Рис. 16. Частота определения серотипов высокого и низкого риска ВПЧ (в %)
в образцах серозного и муцинозного рака яичников с использованием метода ПЦР
Рис. 15. Частота определения серотипов высокого и низкого риска ВПЧ (в %) в образцах эпителиального рака яичников с использованием метода ПЦР
Инфекционные агенты и канцерогенез
2.персистенция генома вируса папиллом в эписомальной форме и возможность продукции вирус ных частиц с последующей вторичной инфекцией;
3.интеграция вирусной ДНК в клеточный геном без видимой специфичности сайта интеграции; на эта пах 2 и 3 начинают проявляться функции Е6 и Е7, нарушающих контроль деления клеток;
4.индукция мутаций в клеточной ДНК, вызывающая нестабильность клеточного генома;
5.селекция клона клеток с мутантной ДНК, содержа щих интегрированную ДНК вирусов папилломы;
6.активное размножение данного клона клеток и рост опухоли.
Врамках вирусного канцерогенеза наиболее значим именно третий этап, определяющий новый качественный сдвиг во взаимоотношениях вируса и клетки хозяина.
Интеграция ДНК ВПЧ в геном клеток сопровождается двумя молекулярными событиями:
1.Встраивание вирусной ДНК в хромосому всегда со провождается нарушением структуры гена Е2, ко торый является репрессором Е7.
2.при интеграции ДНК-вируса синтез белка Е2 пре кращается вследствие нарушения структуры соот
ветствующего гена и активируется синтез белка Е7. Таким образом, факт интеграции вирусной ДНК может быть зарегистрирован или изучением структуры гена Е2 (эти методы в стадии разработок) или измерением уровня синтеза онкобелка Е7. Из этого следует, что наличие онкобелка Е7 в пробах из опухоли может рассматриваться как однозначное свидетельство вирус-ассоциированного злокачественного процесса. Неоспоримым достоинством Е7, как маркера, является то, что в норме этот белок в тка-
ГЛАВА б
нях не синтезируется. Его происхождение полностью свя зано с жизненным циклом интегративной формы ВПЧ-ин- фекции. Так же преимуществом метода является то, что берется материал непосредственно из органа-мишени. В нашей работе иммуноферментный анализ выполнен в 34 наблюдениях рака вульвы (28 больных с наличием ВПЧ в опухоли и б больных без ПЦР данных ВПЧ инфекции) — см. табл. 16. Из 28 больных с вирусассоциированным ра ком вульвы у 20 имели место 16 и 18 серотипы. В семи на блюдениях установлены 6/11 серотипы и в одном наблю дении 83 серотип. Во всех наблюдениях вирусассоциированного рака определялся онкобелок Е7.
Таблица 16
Уровень белка Е7 в образцах опухоли рака вульвы
Уровень белка |
Число |
Без ВПЧ |
Серотипы ВПЧ |
|
|||
|
|
|
|
|
|||
Е7 (ng/ml) |
больных |
6/11 |
16 |
18 |
|
83 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Не обнаружен |
15 |
6 |
7 |
|
1 |
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
До 1,0 |
5 |
|
|
2 |
3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1,1-5,0 |
5 |
|
|
4 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5,1 — 10,0 |
2 |
|
|
2 |
- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Более 10,1 |
7 |
|
|
7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Всего |
34 |
б |
7 |
15 |
5 |
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Положительные результаты получены только в тех про бах, где имелись серотипы 16 и 18. Значения онкобелка Е7 были весьма вариабельны и колебались в диапазоне 0,06-12 ng/ml. Из 6 больных с вируснезависимым опухо левым процессом онкобелок Е7 выявлен в 1 наблюдении (1,8 ng/ml), что требует отдельного изучения. Значимость изучения синтеза онкобелка Е7 в вирусиндуцируемых
Инфекционные агенты и канцерогенез
опухолях гораздо более обширна с диагностической, ле чебной и прогностической точек зрения. Специфичность теста на белок Е7, вероятно, для отдельных серотипов различается, что не позволяет сегодня говорить о широ ком его использовании в ранней диагностике рака вульвы, учитывая спектр серотипов ВПЧ, встречающийся при этой локализации злокачественного процесса. В данном же фрагменте исследования мы преследовали одну цель — привнести еще одно доказательство причастности ВПЧ в канцерогенезе рака вульвы.
Следующая локализация, не относящаяся к тради ционной модели плоскоклеточного рака — рак яичников. Интерес к этой локализации определялся тем, что в груп пе эпителиальных раков яичника отсутствует вариант пло скоэпителиального процесса. Следовательно, учитывая тропность папилломовирусной инфекции к плоскому эпи телию, как бы автоматически снимался вопрос о причаст ности этой инфекции в генезе эпителиального рака яични ков. Вместе с тем, в литературе имеются сведения о нали чии ВПЧ в образцах неопластической трансформации эпителия яичников и эта частота варьирует от 32% до 52% (5, 14, 24, 36, 37, 38). Предметом изучения в настоя щем разделе явились образцы ткани яичников 67 боль ных эпителиальным РЯ и 25 пациентов контрольной груп пы без признаков злокачественной патологии яичников
(б). Из таблицы /7видно, что при ДНК-диагностике ПВИ в 51 (76,1%) из 67 наблюдений ЗЭОЯ ВПЧ был положи тельным (р<0,001). И только в 2 из 25 случаев (8,0%) нор мальных тканей яичников зарегистрированы позитивные результаты (р<0,001). Причем, частота определения ВПЧ в образцах серозного (п=52) и муцинозного (п=15) РЯ имела практически одинаковые значения — 75,0% и
Инфекционные агенты и канцерогенез
матки, рак вульвы и рак влагалища продемонстрирована некая условность градации ПВИ в соответствии с ее он кологическим потенциалом, которая вероятно обусло влена локализацией опухолевого процесса. Поэтому в данной работе нами была проведена идентификация ДНК максимально широкого спектра типов ВПЧ как вы сокого онкологического риска, так и относящихся к низ кой степени риска.
Установлено, что с наибольшей частотой эпителиаль ный РЯ ассоциируется с ВПЧ-18 (29,9%), ВПЧ-52 (29,9%), ВПЧ-55 (26,9%), ВПЧ-83 (17,9%), ВПЧ-39 (16,4%) серотипами. ПВИ 73, 31, 51, 45, 33, 66, 68 и 16 ти пов определялась в 11,9%; 10,4%; 9,0%; 6,0%; 4,5%; 3,0%; 3,0% и 3,0% наблюдений, соответственно, (рис.15). Наряду с этим, ни в одном образце эпителиаль ного РЯ не отмечено присутствие ВПЧ-35, ВПЧ-58 и ВПЧ59 типов и ВПЧ т. н. низкого онкологического риска.
Как правило, в большинстве случаев (53,0%) опреде лялось сочетание двух и более серотипов ВПЧ высокого онкологического риска. Изолированная форма инфекции отмечена в 24 образцах (47,0%), из которых в 9 (37,5%) наблюдениях был выявлен 18 тип ВПЧ, в 6 (25,0%) на блюдениях — 52 серотип, по 3 (12,5%) наблюдений — 39 и 55 тип и по 1 наблюдению — 31, 51 и 31 серотипы. Не отмечено изолированных вариантов при детекции 16, 33, 45,68, 73 и 83 типов ПВИ.
Следует особо остановиться на случаях определения 16 и 18 серотипов ВПЧ в овариальных пробах. Так, доля больных эпителиальным РЯ положительных по этому признаку в нашем исследовании составила лишь 32,9%. Аналогичные данные были получены в исследовании опу холевой ткани яичников методом ПЦР-диагностики HJ.
ГЛАВА 6
80,0% соответственно (р>0,05). То обстоятельство, что ПВИ при различных вариантах РЯ выявляется статистиче ски достоверно выше, чем в нормальных тканях, позволя ет предположить ее причастность к возникновению и раз витию ЗЭОЯ.
Таблица 17
Частота определения ВПЧ (абс. число/%) в образцах опухолевой и нормальной тканях яичников с использованием метода ПЦР
Группа |
Число |
ВПЧ-позитивные |
ВПЧ-негативные |
|
исследования |
больных |
образцы |
образцы |
|
|
|
|
|
|
Эпителиальный |
67 |
5 1 * |
16 |
|
рак яичников |
100% |
76,1% |
23,9% |
|
в том числе: |
|
|
|
|
52 |
39** |
13 |
||
Серозный рак |
||||
100% |
75,0% |
25,0% |
||
яичников |
||||
|
|
|
||
Муцинозный |
|
|
|
|
15 |
12** |
3 |
||
рак яичников |
100% |
80,0% |
20,0% |
|
|
|
|
|
|
Контрольная |
25 |
2* |
23 |
|
группа |
100% |
8,0% |
92,0% |
|
|
|
|
|
*р<0,001;**р>0,05
В дальнейшем наши взгляды были устремлены в на правлении изучения гипотетически значимых серотипов ПВИ в онкогенезе РЯ. Надо сказать, что в мировой лите ратуре существуют только сведения о детекции ВПЧ 16 и 18 типов в опухолевой ткани яичников (5, 36, 37). Более того, на моделях канцерогенеза злокачественных ново образований генитального тракта, включая рак шейки
ГЛАВА 6
Yang et al. (37). В то же время, результаты некоторых ис следовательских работ, представленных в мировой перио дической литературе с использованием методик иммуногистохимического анализа и гибридизации in situ, показа ли присутствие ПВИ 16 и 18 серотипов приблизительно в половине случаев ( 1 , 36). По всей вероятности, противоре чивость полученных результатов может быть обусловлена использованием методов детекции вирусных инфекций, которые в сравнении с ПЦР-диагностикой обладают мень шей чувствительностью и специфичностью.
Значительный научный интерес представляло изучение вопроса о своеобразии ассоциации различных серотипов ПВИ при серозном и муцинозном вариантах ЗЭОЯ (рис.16). Проводя анализ полученных нами данных, выяс нилось, что муцинозный РЯ с наибольшей частотой соче тается с ВПЧ 18 (80,0%) серотипа (р<0,001), а при сероз ном РЯ в большинстве овариальных проб выявлено при сутствие ВПЧ 52 (36,5%) и 55 (32,7%) типов (р<0,01). Разница статистически достоверна.
Однако поскольку верификация диагноза ЗЭОЯ вклю чает в себя проведение пункции брюшной полости через задний свод влагалища, что может увеличивать вероят ность распространения вирусной инфекции, и как след ствие приводить к ложноположительным результатам, мы сочли возможным проанализировать частоту выявления спектра серотипов ВПЧ в группах пациентов с наличием пункции на диагностическом этапе и без нее. Нами не бы ло отмечено существенных различий частоты детекции серотипов ВПЧ в исследуемых группах пациентов (табл. 18). Это дает нам право аргументировано утвер ждать об истинности статуса ВПЧ-инфекции в опухолевой ткани яичников.
Инфекционные агенты и канцерогенез
Таблица 18 Частота определения серотипов ВПЧ (абс. число/%) в образцах опухолевой ткани яичников с учетом пункции
брюшной полости
Группа |
Число |
|
Частота серотипов ВПЧ |
|
|||
исследования |
больных |
18 |
39 |
52 |
55 |
83 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
без пункции |
30 |
13 |
7 |
12 |
11 |
9 |
|
100,0% |
43,3% |
23,3% |
40,0% |
36,7% |
30,0% |
||
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
с пункцией |
21 |
7 |
4 |
8 |
7 |
3 |
|
100,0% |
33,3% |
19,0% |
38,1% |
33,3% |
14,3% |
||
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
р>0,05
Подводя промежуточный итог из всей совокупности имеющихся на этот момент данных, мы хотели бы подчер- ь два важных обстоятельства. Во-первых, ВПЧ, в част ности 18, 52, 55, 83 и 39 его серотипы, по всей вероятно сти, обладают высокой тропностью в отношении эпителия чиков. Во-вторых, принимая во внимание тот факт, что при сравнении спектра ПВИ в пробах муцинозного и се розного РЯ нами обнаружено достоверное различие в ча стоте детекции ВПЧ 18, 52 и 55 типов, по-видимому, ука зывает на важность дифференцированного подхода с по зиций значимости того или иного серотипа для различных
•лриантов эпителиального РЯ.
Между тем присутствие ПВИ в ткани не тождественно м участию в процессе опухолевого перерождения клет ки. Такое заключение необходимо осмыслить в первую Ьмередь с позиции хронологии течения инфекционного коцесса, тогда станет понятным, какие из множества со бытий и определяют потенциальную готовность клетки к Ь/юкачественной трансформации.
Накопленные сведения показывают, что во взаимоотно шении с клеткой хозяина ВПЧ может существовать в двух
ГЛАВА 6
состояниях — эписомальном и интегративном. Эписомальная форма является инфекционной единицей, заражаю щей клетки. Персистенция генома ВПЧ во внехромасомальной форме обеспечивает продукцию вирусных частиц с последующей вторичной инфекцией. В определенных случаях происходит интеграция вирусного генома в генети ческий аппарат клетки хозяина, которая на молекулярном уровне сопровождается следующими событиями. Так, встраивание вирусной ДНК в хромосому всегда заканчива ется полным разрушением генов Е 1 — Е 2. Последние от вечают за регуляцию транскрипции вирусных генов Е 6 и Е 7, что в свою очередь приводит к их неконтролируемой экспрессии и активному синтезу онкопротеинов Е 6 и Е 7. Не останавливаясь подробно на описании функциональ ных особенностей и механизмов реализации канцероген ного эффекта вирусных протеинов Е б и Е 7, которые были рассмотрены в главе, посвященной обзору литературных источников, и хорошо известны широкому кругу специали стов, подчеркнем лишь то положение, что процесс неопла стической трансформации характеризуется интеграцией вирусной ДНК, выражающейся в продукции большого ко личества онкобелков Е б и Е 7 в исследуемой ткани.
В нашей работе анализ 85 овариальных проб (61 обра зец тканей ЗЭОЯ и 24 — нормальных тканей яичников) был проведен методом ИФА с использованием широкой панели моноклональных антител к различным детерми нантам белка Е 7 для ВПЧ-18 серотипа (табл. 19).
Прежде всего, обратим внимание на итоги результатов по ВПЧ-18 позитивным образцам. Из 20 проб, забранных у больных эпителиальным РЯ I — IV стадий, продукция белка отмечена в 14 (70%) образцах преимущественно с ранними стадиями опухолевого процесса (р<0,0001).
Инфекционные агенты и канцерогенез
Таблица 19
Уровень онкопротеина Е 7 ВПЧ-18 в образцах эпителиального рака яичников
|
|
Уровень онкобелка Е 7 (нг/мл) |
||||||
Группа |
Общее |
|
|
|
|
|
|
|
отсутст |
|
|
5,1- |
бо |
|
|||
исследования |
число |
|
1,1- |
|
||||
Д о 1 |
лее |
всего |
||||||
|
|
вует |
5,0 |
10,0 |
||||
|
|
|
10,0 |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВПЧ-18 пози |
20 |
6 |
13 |
1 |
- |
- |
14 |
|
тивные пробы |
100% |
30,0% |
70,0% |
|||||
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВПЧ-18 нега |
41 |
38* |
- |
- |
- |
3 |
3* |
|
тивные пробы |
100% |
92,7% |
7,3% |
|||||
|
|
|
|
|||||
I |
|
|
|
|
|
|
|
|
Контрольная |
24 |
24* |
- |
- |
- |
- |
0* |
|
группа |
100% |
100% |
0 % |
|||||
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
р<0,0001;*р>0,05
Показатель уровня ВПЧ-18 Е 7 протеина у пациенток варьировал в пределах пороговых значений и составил 0,3 — 1,2 нг/мл. Отсутствие вирусного протеина зафик сировано только в 6 (30%) пробах больных распростра ненным РЯ. Можно предположить, что синтез онкопроте ина Е 7, начало которого в клиническом эквиваленте про ецируется на стадию предрака, вероятно, в течение ра звития опухолевого процесса имеет тенденцию к сниже нию. Принимая во внимание незначительное число Е 7-по- зитивных наблюдений, нами не предусматривалось изуче ние зависимости продукции вирусного протеина от стадии распространения опухолевого процесса. Тем не менее, дальнейшая разработка этого направления позволит определить практическую ценность онкопротеина Е 7 в