- •Для выполнения лабораторных работ
- •Задание 3. Определение триптофана в зерне сельскохозяйственных растений
- •Задание4. Определение аминокислот методом тонкослойной хроматографии (тсх)
- •Задание 7. Определение изоэлектрической точки белков
- •Задание 8. Специфичность действия ферментов
- •Задание 9. Определение оптимальных значений pH для различных ферментов
- •Задание 11. Обнаружение каталазы и пероксидазы в растительных объектах
- •Обнаружение пероксидазы
- •Задание 12. Определение активности тирозиназы
- •Углеводы
- •Задание 16. Свойства моносахаридов и дисахаридов. Ферментативный гидролиз сахарозы
- •Задание 18. Определение сахарозы в сахарной свекле на поляриметре
- •Задание 20. Определение констант жиров
- •Витамины
- •Задание 23. Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях
- •Органические кислоты Задание 24. Определение общей кислотности
- •Задание 25. Определение свободных органических кислот
- •Небелковые азотистые соединения Задание 26. Определение нитратного азота потенциометрическим методом
Задание 11. Обнаружение каталазы и пероксидазы в растительных объектах
Оборудование и реактивы: клубни картофеля, фарфоровая ступка с пестиком, 3% раствор H2O2, 1% раствор гидрохинона, воронки, пробирки, лезвия, пипетки, фильтровальная бумага.
Обнаружение каталазы
В растительных тканях в процессе окисления ряда веществ под действием оксидаз образуется перекись водорода:
AH2 + O2 A + H2O2
В значительных количествах перекись оказывает токсическое действие на цитоплазму клеток. Обезвреживание перекиси выполняет Fe-содержащий фермент – каталаза:
2H2O2 2H2O + O2
Ход работы:
Кусочек очищенного клубня картофеля – 10-15г измельчить и растереть в фарфоровой ступке с 2-3 мл дистиллированной воды. Добавить еще 8-10 мл воды, перемешать смесь, отфильтровать в сухую пробирку. К 3 мл вытяжки добавить 2 мл 3% H2O2 , понаблюдать за появлением пузырьков кислорода. На основании визуальных наблюдений сформулировать выводы.
Обнаружение пероксидазы
Окислительно-восстановительный Fe-содержащий фермент – пероксидаза осуществляет окисление гидрохинона в хинон, этот процесс сопровождается изменением окраски раствора:
Ход работы
Вытяжку картофеля разливают поровну по трем пробиркам:
1) 2 мл вытяжки + 0,5 мл 3% H2O2;
2) 2 мл вытяжки;
3) 2 мл вытяжки прокипятить в течение 1 мин. + 0,5 мл 3% H2O2.
В каждую поровну добавляют по 5 капель раствора гидрохинона и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Сравнить окраску содержимого трех пробирок и записать выводы.
Задание 12. Определение активности тирозиназы
Оборудование и реактивы: 1) измельчитель; 2) пробирки; 3) пипетки; 4) термостат (водяная баня); 5) тирозин, 1% раствор.
Тирозиназа относится к классу оксидоредуктаз, к группе фенолоксидаз. Этот фермент, в отличие от других ферментов этой группы, обладает групповой (относительной) специфичностью и катализирует окисление не только монофенолов, но и полифенолов. Тирозиназа широко распространена в растительных организмах. По своей природе она является медьсодержащим протеидом.
За каталитическим действием можно наблюдать по реакции окисления тирозина кислородом воздуха в присутствии препарата тирозиназы. В процессе окисления из тирозина образуется красный пигмент гелохром, а затем пигмент-меланин.
Ход работы:
Клубень картофеля растирают и навеску 1-2 г растительной массы заливают 5 мл воды и тщательно перемешивают. Полученную взвесь фильтруют и фильтрат используют как препарат фермента.
В две пробирки наливают по 1 мл препарата фермента. Содержимое одной из них (для “холостого” определения) нагревают до кипения и кипятят 1-2 минуты, а затем охлаждают. В обе пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора тирозина и при периодическом (через 3 минуты) перемешивании встряхиванием реакционную смесь инкубируют при температуре 40С.
За окислением жидкости наблюдают в пробирках. Жидкость в пробирке с активной вытяжкой из картофеля постепенно становится сначала розовой, а затем бурой и, наконец, черной. В “холостой” пробе с инактивированным ферментом цвет жидкости в пробирке не изменяется. Результаты наблюдения фиксируют в тетради и делают вывод о каталитическом действии тирозиназы.
Задание 13. Определение активности каталазы
Оборудование и реактивы. Весы технические, термостат, мерные колбы на 50 мл, бюретки, колбы конические на 100 мл, пипетки на 5 и 20 мл, воронки, бумажные фильтры, фарфоровые ступки, кварцевый песок, 1-% -ный раствор Н2О2 , 0,1 N раствор КМnО4, 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8, 2N раствор серной кислоты.
Материалы: листья, лук, проростки.
Каталаза осуществляет превращение пероксида водорода в Н2 О и О2 по уравнению:
2H2O2 2H2O + O2
Метод основан на учёте оставшейеся после действия каталазы перекиси водорода титрованием раствором KMnO 4
Ход работы:
Растирают в ступке 5 г растительного материала с кварцевым песком и 5 мл фосфатного буфера. Содержимое ступки количественно переносят в мерную колбу, доводя объём до 50 мл. Смесь перемешивают и ставят в термостат при 370 С на 15 мин, по истечении которых смесь фильтруют. В две конические колбы вносят по 20 мл фильтрата. В одну колбу - контроль вливают 5 мл 2 N раствора H2SO4 для инактивации фермента, затем в обе колбы приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора перекиси, перемешивают и оставляют в термостате при 37 0С на 15 мин. По истечении указанного времени в опытную колбу добавляют 5 мл 2N раствора серной кислоты, перемешивают и титруют содержимое обеих колб 0,1N раствором KМnO4 до слаборозовой окраски, не исчезающей в течении 30 сек. Активность каталазы (V, ед/г) рассчитывают по формуле;
А и В-количество KМnO4 , пошедшее на титрование опытной и контрольной проб, мл.
К – поправка к титру 0,1н раствора KМnO4
C -объём смеси, мл.
С1- объём, взятый для титрования, мл.
n- навеска растительного материала,г.
t- время,час.
Подсчитывают результаты и делают вывод об активности каталазы.