- •Цитохимические исследования лейкоцитов
- •35 Мл буферного раствора.
- •Метод азосочетания (модификация м. Г. Шу-
- •130 Активность фермента высокая при остром миелобластном лейкозе, слабая — при остром монобластном и отсутствует — при остром лимфобластном лейкозе.
- •Кислая а-нафтилацетат-эстераза.
- •40 Мл буферного раствора (реактив № 2); встря-
- •Нафтол-as d-хлорацетат-эстера-
- •Пероксидаза (миелопероксида-
- •Фетальный гемоглобин. Метод Ветке.
- •37 °С в течение 30 мин цитратно-фосфатный
- •Эритроцитов (соэ).
- •Унифицированный микрометод Панченкова
- •1/4 (До метки 0,75).
Цитохимические исследования лейкоцитов
Цитохимические исследования проводят в
мазках крови, лейкоконцентрата; они основаны
на использовании специфических химических
реакций для определения в клетках различных
веществ. Эти исследования позволяют изучать
локализацию и ориентировочно оценивать коли-
чество определяемых веществ в различных кле-
точных элементах. Цитохимические исследова-
ния относительно несложны, дают возможность
исследовать различные виды лейкоцитов, но ус-
тупают в точности количественному анализу,
проводимому с помощью биохимических мето-
дов.
При цитохимическом исследовании чаще
пользуются полуколичественной оценкой резуль-
татов, используя принцип Астальди, основан-
ный на выявлении различной степени интенсив-
ности специфической окраски. В зависимости
от нее исследуемые элементы делят на 4 группы:
с отрицательной реакцией (—), слабоположи-
тельной ( + ), положительной (+ +) и резко
положительной ( + + + ). Для количественного
выражения результатов подсчитывают 100 кле-
ток определенного вида, дифференцируя их по
указанному принципу, затем число клеток с оди-
наковой интенсивностью окраски умножают на
соответствующее данной группе число плюсов,
сумма этих произведений составляет условные
единицы. Например, при исследовании активно-
сти щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100
просмотренных клеток в 60 клетках активность
фермента не выявлена (—), в 35—специфи-
ческая окраска была слабой ( + ) и в 5— более
интенсивной ( + + ). Результат определения ак-
тивности щелочной фосфатазы в нейтрофилах
в таком случае составит (60 ХО)+(35 X 1) +
+(5 X 2) = 0 + 35+ 10 = 45 ед. Можно выразить
результат в виде среднего цитохимического по-
казателя по L. Kaplow (1955) или среднего
цитохимического коэффициента (СЦК). С этой
целью также дифференцируют 100 исследуемых
клеток по указанной выше системе. Полученный
процент клеток в каждой группе умножают на
соответствующее данной группе число плюсов.
Сумма этих величин, деленная на 100, пред-
ставляет собой СЦК для одной клетки. В ука-
занном примере СЦК щелочной фосфатазы ней-
трофилов равен 0,45. В тех случаях, когда изуча-
емые вещества локализуются в клетках в виде
единичных гранул (например, активность не-
специфической эстеразы в лимфоцитах и др.),
результат цитохимической реакции целесооб-
разно выражать в процентах клеток, дающих
положительную реакцию.
Метод полуколичественйой оценки является
ориентировочным, но позволяет сравнивать рас-
пределение исследуемых веществ в разных кле-
точных элементах или в одних и тех же клетках
при различных патологических состояниях ор-
ганизма, а также в зависимости от течения забо-
левания, степени его тяжести и в связи с прово-
димой терапией.
Наиболее распространены цитоэнзиматичес-
кие исследования, дающие возможность выя-
вить в клетках активность различных ферментов.
Для этого чаще используют методы азосочета-
ния, в которых специфический субстрат, взаимо-
действуя с ферментом, образует продукт реак-
ции, который окрашивается солями диазония;
по окраске судят о локализации фермента и его
активности.
В настоящей главе приведены наиболее рас-
пространенные в клинической практике цитохи-
мические методы исследования.
ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (К. Ф. 3.1.3.1.)
содержится преимущественно в зрелых нейтро-
фильных лейкоцитах; активность фермента свя-
зывают со вторичными (специфическими) гра-
нулами цитоплазмы. Относится к группе гидро-
литических ферментов с оптимумом действия
при рН 9,6, осуществляет гидролиз однозаме-
щенных эфиров ортофосфата. Наиболее распро-
странено определение активности фермента ме-
тодами азосочетания.
Метод азосочетания по Кеплоу. П р и н ц и п .
Расщепление щелочной фосфатазой а-нафтил-
фосфата с освобождением а-нафтола, образу-
ющего с солями диазония нерастворимый окра-
шенный в коричневый цвет осадок в местах
локализации фермента.
Р е а к т и в ы . 1. 10% раствор формалина
в абсолютном метаноле. 2. 0,05 М раствор про-
пандиолового буфера (рН 9,75); готовят основ-
ной 0,2 М раствор (10,5 г 2-амино-2-метил-1,3-
пропандиола растворяют в 500 мл дистиллиро-
ванной воды), хранят его в холодильнике. Из
основного раствора готовят 0,05 М раствор
(25 мл основного раствора буфера смешивают
с 5 мл 0,1 н. раствора НС1 и доводят дистиллированной водой до 100 мл), хранят в холодильнике. 3. а-Нафтилфосфат. Можно использовать
нафтол-АS-Фосфат, нафтол-АS-ТR-фосфат или
нафтол-АS-В1-фосфат. 4. Прочный синий RR;
можно использовать отечественные красители
диазоль синий 2С и диазоль синий 0. 5. 2 %
раствор метилового зеленого. 6. Инкубационная
среда (готовят перед употреблением): 35 мг
а-нафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR,