3 курс / Фармакология / Диссертация_Гайдукова_К_А_Антитромбогенная_активность_новых_производных

161

исследований было показано, что соединение РУ-1144, в отличие от ацетилсалициловой кислоты, при однократном внутрижелудочном введении незначительно повышает уровень

6-кетопростагландина, что указывает на отсутствие у тестируемой субстанции возможного нежелательного воздействия на желудочно-кишечный тракт и антитромбогенные свойства эндотелия.

Последним этапом изучения механизма действия соединения-лидера было исследование влияния РУ-1144 на уровень ионов внутриклеточного кальция. Известно,

что ионы кальция не только являются важными внеклеточными факторами для активации гликопротеинов, но и важным внутриклеточным регулятором необходимым для процессов активации и агрегации тромбоцитов [Lin C.S., 2017]. При повышении тромбогенного потенциала крови происходит существенное увеличение концентрации внутриклеточного кальция за счет его секреции из плотных гранул тромбоцитов, а также входа ионов кальция внутрь клетки. Существует несколько путей входа ионов кальция в цитоплазму: при их высвобождении из внеклеточного пространства и из внутриклеточных депо, представленных рецептор-опосредованными ионными каналами и обратными Na+/Ca2+-обменниками [Abiko L.A., 2016].

Поступление внеклеточного кальция в цитоплазму активирует фосфолипазу А2.

Фосфолипаза А2 (PLA2) относится к надсемейству ферментов, которые катализируют гидролиз мембранных фосфолипидов, с образованием свободных жирных кислот и лизофосфолипидов, что в дальнейшем приводит к образованию продуктов арахидонового каскада [Leslie, C. C., 2015].

Исходя из вышесказанного, исследование общего уровня кальция в тромбоцитах было проведено в два этапа: в условиях кальциевой среды, а также при отсутствии кальция. В качестве препарата сравнения был выбран антагонист ионов кальция-

верапамил.

На первом этапе исследования соединение под шифром РУ-1144 дозозависимо ингибировало увеличение содержания внутриклеточного кальция в тромбоцитах при добавлении индуктора тромбина, относительно данных полученных в контрольной группе животных, превосходя препарат сравнения. На втором этапе исследование

162

выполнялось в отсутствии внеклеточного Са2+. На всех этапах исследования соединение РУ-1144 изучалось в диапазоне концентраций для поиска показателя IC50. Таким образом, данный показатель в присутствии кальция составил 27,8 мкМ, а в безкальциевой среде - 55,4 мкМ. Так, в результате данного исследования были получены данные свидетельствующие о том, что соединение РУ-1144 доза-зависимо снижает уровень общего кальция в тромбоцитах, стимулированных тромбином, как в кальциевой,

так и в бескальциевой среде.

В результате изучения механизма антиагрегантного действия соединение РУ-1144

по влиянию на агрегацию тромбоцитов, вызванную различными агонистами,

продемонстрировало высокую способность в экспериментах in vitro оказывать защитное антиагрегационное действие на широкий спектр индукторов агрегации тромбоцитов.

Наиболее выраженно тестируемое соединение блокировало агрегацию тромбоцитов,

индуцированную такими агонистами, как АДФ, арахидоновая кислота, коллаген и ФАТ

(табл.7.2).

Таблица 7.2. Влияние соединения РУ-1144 и ацетилсалициловой кислоты на различные индукторы агрегации тромбоцитов in vitro (M±m, n=6)

	№	Индукторы агрегации тромбоцитов	Концентрация	IC50, мкМ
	п/п		индуктора
				РУ-1144	АСК
	1.	PAF	0,08 мкМ	1,1	-
		(фактор активации тромбоцитов)
	2.	Арахидоновая кислота	50мкМ	1,9	53
	3.	АДФ	20 мкМ	5,5	120
	4.	Коллаген	4 мкг/мл	9,2	26
	6.	TFLLR-NH2 Trifluoroacetate salt	1мкМ	17,8	-
		(Агонист PAR1-рецепторов)
		U 46619
	7.	(агонист тромбоксановых	3 мкМ	19,3	-
		рецепторов)
	8.	Адреналин	5 мкМ	51	42
	9.	Тромбин	0,5 ед/мл	330	-
	10.	Ристоцетин	0,5 мг/мл	0	-

Примечания:

n-число проб в группе

*-изменения достоверны по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни (p<0,05) АСКацетилсалициловая кислота

163

Также соединение РУ-1144 при однократном внутрижелудочном введении блокирует

P2Y12 рецепторы тромбоцитов, снижает уровень продукта арахидонового каскада -

тромбоксана А2 в тромбоцитах. Кроме того, тестируемое соединение снижает уровень общего

ивнутриклеточного кальция в тромбоцитах.

Витоге данного исследования была найдена группа соединенийпроизводных пиримидобензимидазола, важным сходством которых стало наличие в положении R1 1-(3,5-

дитретбутил-4-гидроксифенил)-пропан-1-она, все представители данной группы проявляли как выраженную антиагрегантую, так и антиоксидантную активности.

Таким образом, можно сделать вывод, что соединение РУ-1144 проявляет выраженное поливалентное антиагрегантное действие, сочетающееся с антиоксидантной активностью, что делает его привлекательным для дальнейшего углубленного изучения в качестве средства с мультитаргетным механизмом действия для лечения и профилактики тромбообразования.

164

	Выводы
1.	Скаффолды	на	основе	N-7-дитретбутил-4-гидроксифенил
пиримидобензимидазолов		и	N-9-дитретбутил-4-гидроксифенил бензимидазолов

проявили выраженные антиагрегантную и антиоксидантную активности, превосходя скаффолды: N-9-дитретбутил-4-гидроксифенил триазинобензимидазолы, С-11-2,6-

дитретбутил-1-гидроксифенил-2,3-тиадиазинобензимидазолы, N9-2,3-

дигидроимидазобензимидазолы, N-7-дитретбутил-4-гидроксифенил-N9-2,3-

дигидроимидазобензимидазолы и N-7-дитретбутил-4-гидроксифенил-

триазолобензимидазолы. При смещении дитретбутильного радикала из положения N-7; N-9 и С-11 в представленных группах происходило снижение антиагрегантной и антиоксидантной активности.

2.Соединение под шифром РУ-1144 (1-(3,5-дитретбутил-4-гидроксифенил)-1-

гидроксипропил)-фенил-пиримидобензимидазола гидрохлорид), в опытах in vitro

оказывало выраженную антиагрегантную активность, превосходя препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту в 21,8 раз; при исследовании антиоксидантной активности,

соединение-лидер уступало препарату сравнения дибунолу в 1,7 раз. По ингибированию внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vivo данное соединение превосходя ацетилсалициловую кислоту в 1,5 раза и незначительно уступая клопидогрелу на 30 %.

3.Соединение РУ-1144 оказывает выраженное антитромботическое действие на моделях артериальных тромбозов, индуцированных аппликацией хлорида железа(III) и

электрического тока на сонную артерию крыс, превосходя в 3,5 и 2,5 раза соответственно по активности ацетилсалициловую кислоту и в 3,5 и 7,4 раза соответственно - препарат сравнения клопидогрел; а также предотвращает гибель 80% животных на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза на мышах, на модели венозного тромбоза, индуцированного полной перевязкой нижней полой вены уменьшает массу образовавшихся тромбов в 3,4 и 1,9 раза по сравнению с ацетилсалициловой кислотой и клопидогрелом.

4.В условиях экспериментального некоронарогенного инфаркта миокарда,

вызванного изопротеренолом на модели артериального тромбоза, индуцированного

165

аппликацией раствора хлорида железа (III) на сонную артерию крыс, соединение РУ-

1144 проявляет более выраженное антитромботическое действие, в сравнении с группой животных с экспериментальной патологией, замедляя образование тромба на 47,7 %.

5.Соединение РУ-1144 (по показателю IC50) блокирует агрегацию тромбоцитов,

вызванную различными агонистами: фактором активации тромбоцитов (ФАТ) - 1,1 мкМ,

арахидоновой кислотой -1,9 мкМ, АДФ-5,5 мкМ, коллагеном - 9,2 мкМ, PAR1 - 17,8

мкМ, агонистом тромбоксановых рецепторов U46619 - 19,3 мкМ, адреналином - 51 мкМ и тромбином - 330 мкМ.

6.Соединение РУ-1144 на модели тромбоза по методу Горога (Global Thrombosis Test) в 1,4 раза увеличивает время образования тромба по сравнению с группой контрольных животных и не оказывает влияние на лизис образовавшегося сгустка.

7.Величина ED50 в отношении блокирования P2Y12 рецепторов тромбоцитов соединения РУ-1144 и клопидогрела составили 16,9 и 6,1 мг/кг соответственно; при исследовании влияния соединения-лидера на уровень ТхВ2 в тромбоцитах,

стимулированных арахидоновой кислотой установлено, что соединение превосходило ацетилсалициловую кислоту в 1,8 раз; исследуемое вещество повышало уровень 6-кето-

простагландина F1 в отличии от ацетилсалициловой кислоты, которая напротив снижала данный показатель; а также уменьшало уровень внутриклеточного кальция в тромбоцитах, актвированных тромбином.

8.Соединение РУ-1144 оказывает менее выраженное влияние на время кровотечения из хвостовой вены мышей, чем препараты сравнения ацетилсалициловая кислота и клопидогрел в 1,3 раза.

9.По величине показателя LD50 (749,2 мг/кг) соединение РУ-1144 при внутрибрюшинном введении можно отнести к 4 классу малотоксичных веществ, которое не оказывает нейротоксического действия в дозах 18,8 мг/кг (ED50), а также при ее увеличении в 2,7; 5,3 и 10,6 раз.

166

Практические рекомендации

1. Синтез и поиск антиагрегантных и антитромботических соединений среди гибридных структур бензимидазола, имеющих дитретбутильный радикал в молекулярном остове,

является перспективным направлением.

2.Соединение РУ-1144 (1-(3,5-дитретбутил-4-гидроксифенил)-1-гидроксипропил)-

фенил-пиримидобензимидазола гидрохлорид) является перспективным соединением для

детального доклинического изучения.

167

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АДФ – аденозиндифосфорная кислота АСК - ацетилсалициловая кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АФК - активные формы кислорода ДМСО - диметилсульфоксида

ЛПНП – липопротеины низкой плотности ПГ - простагландины

ПГI2 – простациклин ПКА-протеинкиназа А ПОЛ - перекисное окисление липидов

ССС – сердечно-сосудистая система ТР-рецепторов - рецепторы тромбоксана ТхА2 - тромбоксан А2

ТхВ2 - тромбоксан В2

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат ЦОГ – циклооксигеназа УТИ - условного терапевтического индекса

ФАТ (PAF) - фактор активации тромбоцитов ФДЭ - фосфодиэстераза ЭГТА - этиленгликольтетраацетат натрия

АV-блокада - атриовернтрикулярная блокада BSA - бычий сывороточный альбумин

ED50 - эффективная доза, в которой вещество ингибирует процессы агрегации тромбоцитов (пролонгирует время окклюзии сонной артерии) на 50%

GP – гликопротеины

IC50 - ингибирующая концентрация, в которой вещество ингибирует процессы агрегации тромбоцитов на 50%

168

LD50 - средняя доза вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа

P2Y – пуриновые рецеторы тромбоцитов

PAR - протеазо-активированные рецепторы

PLА2 - фосфолипаза А2

PI3K - фосфатидилинозитол-3-киназы

Syk (Spleen tyrosine kinase) - тирозинкиназa

TRAP - активатор рецепторов тромбина

U 46619 - агонист тромбоксановых рецепторов vWF - фактора фон Виллебранда

169

Список литературы

1.Алексеева А.А. Фармакологическая активность производимых бензимидазола, содержащих пространственно-затрудненные фенольные заместители, и их аналогов, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства. Авт.реф. дисс. кнд. фрмц. наук. – Волгоград: ВолгГМУ, 2007. – 48 с.

2.Белозерцева И.В., Драволина О.А., Тур М.А., Куварзин С.Р., Звартау Э.Э. Вызванная морфином реакция Штрауба, как модель спастичности у мышей: эффекты серотонинергических соединений//Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.-2015.-115(2).-С.73-79.

3.Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения// Хим.-фарм. журн. - 2003. - Т. 37. - № 3. - С. 32–34.

4.Бокерия Л.А., Никитина Т.Г. и др. Этапное лечение пациента с ишемической болезнью сердца и онкопатологией//Клиническая физиология кровообращения.-2014.-4.-С.30-32

5.Бугаева Л.И., Кузубова Е.А., Букатин М.В., Спасов А.А. Нейротоксикологические свойства препарата «Бендазол»// Вестник ВолгГМУ. - 2012. -№ 2. - С. 83-86.

6.Воронина, Т.А. Методические указания по изучению противосудорожной активности новых фармакологических веществ / Т.А. Воронина, Т.Л. Неробкова //Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ – 2-изд., перераб

идоп. Под общ. ред. Р.У. Хабриева.– М.: Медицина – 2005. – С.277-295.

7.Воронина Т.А. Мексидол: спектр фармакологических эффектов//

Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова.- 2012.- Т. 112.- № 12.- С.

86-90.

8. Габбасов З.А Попов Е.Г., Гаврилова И.Ю., Позин Е.Я., Маркосян Р.А. Новый высокочувствительный метод анализа агрегации тромбоцитов //Лабораторное дело. - 1989. - №10. - С.15-18.

170

9.Говорова Н.В. Лекционное пособие по изучению сосудисто-

тромбоцитарного гемостаза.-2014.-С. 48-50.

10.Гороховская Г.Н., Юн В.Л. Антитромбоцитарная терапия: современное представление и комплексный подход к проблеме атеротромбоза//Российский медицинский журнал.-2013.-34.- С. 1737-1741.

11.Жуковская О.Н., Спасов А.А., Кузьменко Т.А., Морковник А.С. и др. Синтез и фармакологическая активность трифторметилсодержащих имидазо[1,2- a]бензимидазолов// Химико-фармацевтический журнал.- 2018.- Т. 52.- № 5.- С. 3- 9.

12.Жуковская О.Н., Спасов А.А., Гурова Н.А., Косолапов В.А., Кучерявенко А.Ф. и др. Фармакологическая активность производных 1,3-дигидро- 2h-бензимидазол-2-тиона// Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2019.- Т. 82.- № 7.- С.- 3-9.

13.Кадников И.А., Воронин М.В., Середенин С.Б. Цитопротекторное действие афобазола и его основного метаболита М-11 [Электронный ресурс] / //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины .- 2015 .- №1 .- С. 53-56

14.Калашников В.Ю., Викулова О.К., Железнякова А.В., Исаков М.А., Бондаренко И.З., Шестакова М.В., Дедов И.И. Эпидемиология сердечно-

сосудистых заболеваний у больных сахарным диабетом, по данным федерального

регистра российской федерации (2013-2016 гг.)// Сахарный Диабет.- 2019.- Т. 22.-

№2.- С. 105-114.

15.Калинина О.С., Зиганшин А.У. Агонисты и антагонисты P2Y-

рецепторов в современной клинической практике// Вестник современной

клинической медицины.- 2017.- Т. 10.- № 1.- С.- 22-28.

16.Косолапов В.А., Ельцова Л.В., Спасов А.А., Анисимова В.А. Антиоксидантные свойства производного пирролобензимидазола - соединения РУ-792 - в эксперименте//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2013.-155(4).-С. 453-456.

17.Косолапов В.А., Сороцкий Д.В., Васильев П.М., Жуковская О.Н. Направленный поиск новых антиоксидантных соединений методами in silico и in