6 курс / Судебная медицина / Избранные_вопросы_судебно_медицинской_экспертизы_Выпуск

Приводим пример проведения ежедневного контроля качества судебнобиохимических исследований проводимого перед исследованием образцов сыворотки трупной крови на биохимическом анализаторе.

Ежедневный контроль качества судебно-биохимических исследований

Дни	Результат	(x-x)	(x-x)	____________________
1	7,3	0,555	0,308				V			S			×100 %
					1					X
2	6,7	0,045	0,002	1
3	7,4	0,655	0,429	1
4	6,5	0,245	0,06	1
5	6,2	0,545	0,297	1		0,5					6,7
6	7,2	0,455	0,207	1
7	7	0,255	0,065	1									Мультиконт Lot 161770-01
8	7,1	0,355	0,126	1		В = 3,1							хср = 6,7			до
																04,14 г
9	5,8	0,945	0,893	1									s = 0,5
10	6,6	0,145	0,021	1
11	6,7	0,045	0,002	1
12	6,6	0,145	0,021	1							В20 = 3,1 CV20 = 7,5%
13	6,5	0,245	0,06	1
						Полученные по результатам измерений определяемого
14	7,3	0,555	0,308	1
						компонента в контрольном материале расчетные вели-
15	6,1	0,645	0,416	1
						чины В20 и CV20 не превышают предельно допусти-
16	7	0,255	0,065	1		мые значения смещения и коэффициента общей анали-
17	6,3	0,445	0,198	1		тической вариации Таблицы 1 Приложения 3 Приказа
						МЗ РФ № 45 от 07.02.2000 г.
18	7,2	0,455	0,207	1
19	7	0,255	0,065	1
20	6,4	0,345	0,119	1
	6,745		3,87	20

Как видно из вышеприведенной сводной таблицы, перед началом выполнения биохимических исследований проводят анализ контрольных сывороток с аттестованным содержанием интересуемых по каждому биохимическому параметру компонентов: Abtrol – патологический уровень и Nortrol – нормальный уровень. Если полученный результат определения укладывается в допустимые пределы колебаний (Х±2S) для данного компонента согласно приведенным паспортным данным контрольной сыворотки, то такой результат считается правильным.

Контрольная карта строится и по каждому исследуемому биохимическому параметру в отдельности, по которой можно проследить все предупредительные и контрольные критерии оценки контрольных карт.

Как видно в колонке Z в таблице с результатами ежедневного контроля качества выполняемых биохимических исследований ни одно из контрольных измерений не выходит за пределы даже Х±2S, не говоря уже о пределах Х±3S. То есть контрольные правила не нарушены. О чем в колонке «нарушения» анализатор не выводит замечаний по несоблюдению контрольных правил. Соблюдения правил контроля качества хорошо видны на контрольной карте (рис. 1), построенной анализатором после исследования контрольных сывороток.

160

РЕЗУЛЬТАТЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

Рис. 1. Контрольная карта (объяснение в тексте)

Результаты судебно-биохимических исследований сыворотки трупной крови должны максимально соответствовать прижизненным показателям крови, иначе не будет возможности сопоставить прижизненные и посмертные показатели. Для этого необходимо соблюдать все правила преаналитики. Проводить забор материала в первые 24 часа после смерти в специальные пробирки, в зависимости от того, какой аналит исследуется. Сразу после забора материала его центрифугируют, соблюдая g-центрифугирования, время, температурный режим. Если после центрифугирования сыворотка была отделена от форменных элементов крови c помощью специального геля, то пробирку можно хра-

161

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

нить в холодильнике до отправки в лабораторию на исследование. В других случаях сыворотку необходимо сразу отобрать в отдельную пробирку, чтобы исключить контакт с эритроцитами. Для каждого исследуемого биохимического аналита существуют свои особые требования, которые необходимо по возможности соблюдать и при исследовании трупной крови. Иначе мы будем получать результаты биохимических исследований, очень далекие от прижизненных, которые не смогут оказать помощь эксперту-танатологу в установлении причины смерти, а наоборот, будут вводить его в заблуждение. Цель судебнобиохимических исследований – получить результаты анализов, соответствующие прижизненным показателям на момент смерти с минимальной погрешностью, а не проводить исследование аналитов, которые получились в пробирке in vitro.

Список литературы:

1.Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах. Т. 1: Основы клинического лабораторного анализа / под общ. ред. В.В. Меньшикова. – М.: Агат-

Мед, 2002.

2.Меньшиков, В. В. Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты. – М.: Лабора, 2005.

3.О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации: приказ Минздрава РФ от 07.02.2000 № 45.

4.Федеральный закон от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».

5.ГОСТ Р 8.563-2009 ГСИ. Методики (методы) измерений.– М.: Госстандарт, 2009.

6.Об утверждении порядка организации и производства судебномедицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации: приказ Минсоцразвития России № 346н от

12.05.2010 г.

7.Долгов, В. В. Национальное руководство. Клиническая лабораторная диагностика: нац. рук. Т. 1 / В. В. Долгов, В. В. Меньшиков. – М.: ГЭОТАРМедиа, 2012. – 928 с.

8.О введении в действие рекомендаций по межгосударственной стандартизации: постановление Гос. комитета РФ по стандартизации и метрологии

№47-ст от 30.01.2004 г.

9.Об утверждении отраслевого стандарта «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов»: приказ Минздрава РФ № 220 от 26 мая 2003 г.

162

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГОРИЗОНТАЛЬНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ

В СУДЕБНО-БИОЛОГИЧЕСКОМ ОТДЕЛЕНИИ

О.В. Планида, Н.О. Недолуга, М.В. Котельникова, Н.А. Нефѐдова

КГБУЗ «Бюро СМЭ» МЗ Хабаровского края (нач. – к.м.н. А.В. Нестеров), г. Хабаровск

При судебно-биологической экспертизе следов крови и выделений человека на первом этапе исследования возникают задачи, связанные с установлением природы анализируемых микрообъектов. Для этих целей используется физико-химический метод – хроматография: процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента, обеспечивающий экспрессность, высокую точность и чувствительность анализа. Метод хроматографии в тонком слое сорбента способствует обнаружению крови на предметах без видимых следов (особенно при наличии данных, свидетельствующих о возможном удалении следов), а также обнаружение следов пота, мочи, в том числе при исследовании контролей предметов-носителей.

Всудебно-биологическом отделении из существующих разновидностей метода – восходящая, нисходящая, радиальная, горизонтальная – широко применяется горизонтальная хроматография, имеющая бесспорное преимущество: устраняется стекание с пластинки растворителя, следовательно, стабилизируются процессы распределения и абсорбции разделяемых объектов, устраняется размывание детектируемых веществ.

Вотделении в качестве камер для разделения используются чашки Пет-

ри, что:

позволяет избегать стекания компонентов подвижной фазы и дает возможность использовать растворители с большей плотностью без замедления скорости их движения в сорбенте;

значительно повышает чувствительность метода;

предпочтительнее для микрообъектов (из одной и той же вытяжки из следа можно получить полную о нем информацию, можно определить примесь

ккрови некоторых выделений, достигается подлинное контролирование пред- метов-носителей).

Применение метода тонкослойной хроматографии в поисковых реакциях в судебно-биологическом отделении в 2009 – 2011 гг.

	Год	Количество	Наличие крови		Наличие пота		Наличие мочи
		экспертиз	+	–	+	–	+	–
	2009	1162	14 117	3169 (23%)	1009	215	12	2
	2010	1386	14398	3181 (18%)	1368	3169	17	30
	2011	1220	13138	3694 (28%)	1085	237	40	20

163

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

В среднем в 23 % поисковых реакций кровь не обнаружена. Общероссийский показатель отрицательной хроматографии крови – 39 %.

Подготовка камер. Применяя в качестве камер чашки Петри, диаметр нижней части которых составляет около 9,5 см, используются хроматографические пластинки малого размера – примерно 5,0 × 7,5 см, на которых длина пробега подвижной фазы составляет 6,0 см. Систему растворителей (универсальный растворитель из смеси бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 4:1:2) помещают в нижнюю часть чашки Петри, высота не должна превышать 2–3 мм. Хроматографическую пластинку осторожно сгибают с одной стороны, чтобы не повредить слой сорбента. С помощью препаровальной иглы производится продольная разлиновка пластинки по количеству объектов плюс контроль (свидетель). Это делается для устранения краевого эффекта, чтобы пятна от нанесенных вытяжек из объектов располагались на одной линии. Номера объектов обозначаются карандашом на линии финиша. В чашке Петри пластинка опирается свободным концом на пробирку. Изогнутый конец погружается в растворитель.

Подготовка объектов. Вытяжки из пятен и контролей предмета носителя готовят при помощи изотонического раствора натрия хлорида, заливая вырезки в пробирках с небольшим избытком. Экстракция производится при температуре +4° в условиях холодильника.

Нанесение вытяжек на пластинку. Существует несколько видов пла-

стин для хроматографии. Они различаются по материалу подложки (ПЭФТ – пленка, алюминиевая фольга), размеру частиц сорбента (от 5–17 мкм на аналитических, до 8–12 мкм на высокоэффективных). Наибольшее распространение, в том числе и в нашем отделении, получили пластины на основе алюминиевой фольги ввиду пластичности и легкости деления.

Учитывая размер высохшего пятна испытуемого объекта на стартовой линии – не более 2,0 мм, вытяжки наслаивают 10–12 раз каплями при помощи тонких капилляров с ровным концом, не прикасаясь к слою сорбента, чтобы не травмировать его. Между вытяжками должно быть расстояние не менее 8 мм. После каждого нанесения производится просушка пластинки при комнатной температуре. Свидетелями являются: при хроматографии крови – 0,01% раствор заведомой крови в изотоническом растворе натрия хлорида; пота – 0,01% раствор серина; мочи – 0,01% раствор мочевины и креатинина или свежая моча. Затем пластинку помещают в сухожаровой шкаф на 15 мин. при t +100° для устранения влияния пероксидазы растительного происхождения.

Учитывая тот факт, что адсорбенты на пластинах при хранении сорбируют влагу и другие вещества, находящиеся в воздухе, при использовании неподготовленных пластин образуется фронт «грязи», мешающий определению веществ. Предварительная подготовка представляет собой разгонку чистым растворителем с последующей сушкой в сушильном шкафу при t +110...+120° в течение 1 часа. Затем пластины хранят в сухом герметичном месте. Подготовленные данным способом пластины не теряют своих свойств до 4 месяцев.

164

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель (гидратированная кремниевая кислота, образованная при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушке образовавшегося золя), он применяется для разделения большинства веществ.

Разгонка. Пластинку помещают в камеру, свободный конец которой опирается о пробирку, изогнутый погружен в растворитель. Разделение проводится до линии фронта примерно в течение 10 минут.

Детектирование. После разгонки пластинка вынимается из камеры и просушивается при комнатной температуре до исчезновения запаха уксусной кислоты. Для определения наличия крови пластинку опрыскивают 10% раствором бензидина в этаноле с уксусной или соляной кислотой (10:1). После подсушивания в течение 3–5 минут пластинку опрыскивают 3% раствором перекиси водорода.

Учет результатов. Невооруженным глазом (визуально) оценивают хроматограмму. Образование недалеко от линии фронта зоны синего цвета различной интенсивности указывает на наличие гемоглобина.

Определение значения Rf разделенных веществ проводят как отношение расстояния, прошедшего веществом, к расстоянию, прошедшему фронтом растворителя Rf = L/Lо). Значение Rf (коэффициента распределения) варьирует в зависимости от ряда факторов: примененного сорбента, состава растворителя, концентрации вытяжки из испытуемого следа. Наличие гемоглобина доказывают путем сопоставления образовавшейся на хроматограмме зоны с зоной свидетеля. Наличие в образце выделений человеческого организма не мешает выделению крови этим методом.

Для пота: подготовка вытяжек из объектов осуществляется таким же образом. Выявлению пота не мешает присутствие в пятне крови, слѐз, слюны, мочи, спермы, гноя, выделений из носа и влагалища. Для свидетеля берется вытяжка заведомого пота на марлевом тампоне, заливается изотоническим раствором натрия хлорида на 18–20 часов. Нанесение на сорбент и разделение производится вышеуказанным способом. Пластинку просушивают до исчезновения запаха уксусной кислоты. В роли детектирующего реагента выступает 1% спиртовой раствор нингидрина, которым производят опрыскивание пластинки, после чего производится проявление путем нагревания в термостате при температуре около +60°. Ближе к линии старта при наличии пота образуются розово-фиолетовые пятна с Rf, соответствующим Rf свидетеля.

Для мочи: этапы подготовки, нанесения и разделения проводят вышеуказанным способом. После просушивания пластинку окуривают парами йода, через 5 минут при наличии мочи проявляется серо-коричневая зона, имеющая величину Rf, равную Rf креатинина. После обесцвечивания пластинки на открытом воздухе в течение 20 минут еѐ опрыскивают раствором парадиметламинобензальдегида, образуется зона желтого цвета, с Rf, равной по величине Rf мочевины. Присутствие в образце пота и других выделений определению мочи не мешают.

165

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Таким образом, метод тонкослойной хроматографии используется как для определения наличия биологических компонентов, в частности крови, так и при работе с предметами-носителями; если при исследовании на этих участках выделяются какие-либо антигены, определяется их происхождение. Уточняется вопрос о присутствии пота (реже – мочи) на кажущихся незапятнанными участках предмета-носителя, при положительном результате – осуществляется поиск чистых участков под контролем хроматографии. Таким образом, не установив природу влияния предмета-носителя на реагенты, можно в последующем неверно истолковать полученные результаты групповой принадлежности следов и, тем самым, ввести в заблуждение следственные органы.

ОПЫТ РАБОТЫ С АРХЕОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

Д.Ю. Пономарев, А.В. Никитаев

Керченское отделение Крымского республиканского учреждения «Бюро судебномедицинской экспертизы (нач. – Иванченко Е.Д.)

Палеоантропологам и археологам, исследующим фрагментированные скелетированные трупы неопознанных лиц и древние погребальные памятники, некоторые из которых представляют собой следы обряда трупосожжения, порой приходится иметь дело с мелкими фрагментами костей и костной золой. Классическая антропология не располагает методиками анализа микрофрагментов кости, поэтому обычно эти материалы палеоантропологами не исследуются. В судебной медицине разработано отдельное направление – судебномедицинская остеология, одной из задач которой является идентификация личности, в том числе по мельчайшим фрагментам кости и по костной золе. Опыт работы с археологическим объектами хотим привести на примере двух случаев.

На раннесредневековом участке могильника «Алмалык» (IV–V вв. н.э.), расположенном в подножии склона горы Мангуп, в юго-западном Крыму (автор раскопок – профессор, доктор исторических наук, заведующий кафедрой истории Древнего мира и Средних веков Таврического национального университета им. В.И. Вернадского Герцен А.Г.), было обнаружено зольное пятно, локализованное на участке между двумя грунтовыми склепами [1]. Для анализа взято 500 г золы, и в ней найдены микроосколки кости, размеры которых не превышали нескольких миллиметров. Наличие характерных микроморфологических признаков (многократная перестройка отдельных вторичных остеонов, повторяющаяся не менее 4 раз; полное замещение грубоволокнистой костной ткани пластинчатой; отсутствие первичных остеонов и пр.) позволило судить о принадлежности фрагментов кости скелету человека, умершего в возрасте 30–50 лет [3, 4].

Второе исследование привело к достаточно неожиданным результатам. При раскопках средневекового храма в г. Нова на территории современной

166

Болгарии (автор раскопок профессор А. Бернадский, Болгария) в полу наоса храма была обнаружена могила, где, по предположению исследователя, был погребен священник. На костях грудной клетки покойника располагался реликварий (нагрудное хранилище для мощей Святого), в котором находился фрагмент кости. Понятен интерес археологов к этой находке. Фальсификация мощей – очень древний вид «бизнеса» в религии. Необходимо было выяснить, кому принадлежала эта кость: скелету человека или животного. Костный фрагмент размерами 1,5×2,5 см, имеющий форму дугообразно изогнутой в продольном направлении пластинки серовато-коричневого оттенка. На поверхности излома препарат имеет цвет слоновой кости. Наружная поверхность кости гладкая, с небольшими мелкобугристыми участками, а внутренняя поверхность имеет ячеистый вид за счет расположенных балок и ячеек губчатого костного вещества.

Эпимикроскопическое строение объекта. На поперечном шлифе кости четко различимы три слоя: периостальный, срединный и эндостальный, которые в целом образуют корковый слой кости. К эндостальной поверхности прилегают балки и ячейки губчатого костного вещества. У периостального края костная ткань имеет грубоволокнистое строение. Здесь же расположены первичные сетевидные остеоны, которые в отдельных участках занимают весь периостальный слой. Они образуют своеобразную сеть с ячейками из сосудистых ходов, представленных каналами продольного и поперечного направления. Поперечные каналы первичной остеонной сети направлены параллельно поверхности кости, и ширина их составляет порядка 10–15 мк. Среди первичных сетевидных остеонов обнаружены вторичные цилиндрические остеоны, поперечные размеры которых составляют 50–60 мк. Они не имеют признаков перестройки и не образуют материнско-дочерних структур. Гаверсовы каналы расположены строго по центру. В периостальном слое расположены фолькмановские каналы, развившиеся в результате частичной перестройки первичных сетевидных остеонов. Средний участок коркового слоя кости на большей площади образован первичными цилиндрическими остеонами овальной и неправиль- но-овальной формы, размерами в поперечном сечении 40–60 мк. Они расположены рядами, ориентированными параллельно поверхности кости и друг другу. Кроме того, в срединном слое выявлены единичные вторичные цилиндрические остеоны овальной формы, размерами в поперечном сечении 60–80 мк, и один двухканальный вторичный остеон. Материнско-дочерние комплексы вторичных остеонов в этом слое отсутствуют. Первичные цилиндрические и вторичные остеоны отделены друг от друга прослойками грубоволокнистой и параллельноволокнистой костной ткани, причѐм количество последней возрастает по направлению к костно-мозговому каналу. Остеонов со смещенным каналом на шлифе не обнаружено. Первичные цилиндрические остеоны расположены в 8–9 слоев, на различном расстоянии друг от друга в каждом ряду. Эндостальный слой кости имеет аналогичное строение, однако в нем содержится меньшее количество остеонов (единичные в поле зрения) и параллельноволокнистая костная ткань, преобладающая над грубоволокнистой. На внутренней

167

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

поверхности эндостального слоя кости наслоений «мозговой кости», характерной для яйцекладущих птиц, не обнаружено. На 1 мм2 площади поверхности поперечного шлифа кости расположено 18–24 остеонных конструкций и 19–22 Гаверсовых каналов [2].

Далее шлифовке и окраске по вышеописанной технологии подвергался продольный скол фрагмента кости. Объект имеет своебразное эпимикроскопическое строение: межостеонные границы, Гаверсовы каналы и сосуды расположены строго параллельно друг другу. В некоторых участках параллелизм нарушается, но в основном преобладает. В костном препарате не обнаружено характерного для костной ткани свиньи клубкообразного переплетения остеонов. Исследование микростроения кости показало, что она относится к скелету животного, поскольку такие морфологические признаки, как наличие первичных сетевидных остеонов, параллельное на большем протяжении с поверхностью кости расположение первичных остеонов, отсутствие материнско-дочерних комплексов вторичных остеонов, неполная перестройка грубоволокнистой костной ткани и прочее являются характерными видовыми признаками строения костной ткани скелета животных (рис. 1).

Рис. 1. Эпимикроскопическое строение фрагмента кости из реликвария, обнаруженного в средневековом захоронении наоса церкви в г. Нова (Болгария).

I – Кортикальный (корковый) слой кости. II – Слой губчатого вещества.

1– первичные сетевидные цилиндрические остеоны;

2– вторичные цилиндрические остеоны;

3– фолькмановские цилиндрические каналы;

4– первичные цилиндрические остеоны;

5– грубоволокнистая костная ткань;

6– параллельноволокнистая костная ткань;

7– многоканальный вторичный цилиндрический остеон

168

Выявленная морфологическая картина позволила сделать вывод, что представленная кость не может принадлежать скелету яйцекладущей птицы, а также свинье, поскольку отсутствуют характерные для них анатомические образования, а именно «мозговая кость» и клубкообразное переплетение остеонов.

Таким образом, представленный на исследование объект не является костью или частью кости человека, а принадлежит скелету животного.

В заключение хочется сказать, что во многих странах существует отдельное направление в медицине – судебная археология, в которой синтезированы все научные методики и методы исследования, как из археологии, так и из судебной медицины, а в наших условиях возможен представленный нами формат сотрудничества в рамках оказания специализированной помощи палеоантропологам и археологам.

Список литературы:

1.Герцен, А. Г. Некрополи раннесредневекового Дороса – Мангупа / А. Г. Герцен, Д. Ю. Пономарев // Гіпнос, Танатос та Асклепій у культурі народів світу: гуманітарний та медичний аспекти. – Сімферополь, 2003. – С. 48-49.

2.Гладышев, Ю. М. Микроскопические признаки видовых различий костей человека и животных (сообщение 1) // Судебно-мед. экспертиза. – 1969. –

№1. – С. 22–24.

3.Гладышев, Ю. М. Микроскопические признаки видовых различий человека и животных (сообщение 2) // Судебно-мед. экспертиза. – 1969. – № 3. – С. 3–6.

4.Голубович, Л. Л. Современное состояние и перспективы развития су- дебно-медицинской идентификации личности по костям, подвергшимся воздействию высокой температуры / Л. Л. Голубович, И. С. Таланов // Судебно-мед. экспертиза. – 1990. – № 4. – С. 45–47.

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ИЗГОТОВЛЕНИЯ ШЛИФОВ КОСТЕЙ ДЛЯ ЭПИМИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ С ЦЕЛЬЮ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ЧЕЛОВЕКА

Д.Ю. Пономарев, А.В. Никитаев

Керченское отделение Крымского республиканского учреждения «Бюро судебномедицинской экспертизы» (нач. Иванченко Е.Д.)

Актуальность. В статье показан разработанный нами способ подготовки шлифа микрофрагмента кости с целью определения ее видовой принадлежности, а также установления биологического возраста человека.

Судмедэкспертам, палеоантропологам и археологам, исследующим фрагментированные скелетированные трупы неопознанных лиц и древние погребальные памятники, часто приходится сталкиваться не с полным скелетом, а с мелкими фрагментами костей или костной золой после обряда трупосожжения.

169

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/