционные заболевания, разрушая их изнутри 6. Бактериофаги выводятся из организма естественным путем.

2. Иммунные сыворотки, препараты иммуноглобулинов. Классификация, получение, области применения. (70)

Иммунные сыворотки: иммунологические препараты на основе антител.

●1. Антитоксические - сыворотки против дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, т.е. сыворотки, содержащие в качестве антител антитоксины, которые нейтрализуют специфические токсины.

●2. Антибактериальные - сыворотки, содержащие агглютинины, преципитины, комплементсвязывающие антитела к возбудителям брюшного тифа, дизентерии, чумы, коклюша.

●3. Противовирусные сыворотки (коревая, гриппозная, антирабическая) содержат вируснейтрализующие, комплементсвязывающие противовирусные антитела.

Иммунные сыворотки получают путем гипериммунизации животных (лошади) специфическим антигеном (анатоксином, бактериальными или вирусными культурами и их антигенами) с последующим, в период максимального антителообразования, выделением из крови иммунной сыворотки.

Иммунные сыворотки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Для получения гомологичных нечужеродных иммунных сывороток используют сыворотки переболевших людей (коревая, оспенная сыворотки)

или специально иммунизированных людейдоноров (противостолбнячная, противоботулиническая), содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания.

Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины.

Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами. Иммунные сыворотки создают пассивный специфический иммунитет сразу после введения.

Применяют с лечебной и профилактической целью. Для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для лечения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва). С лечебной целью сывороточные препараты в/м.

Профилактически: в/м лицам, имевшим контакт с больным, для создания пассивного иммунитета.

3. Возбудитель гриппа. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболевания. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение на современном этапе. (136)

Таксономия: семейство – Orthomyxoviridae, род Influenzavirus. Различают 3 серотипа вируса гриппа: А, В и С.

116

Структура вируса гриппа. Возбудитель гриппа имеет однонитчатую РНК, состоящую из 8 фрагментов. Капсомеры уложены вокруг нити РНК по спиральному типу. Вирус гриппа имеет также суперкапсид с отростками.

Вирус полиморфен: встречаются сферические, палочковидные, нитевидные формы.

Антигенная структура. Принадлежность вируса гриппа к роду А, В или С определяется антигенными различиями внутренних белков вириона (M1 и NP).

Дальнейшее деление на серотипы определяется антигенными различиями поверхностных гликопротеинов – гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NА). Различаются 16 разновидностей (серотипов) НА и 9 серотипов NА.

Эпидемическое значение для людей имеют вирусы, содержащие три подтипа HA (H1, H2, H3) и два подтипа NA (N1, N2).

Увирусов гриппа А и В всегда присутствуют NA и НА в качестве основных структурных и антигенных компонентов вирусной частицы, обладающих гемагглютинирующей и нейраминидазной активностями.

Увируса гриппа С нет нейраминидазы, он обладает вместо этого гемагглютинин-эстеразным

(проникающим) белком (HEF).

Вирусы гриппа А (в меньшей степени В) обладают способностью к изменению структуры НА и NА. Эпидемиология. Источник инфекции - человек с явными и стёртыми формами болезни. Эпидемиологическую опасность больного человека определяют количество вирусов в отделяемом верхних дыхательных путей и выраженность катарального синдрома. Механизм передачи – аэрозольный. Путь передачи - воздушно-капельный.

Патогенез. Нейраминидаза помогает вирусным частицам проникать через слизистые секреты к рецепторам клеток цилиндрического эпителия респираторного тракта (входные ворота), а также способствует деструкции клеток макроорганизма. Гемагглютинин обеспечивает адгезию вируса. Размножение вируса в клетке занимает 4-6 ч. Дегенеративные изменения в цитоплазме и ядрах поражённых клеток приводят к их гибели и отторжению.

Вирус освобождается и проникает в соседние клетки. Вирус распространяется на большое количество клеток. Гемагглютинин также повреждает эритроциты и активизирует образование тромбов. Патологический процесс может распространяться на легочную ткань (что чаще всего наблюдается у маленьких детей и у лиц преклонного возраста), и в таком случае развивается первичная геморрагическая пневмония, вызванная вирусом гриппа, нередко приводящая к смертельному исходу. Иммунитет: Постинфекционный иммунитет напряженный и продолжительный, но носит выраженный типоспецифический характер.

При гриппе, вызванном вирусом типа А, длится 1-3 года, а вирусом типа В - 3- 4 года. Формирующаяся клеточная иммунологическая память.

Микробиологическая диагностика. Диагноз «грипп» базируется на выделении и идентификации вируса, определении вирусных АГ в клетках больного, поиске вирусоспецифических антител в сыворотке больного.

Материал для исследования — носоглоточное отделяемое. Для определения антител исследуют парные сыворотки крови больного.

Экспресс-диагностика. Обнаруживают вирусные антигены в исследуемом материале с помощью РИФ (прямой и непрямой варианты) и ИФА. Можно обнаружить в материале геном вирусов при помощи ПЦР.

Вирусологический метод. Оптимальная модель для культивирования—куриный эмбрион. Индикацию вирусов проводят в зависимости от лабораторной модели (по гибели, по клиническим и патоморфологическим изменениям, ЦПД, образованию «бляшек», «цветной пробе», РГА и гемадсорбции).

Идентифицируют вирусы по антигенной структуре. Применяют РСК, РТГА, ИФА, РБН (реакцию биологической нейтрализации) вирусов и др.

Обычно тип вирусов гриппа определяют в РСК, подтип — в РТГА.

Серологический метод. Диагноз ставят при четырехкратном увеличении титра антител в парных сыворотках от больного, полученных с интервалом в 10 дней. Применяют РТГА, РСК, ИФА, РБН вирусов.

Лечение: 1. Противовирусные препараты – ремантадин, интерферон, анаферон, арбидол, гриппферон, амиксин, оксококкцилум, противогриппозный иммуноглобулин и др.

2. Симптоматическая и патогенетическая терапия – постельный режим в первые 3-5 дней, обильное теплое питье, жаропонижающие средства.

117

Профилактика: 1. Вакцинация – живые, убиты, субвирионные и субъединичные противогриппозные вакцины (гриппол, инфлювак, флюарикс и др.).

2.Использование в профилактических дозах препаратов-индукторов интерферона.

3.Противоэпидемиологические и санитарно-гигиенические мероприятия: Выявление и изоляция больных, Введение карантина при высокой заболеваемости, Соблюдение правил личной гигиены.

4.Методы культивирования облигатных анаэробов. (91)

Условия культивирования:

Анаэробы –пониж. содер. кислорода, облигатные- при его отсутствии (посев материала внутрь жидкой или полутверд.среды)

Первый день. Материал (прогр. на кипящей водяной бане в теч. 10-20 мин) засевают в пробирку со ср. Китта-Тароцци=> охладить до 30-37 С. При выделении споровых форм анаэробов засеянную среду вновь прогревают на водяной бане при 80 С в теч. 20 мин для уничтожения неспоровых форм бактерий, затем инкубируют в терм. при 37 С.

Второй день. Просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму. В положит. случае обнаруж. помутнение и пузырьки газа в среде и крупные споровые грамполож. палочки.

Для выделения чистой культуры по методу Цейслера петлю материала из среды Китта-Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и распределяют шпателем по поверхности среды, затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей чашек для получения изолир. колоний.

По методу Вейтберга одну или две петли материала из среды Китта-Тароцци вносят в пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно прокипяченным остуженным до 50 С сахарным мясо-пентонным агаром, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки.

Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей воды, при этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара.

Третий день. Выросшие на чашках или в глубине агара в узких пробирках колонии изучают с помощью лупы. На месте отобранной для выделения чистой культуры колонии делают распил пробирки, колонию отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат.

Питательные среды и культивирование на них анаэробов.

1.Жидкие питательные среды. А)Мясо пептонный печеночный бульон – Среда Китт-Тороццы-

является основной жидкой питательной средой Для его приготовления используется 1000 г. бычьей печени, которую заливают 1.л водопроводной воды и стерилизуют 40 мин. При t=110 С - разводят 3-х кратным количеством МПБ - устанавливают рн=7,8-8,2 - + на 1 л. бульона 1,25 г. Nacle - добавляют маленькие кусочки печени - на поверхность среды наслаивают вазелиновое масло - автоклавируют t=10112 C – 30-45 мин.

Б) Мозговая среда. Состав – свежий мозг крс(не позже 18 часов),очищают от оболочек и измельчают на мясорубке - смешивают с водой 2 : 1 и пропускают через сито - смесь разливают по пробиркам и стерилизуют 2 часа при t=110

2. Плотные питательные среды. А)Кровяной сахарный агар цейсмера используют для выделения чистой культуры и определения характера роста. Пропись агара Цейсслера - 3% МПА разливают по 100мл. и стерилизуют - к расплавленному агару добавляют стерильно! 10 мл. 20% глюкозы (т. с. 2%)и 15-20 мл.стерильной крови барана, крс, лошади - Подсушивают Б) желатина - столбиком Для определения вида анаэробов необходимо изучать такие их признаки:

Морфологические, культуральные, патологические и серологические с учетом их возможностей к изменчивости.

118

Билет 31 1. Генетика как наука. Строение нуклеиновых кислот и их значение в хранении и реализации наследственной информации. (32)

Генетика – это наука о наследственности и наследуемой и ненаследуемой изменчивости. Бактерии и вирусы (в том числе вирусы бактерий – бактериофаги) оказались наиболее подходящими объектами для изучения природы генетического материала, его организации и функционирования.

Это было обусловлено преимуществами:

1.Гаплоидное строение генома, что позволяет оценить генетические изменения уже в первом поколении бактериальных клеток.

2.Высокая скорость размножения.

3.Относительно простое строение (особенно у вирусов).

4.Удобство культивирования с возможностью быстрого изменения внешних условий.

5.Высокая разрешающая способность генетического анализа микроорганизмов с обнаружением мутаций, возникающих с частотой 10-9 и менее.

6.Способность к комбинативной и мутационной изменчивости.

Наиболее интенсивно изучаемый вид Escherichia coli. Данная бактерия легко культивируется в жидкой питательной среде, содержащей, например глюкозу. Полученную культуру засевают на чашку Петри с питательной средой. После инкубации бактерии начинают быстро делиться и дают на агаре колонии, которые являются потомками единственной микробной клетки. Отсюда можно получить чистую культуру любой мутантной бактерии, присутствовавшей в исходной бактериальной взвеси.

Вклад в генетику внесли исследования с помощью бактериофагов – вирусов бактерий. Заражая фагом (в том числе – и с измененным геномом) чувствительную культуру микроорганизмов, можно получить большую популяцию фаговых частиц.

После инкубации бактерии, размножаясь, образуют на агаре сплошной газон клеток. В местах, инфицированных бактериофагом, образуются негативные колонии или бляшки.

Использование микробиологических систем привело к выдающимся открытиям в генетике.

119

1.На бактериях впервые была установлена химическая природа наследственного материала и заложен фундамент молекулярной генетики (О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти, 1944)

2.На бактериях и фагах решена проблема генетического кода (Дж. Уотсон, Ф. Крик, 1953)

3.Доказан полуконсервативный способ репликации ДНК (М. Мезелсон, Ф. Сталь, 1958).

4.Изучена тонкая структура гена (С. Бензер, 1955)

5.Установлен механизм мутаций и рекомбинаций.

6.Разработана концепция оперона как модели организации генов в хромосоме (Ф. Жакоб, Ж. Моно,

1961)

7.Выявлено наличие информационной (матричной) РНК.

8.Исследования в области генетики микроорганизмов привели к созданию важнейшей прикладной отрасли современной генетики – генной инженерии.

2. Интерфероны. Природа, способы получения и область применения. (71)

Интерфероны – группа белков с противовирусным действием, вырабатываемых эукариотическими клетками в ответ на внедрение в них ряда биологических агентов – интерфероногенов.

В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ. Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами, бета- фибробластами, гамма- вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками. Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действия интерферона.

Интерферон на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков. Интерфероны обладают видоспецифичностью, т е интерферон человека менее эффективен для животных и наоборот.

Получают интерферон двумя способами:

а) путем инфицирования культуры лейкоцитов или лимфоцитов крови человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, к-й затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона.

б) генно-инженерным способом – путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон.

Рекомбинантный интерферон - профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях и при иммунодефицитах.

Интерфероногены - факторы, индуцирующие синтез интерферонов клетками позвоночных животных. Такими св-вами обладают РНК- и ДНК-геномные вирусы, некоторые виды бактерий, актиномицетов, риккетсий, хламидий, микоплазм, токсоплазмы, плазмодии, НК, липополисахариды бактерий, полисахариды грибов, природные полифенолы.

3. Возбудитель бешенства. Таксономия и биологическая характеристика. Эпидемиология и патогенез заболевания. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика.

(141)

Таксономия: РНК-содержащий вирус, семейство Rhabdoviride, род Lyssavirus.

Морфология и антигенные свойства. форму пули, состоит из сердцевины (РНП), окруженной липопротеиновой оболочкой с гликопротеиновыми шипами.

Гликопротеин G отвечает за адсорбцию и внедрение вируса в клетку, обладает антигенными (типоспецифический антиген) и иммуногенными свойствами.

Антитела к нему нейтрализуют вирус и выявляются в РН (рекция нейтрализации).

РНП состоит из геномной однонитевой линейной минус-РНК и белков: N-белка, L-белка и NS-белка. РНП является группоспецифическим антигеном; выявляется в РСК, РИФ, РП.

Различают два вируса бешенства: дикий вирус, циркулирующий среди животных, патогенный для человека; фиксированный – не патогенный для человека.

Культивирование. культивируют путем внутримозгового заражения лабораторных животных (мышей, крыс) и в культуре клеток: фибробластов человека, куриного эмбриона.

Резистентность: неустойчив: быстро погибает под действием солнечных и УФлучей, а также при нагревании до 60С. Чувствителен к дезинфицирующим веществам, жирорастворителям, щелочам и протеолитическим ферментам.

120