2 курс / Нормальная физиология / Молекулярные_и_физиологические_механизмы_старения_в_2_т_,_Т_2_Анисимов

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

2003a). Из табл. 15.24 можно видеть, что пептидные биорегуляторы функции эпифиза оказывают угнетающее влияние на опухоли, вызываемые разными агентами, включая химические канцерогены и ионизирующую радиацию, и разных локализаций (молочная железа, нервная система, почки, толстая кишка).

15.13.3. Механизмы геропротекторного действия пептидов эпифиза

Эффекты эпиталамина и эпиталона во многом совпадают с действием мелатонина. Показано, что эпиталон стимулирует секрецию мелатонина эпифизом, что позволяет предполагать возможность участия мелатонина в реализации эффектов этих препаратов. Один из возможных механизмов влияния эпиталона на продолжительность жизни был выявлен в экспериментах с мышами линий SAM, которые характеризуются ускоренным старением (Розенфельд и др., 2002). У таких мышей повышена частота хромосомных аберраций, что может быть связано с повреждением ДНК активными формами кислорода, продукция которых у мышей SAM усилена. При введении эпиталона мышам SAM частота хромосомных аберраций у них достоверно снижалась на 20—30 %, что может быть связано с активацией антиоксидантной защиты.

Влияние эпиталамина на перекисное окисления липидов (ПОЛ) исследовалось на дрозофилах линии ВЭС. Эффект эпиталамина сравнивался с эффектом мелатонина, который может действовать как прямой антиоксидант. Эпиталамин и мелатонин добавлялись к среде содержания личинок дрозофил до концентрации 0.01 % в течение 2—3 дней. Анализ продуктов ПОЛ у взрослых дрозофил показал наличие выраженного полового диморфизма по содержанию кетонов и диеновых конъюгатов, которое у самок было выше, чем у самцов, на 49 и 40 % соответственно, что находится в обратном соотношении с продолжительностями их жизни. Действие эпиталамина на дрозофил проявилось в достоверном снижении содержания кетонов и диеновых конъюгатов (в 3.4 и 2.3 раза соответственно) и ликвидации различий между полами по этим показателям. Кроме того, эпиталамин значи- тельно повышал активность каталазы у самок и самцов и активность СОД у самцов. Вероятно, эти эффекты обусловливает геропротекторную активность эпиталамина. У мелатонина действие на ПОЛ было менее выраженным. Мелатонин не влиял на активность каталазы у самцов, но увеличивал ее у самок и не влиял на СОД у обоих полов (Khavinson, 2002).

Было установлено, что при введении крысам эпиталамин достоверно снижал хемилюминисценцию сыворотки (в 2.8 раза) и перекисное окисление липидов, что выражалось, в частности, в выраженном снижении содержания диеновых конъюгатов (в 4.1 раза), тогда как карбонильные продукты ПОЛ, определяемые по образованию Шиффовых оснований с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), демонстрировали только тенденцию к снижению (на 14 %).

211

В. Н. Анисимов

Рис. 15.15. Влияние эпиталона на выживаемость самок крыс, содержавшихся при разных режимах освещения.

По оси абсцисс — возраст, сут.; по оси ординат — количество крыс, %.

Из этих наблюдений следует, что введение эпиталамина сказывается на начальных этапах ПОЛ. Мелатонин также подавлял ПОЛ, как следует из снижения как диеновых конъюгатов, так и ТБК-реактивных продуктов. Следует отметить, что введение мелатонина приводило к достоверному повышению уровня карбонилированных белков (на 12 %, р < 0.05), тогда как

212

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ðèñ. 15.15 (продолжениå).

эпиталамин не влиял на этот показатель. Через неделю после начала введения эпиталамина активность СОД в крови крыс достоверно возросла на 20 %, тогда как мелатонин снизил активность СОД на 32 %. Те же тенденции наблюдались и в уровне церуплазмина сыворотки, хотя изменения не выходили за пределы нормы (Anisimov et al., 2001).

Наши результаты подтверждают наличие собственной антиоксидантной активности мелатонина. Следует подчеркнуть, что, хотя антиоксидантное

213

В. Н. Анисимов

Рис. 15.16. Влияние эпиталона на развитие спонтанных опухолей у самок крыс, содержавшихся при разных режимах освещения.

По оси абсцисс — возраст, сут.; по оси ординат — количество крыс с опухолями, %.

действие отмечено и у мелатонина, и у эпиталамина, механизмы в этих слу- чаях, скорее всего, разные. У эпиталамина они связаны не с собственной антиоксидантной активностью, а с активацией ферментативных антиоксидантных систем организма. Этому предположению соответствуют данные о том, что мелатонин обладает сходной антиоксидантной активностью in vivo

214

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ðèñ. 15.16 (продолжение).

è in vitro, тогда как эпиталамин более активен in vivo, ÷åì in vitro (Anisimov et al., 2001).

В целом полученные данные свидетельствуют о том, что эпиталамин усиливает антиоксидантную защиту организма, и это может вносить вклад в его геропротекторную активность (табл. 15.25). Антиоксидантное действие эпиталамина может быть опосредовано стимуляцией секре-

215

Â.Н. Анисимов

Òà á ë è ö à 15.24

Влияние эпиталамина и эпиталона на индуцируемый канцерогенез у лабораторных животных

(Anisimov et al., 1994, 2003; Khavinson, 2002)

Âèä	Препарат	Канцерогенный агент	Основная локализация		Эффект
				опухолей
Ìûøè	Эпиталамин	MMTV	Молочная железа
	Эпиталон	HER-2/neu	»	»
	Эпиталамин	Рентгеновское облучение	Кроветворная система
Крысы	Эпиталамин	ÄÌÁÀ	Молочная железа
		ÍÌÌ	»	»
		НММ, трансплацентарно	Нервная система
		НЭМ, трансплацентарно	Нервная система, почки
	Эпиталон	ÄÌÃ	Толстая кишка

П р и м е ч а н и е. ДМБА — 7,12-диметилбез(а)антрацен; ДМГ — 1,2-диметилгидразин; НММ — N-нитрозометилмочевина; НЭМ — N-нитрозоэтилмочевина; MMTV — вирус рака молочной железы мышей.

ции мелатонина, а также активности СОД и других антиоксидантных ферментов.

Таким образом, пептидные биорегуляторы благотворно влияют на продолжительность жизни и частоту развития спонтанных опухолей у животных, а также на ряд факторов, имеющих важное значение в канцерогенезе, в частности свободнорадикальные процессы и иммунные реакции.

Сведения о биологической активности пептидного препарата эпифиза эпиталамина представлены в ряде недавних публикаций (Anisimov at al.,

Ò à á ë è ö à 15.25

Влияние эпиталамина и мелатонина на параметры, характеризующие свободнорадикальные процессы в сыворотке крови крыс

Параметр	Контроль		Мелатонин		Эпиталамин
	(n = 8)			(n = 6)	(n = 10)
Хемилюминисценция сыворотки, ед.	7.40	0.99	4.53	0.61***	2.64	0.61*
Диеновые конъюгаты, нмоль/мг белка	0.99	0.12	0.28	0.36*	0.24	0.04*
Шиффовы основания, ед./мг белка	4.87	0.36	3.39	0.35**	4.17	0.38
Антиоксидантная активность,	0.82	0.03	1.12	0.03*	1.12	0.04*
ед./мг белка
Карбонилированные производные ами-	8.58	0.34	9.59	0.29***	8.02	0.23
нокислот, 10–2 ммоль/мг белка
Активность СОД, ед./мг % белка	1.93	0.03	1.32	0.07*	2.31 0.24*#
Церулоплазмин, мг %	34.7	3.9	29.0	2.1	36.8 3.0##

П р и м е ч а н и е. Для каждого определения сливали вместе образцы сыворотки от 2—3 крыс. Отличия от контроля достоверно: * — p < 0.001, ** — p < 0.01, *** — p < 0.05. Отличие от влияния мелатонина достоверно: # — p < 0.01, ## — p < 0.05.

216

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

Ò à á ë è ö à 15.26

Влияние мелатонина и эпиталона на параметры, характеризующие свободнорадикальные процессы у мышей

Орган и параметр	Контроль			Мелатонин			Эпиталон
Головной мозг
Хемилюминисценция, 104 ед./мг белка		7.9		76.9	7.7		72.2	10.1*
	94.1
Общая антиоксидантная активность,	3.1	0.2		3.6	0.25		3.8	0.3
ед./мг белка
Диеновые конъюгаты, нмоль/г ткани	22.3	0.9		19.0	0.65*		21.9	1.3
Шиффовы основания, ед./г ткани	388	25		276	13*		281	16**
Активность супероксиддисмутазы,	23.4	1.8		23.5	1.7		27.4	2.3
ед./г белка
	Печень
Хемилюминисценция, 104 ед./мг белка		10.4		79.4	6.8		79.1	11.3
	78.4
Общая антиоксидантная активность,	4.7	0.5		4.8	0.2		4.1	0.3
ед./мг белка
Диеновые конъюгаты, нмоль/г ткани	66.4	2.2		59.6	1.52*		57.1	1.4**
Шиффовы основания, ед./г ткани	543	14		459	19**		494	29
Активность супероксиддисмутазы,	35.5	1.6		34.5	1.7		35.9	1.2
ед./г белка
Сыворотка крови
Хемилюминисценция, 104 ед./мг белка		29.8		126.3	23.8*		141.8	19.6*
	224.0
Общая антиоксидантная активность,	1.40	0.15		1.86	0.07***		1.77	0.07***
ед./мг белка
Диеновые конъюгаты, нмоль/г ткани	4.4	0.4		2.5	0.5*		3.8	0.5
Шиффовы основания, ед./ г ткани	29.2	3.2		26.2	2.5		31.0	3.4

П р и м е ч а н и е. Отличие от контроля достоверно: * — p < 0.05; ** — p < 0.01; *** — p < 0.001.

1994; Khavinson, 2002). Показано, что эпиталамин стимулирует синтез эпифизом серотонина, N-ацетилсеротонина, мелатонина, а также ночную секрецию мелатонина у взрослых и старых крыс. У самок старых крыс данный препарат снижает уровень ЛГ и пролактина, уменьшает порог чувствительности гипоталамо-гипофизарной системы к ингибирующему действию эстрогенов. Эпиталамин увеличивает уровень трийодтиронина и уменьшает уровень тироксина в сыворотке взрослых крыс, снижает уровень кортикостерона в сыворотке мышей и повышает чувствительность гипоталамо-гипофизарной системы к гомеостатическому торможению адренокортикотропной функции глюкокортикоидами у старых крыс. У кроликов под действием эпиталамина снижается уровень инсулина и триглицеридов в сыворотке крови, тогда как толерантность к глюкозе повышается. В отношении иммунной функции установлено, что у взрослых и старых мышей под действием пептидного препарата эпифиза стимулируется Т- и В-клеточный иммунитет, в сыворотке растет титр тимусного сывороточного фактора (ТСФ), титр тимозиновых

217

В. Н. Анисимов

компонентов, а также колониестимулирующая активность спленоцитов у пинеалэктомированных крыс (Anisimov at al., 1994; Khavinson, 2002). Выше уже отмечалось, что эпиталамин — сильный антиоксидант. Отчетливым антиоксидантным эффектом обладает также эпиталон, как это было установлено в опытах на мышах (Anisimov at al., 2001b) (табл. 15.26).

В поддержании клеточного гомеостаза в тканях принимают участие клетки диффузной нейроэндокринной системы (ДНЭС). Было показано (Khavinson, 2002), что у крыс пинеалоэктомия сопровождается характерными изменениями в соотношениях различных клеток ДНЭС в желудке и щитовидной железе. Введение эпиталона нормализовало эти соотношения. В данном случае возможность того, что действие эпиталона опосредовано эпифизом, исключается. Таким образом, эпиталон может способствовать нормализации тканевого гомеостаза прямым действием на клетки ДНЭС.

Известно, что с возрастом снижается чувствительность гипоталамо-ги- пофизарного комплекса, регулирующего секрецию гонадотропинов, к гомеостатическому торможению их секреции эстрогенами, что вносит вклад в возрастное выключение репродуктивной функции (Dilman, Anisimov, 1979). Эпиталамин, введенный старым самкам крыс, повышал чувствительность гипоталамо-гипофизарной системы к эстрогенам и восстанавливал цикли- ческую деятельность яичников животных с персистирующим эструсом (Анисимов и др., 1973). В то же время эпифизэктомия, а также содержание крыс в условиях круглосуточного освещения, угнетающего функцию эпифиза, приводили к ослаблению ингибирующего действия эстрогенов на гонадотропную функцию гипофиза. Эксперименты показали, что тогда как у 38 % самок крыс в возрасте 16—18 месяцев в контрольной группе наблюдались нарушения эстрального цикла (постоянный эструс — 23 %; повторные псевдобеременности — 15 %), у животных, которым вводили эпиталамин, нарушения эстральной функции были выявлены только в 7 % случаев (р < 0.05). У крыс молодого и зрелого возраста (3 и 17—19 месяцев) эпиталамин практически не влиял на соотношение фаз эстрального цикла. У старых крыс (26—28 месяцев) со стойким постоянным эструсом препарат вызывал появление фаз диэструса и восстановление нерегулярного цикла, что характерно для животных более молодой возрастной группы. Сходные данные были получены при введении эпиталона трансгенным мышам HER-2/neu (Anisimov et al., 2002).

Эти наблюдения находятся в соответствии со способностью эпиталамина восстанавливать репродуктивную функцию у крыс. К 16 самкам в возрасте 16—18 месяцев с установившимся постоянным эструсом были подсажены на две недели зрелые (8—10 месяцев) самцы, после чего за крысами продолжали наблюдение в течение 21 дня. Ни в одном случае у крыс беременности не наступило. После этого самкам в течение 3 недель (5 раз в неделю) вводили эпиталамин подкожно в дозе 2 мг. Через неделю после нача- ла инъекций к самкам вновь подсаживали самцов. У 4 крыс было зарегистрировано наступление беременности и рождение 5—9 здоровых крысят у каждой (Анисимов и др., 1973). Таким образом, введение эпиталамина при-

218

Часть V. Модифицирующие факторы старения как средства для изучения его механизмов

вело к восстановлению репродуктивной функции у 25 % животных. Полу- ченные результаты дали основание считать, что эпиталамин позволяет устранять возрастные нарушения (аналогичные механизму климакса у женщин) в репродуктивной системе организма.

Эпиталамин также восстанавливал регулярные эстральные циклы у молодых и старых самок с персистирующим эструсом, индуцированным содержанием животных в условиях круглосуточного освещения. Было отме- чено существенное уменьшение числа фолликулярных кист в яичниках крыс, которым вводили эпиталамин, а также частичную лютеинизацию стенки фолликулярных кист и появление желтых тел, что свидетельствовало об овуляторном действии эпиталамина (Khavinson, 2002).

Полученные результаты свидетельствуют о нормализующем влиянии эпиталамина на репродуктивную функцию у старых животных. У самок крыс под влиянием эпиталамина происходило замедление возрастного выключения репродуктивной функции. При введении препарата старым самкам крыс восстанавливались эстральная функция, овуляция и фертильность. Вероятно, эти эффекты связаны со способностью эпиталамина тормозить возрастное снижение чувствительности гипоталамо-гипофизарного комплекса, регулирующего секрецию гонадотропинов, к действию эстрогенов и повышать эту чувствительность у старых животных (Анисимов и др., 1973). Известно, что в центральной регуляции репродуктивных функций принимают участие паравентральное и супраоптическое ядра гипоталамуса. Введение эпиталамина в течение 10 суток крысам активизировало нейросекреторные клетки в этих ядрах (Khavinson, 2002). При этом отмечено накопление нейросекреторного материала в нейрогипофизе животных.

Однократное или ежедневное введение эпиталамина в течение 5 суток в утренние часы 4—5-месячным самцам крыс приводит к существенному увеличению в эпифизе уровня серотонина, N-ацетилсеротонина и мелатонина в ночное время. У 18—20-месячных крыс аналогичное применение эпиталамина сопровождалось тенденцией ночного подъема уровня мелатонина в эпифизе и в сыворотке крови животных. Как у молодых, так и у старых крыс эпиталамин не влиял на прямое О-метилирование серотонина в 5-метилтриптамин с последующим метаболизмом в 5-метилоксииндолилук- сусную кислоту (Anisimov et al., 1994). При электронно-микроскопическом исследовании эпифизов крыс, которым вводили эпиталамин, были выявлены признаки стимуляции активности пинеалоцитов. Интраназальное введение эпиталона крысам влияло на экспрессию гена c-fos в пинеалоцитах, которая зависит от уровня активации клеток. При интраназальном введении эпиталамина крысам, а также при внесении 10–7 М раствора эпиталамина в среду инкубации изолированного эпифиза крыс наблюдались изменения электрической активности пинеалоцитов (Khavinson, 2002).

О способности эпиталона стимулировать функции эпифиза свидетельствуют результаты, полученные при изучении его действия на нейроэндокринную регуляцию у старых макак-резусов (Khavinson et al., 2001). Эксперименты были выполнениы на 6 молодых половозрелых (возраст 6—8 лет)

219

Â.Н. Анисимов

èстарых (20—26 лет) самках Macaca mulatta. Содержание мелатонина в крови у старых обезьян было достоверно ниже, чем у молодых, особенно вечером. У старых макак эпиталон в 3 раза повышал вечерний уровень мелатонина. У молодых обезьян этот эффект не наблюдался. Эпиталон не оказывал достоверного влияния на уровни ДГЕА, эстрадиола, прогестерона и тироксина. При введении старым макакам эпиталон восстанавливал циркадный ритм содержания кортизола в крови.

Îдействии эпиталона на эпифиз свидетельствует исследование, в котором показано, что внутрибрюшинное введение эпиталона g-облученным крысам сопровождается появлением ультраструктурных признаков усиления секреторной активности пинеалоцитов, нарушенной из-за облучения (Khavinson, 2002).

Предварительные данные, полученные И. Э. Бондаревым и соавт. (2003), говорят о том, что эпиталон в соматических клетках человека может индуцировать экспрессию энзиматического компонента теломеразы, теломеразную активность и элонгацию теломер. Возможно, что в этом может состоять механизм геропротекторного действия пептида.

Способность эпиталона оказывать одинаковое действие на организмы, далеко отстоящие друг от друга в филогенетическом отношении, может объясняться тем, что он действует на уровне транскрипционных факторов, которые относятся к числу наиболее консервативных в эволюционном отношении белков, и при этом на уровне отдельных трансфакторов (даже не их комбинаций) обнаруживается тканевая специфичность в пределах организма одного вида.

15.13.4. Влияние пептидных биорегуляторов на экспрессию генов

В целом ряде экспериментов, описанных выше, были получены данные, свидетельствующие о том, что при действии пептидных препаратов, представляющих собой смеси природных пептидов или отдельные сконструированные пептиды, в тканях организма происходят изменения экспрессии генов. Выдвинута гипотеза, что эффекты пептидов обусловлены их действием на уровне регуляции экспрессии генов (Морозов, Хавинсон, 1996). Для того чтобы исследовать такую возможность более подробно, был проведен эксперимент с применением техники ДНК микрочипов. В использованной модификации этот метод позволяет одновременно определять изменения экспрессии 15 247 генов. С его помощью были исследованы уровни мРНК в сердце мышей до и после введения эпиталона или вилона (Анисимов С. В. и др., 2002). В опытах использовано 30 самок мышей линии СВА, которые получали стандартный лабораторный корм и питьевую воду без ограниче- ний. В возрасте 6 месяцев мыши были случайным образом распределены в 3 группы по 10 особей. Мыши подопытных групп в течение 5 дней получа- ли подкожные инъекции 1 мкг вилона или эпиталона, растворенных в 0.1 мл 0.9%-ного раствора NaCl. Животные контрольной группы получали

220