1. Подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к выделению днк или рнк;

2. Собственно полимеразной цепной реакции;

3. Детекции продукта пцр (амплифицированной нуклеиновой кислоты).

Выделение ДНК/РНК

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.

Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.

Постановка ПЦР

Для проведения ПЦР в реакционный буфер вводят определенное количество коротких (15-30 пар оснований) олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных последовательностям, фланкирующим участок ДНК, копию которого хотят получить. Праймеры подбирают таким образом, чтобы их 3' -концы были ориентированы навстречу друг другу, т.е. синтезировался фрагмент ДНК, заключенный между праймерами. ПЦР проводят следующим образом: сначала реакционную смесь нагревают до температуры 90-94° С, вызывая этим денатурацию ДНК, затем температуру снижают до 50-65° С в зависимости от нуклеотидной последовательности праймеров, чтобы отжиг происходил в строго комплементарных участках, и, наконец, в смеси устанавливают температуру, оптимальную для работы ДНК-полимеразы. При воспроизведении этого цикла количество копий участка ДНК, находящегося между местами отжига праймеров, возрастает в логарифмической зависимости, т.е. от одной двухцепочечной молекулы можно получить 2n одноцепочечных копий, где "n" равно количеству циклов.

Применение термостабильных полимераз требовало выяснения зависимости их синтетической активности от условий реакции. Исследование связи активности фермента с температурой показало, что некоторую активность (несколько десятков пар оснований, включенных в синтезируемую цепь в течение одной минуты) можно наблюдать при комнатной температуре. Заметное увеличение активности наблюдалось при температурах 50-65° С, а от 65° до 75-79° С была установлена логарифмическая зависимость синтетической активности от температуры. Надо отметить, что на активность фермента оказывают влияние большое число факторов, и поэтому приведение точных данных о максимальной активности Taq-полимеразы затруднено.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, dNTP и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.

Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения .

Детекция продукта ПЦР

Присутствие специфического ПЦР-продукта (ампликона) детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях или альтернативными технологиями. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. Полосы визуализируют с помощью ультрафиолетового подсвечивания в трансиллюминаторе и последующим фотографированием. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Положительный результат оценивают по расстоянию пробега визуализированной полосы, соответствующему полосе положительного контроля, что свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК, равного по размерам положительному контролю. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.

Дополнительные доказательства специфичности ампликона можно получить путем расщепления специфическими рестриктазными ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом. При жидкостно-фазной гибридизации зонд добавляется к амплификату, а затем производится электрофорез в геле. При твердофазной гибридизации амплификат фиксируется на мембране, а затем гибридизируется с зондом. Такое подтверждение специфичности в практической диагностике производится редко, по необходимости.

При определении амплифицированной ДНК методом Саузерн-блота и дот-гибридизации отмечено повышение чувствительности анализа, но для получения ответа требуется дополнительно 1-2 дня.

Прямое секвенирование амплифицированной ДНК является также высоконадежным методом доказательства специфичности, но применяется в основном для идентификации точечных мутаций генов.

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза), Thermus thermophilus (Tth-полимераза) и другие.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Правила подбора праймеров при постановке ПЦР

Концентрация праймеров обычно варьирует в пределах 0,1-1 мкМ. Более высокая концентрация праймеров может приводить к образованию неспецифических продуктов.

Праймеры подбирают с учетом следующих требований:

а) содержание оснований Г и Ц в праймере должно находиться в пределах 40-60 %;

б) основания Г и Ц должны быть равномерно распределены по всей длине праймера;

в) желательно чтобы на 3’-конце праймера находилось основание Г или Ц, так как это увеличивает эффективность ПЦР;

г) следует избегать наличия 3 и более оснований Г или Ц на 3’-конце праймера, поскольку это может приводить к ошибочному спариванию праймера с ГЦ-богатыми участками ДНК;

д) праймеры не должны формировать стабильных дуплексов сами на себя или друг с другом;

е) участки отжига должны быть уникальными, т.е. праймеры не должны иметь длинных комплементарных участков вне специфических мест отжига;

ж) температура плавления (Т_m) данной пары праймеров должна быть сходной и находиться в пределах 55-65 ^оС.

Для ориентировочного подсчета температуры плавления используют формулу:

Т_m = 2(А+Т) + 4(Г+Ц),

где А, Т, Г, Ц, – количество соответствующих нуклеотидов в праймере. Более точные результаты можно получить при использовании формулы:

Т_m = 81,5 + 16,6(lgM) + 0,41(%Г+Ц)–(600/L),

где М – ионная сила раствора (в молях/л), L – длина олигонуклеотида. Эта формула пригодна для олигонуклеотидов длиной 14-70 оснований

32. BLAST (англ. Basic Local Alignment Search Tool — средство поиска основного локального выравнивания) — семейство компьютерных программ, служащих для поиска гомологов белков или нуклеиновых кислот, для которых известна первичная структура (последовательность) или её фрагмент. Используя BLAST, исследователь может сравнить имеющуюся у него последовательность с последовательностями из базы данных и найти последовательности предполагаемых гомологов. Является важнейшим инструментом для молекулярных биологов, биоинформатиков, систематиков. Программа BLAST была разработана учёными Stephen Altschul, Warren Gish, Webb Miller, Eugene Myers, и David J. Lipman в системе Национальных институтов здравоохранения США

Классификация программ серии BLAST

1. Нуклеотидные

предназначены для сравнения изучаемой нуклеотидной последовательности с базой данных секвенированных нуклеиновых кислот и их участков:

• megablast — быстрое сравнение с целью поиска высоко сходных последовательностей,

• dmegablast — быстрое сравнение с целью поиска дивергировавших последовательностей, обладающих незначительным сходством,

• BLASTn — медленное сравнение с целью поиска всех сходных последовательностей и др.

2. Белковые

предназначены для сравнения изучаемой аминокислотной последовательности белка с имеющейся базой данных белков и их участков.

• BLASTp — медленное сравнение с целью поиска всех сходных последовательностей,

• cdart — сравнение с целью поиска гомологичных белков по доменной архитектуре,

• rpsblast — сравнение с базой данных консервативных доменов,

• psi-blast — сравнение с целью поиска последовательностей, обладающих незначительным сходством,

• phi-blast — поиск белков, содержащих определённый пользователем паттерн и др.

3. Транслирующие

способны транслировать нуклеотидные последовательности в аминокислотные:

• BLASTx — переводит изучаемую нуклеотидную последовательность в кодируемые аминокислоты, а затем сравнивает её с имеющейся базой данных аминокислотных последовательностей белков,

• tblastn — изучаемая аминокислотная последовательность сравнивается с транслированными последовательностями базы данных секвенированных нуклеиновых кислот,

• TBALSTx — переводит изучаемую нуклеотидную последовательность в аминокислотную, а затем сравнивает её с транслированными последовательностями базы данных секвенированных нуклеиновых кислот.

4. Геномные

предназначены для сравнения изучаемой нуклеотидной последовательности с базой данных секвенированного генома какого-либо организма (человека, мыши и др.)

• magicblast — картирует прочтения (риды) на полный геном или транскриптом.

5. Специальные

прикладные программы, использующие BLAST:

• bl2seq — сопоставление двух последовательностей по принципу локальных выравниваний,

• VecScreen — определение сегментов нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут иметь векторное происхождение и др.

Принцип работы BLAST

Все выравнивания принято делить на глобальные (последовательности сравниваются полностью) и локальные (сравниваются только определённые участки последовательностей). Программы серии BLAST производят локальные выравнивания, что связано с наличием в различных белках сходных доменов и паттернов. Кроме этого локальное выравнивание позволяет сравнить иРНК с геномной ДНК. В случае глобального выравнивания обнаруживается меньшее сходство последовательностей, особенно их доменов и паттернов.

После введения изучаемой нуклеотидной или аминокислотной последовательности (запрос) на одну из веб-страниц BLAST, она вместе с другой входной информацией (база данных, размера «слова» (участка), значение величины E и др.) поступает на сервер. BLAST создаёт таблицу всех «слов» (в белке — это участок последовательностей, который по умолчанию состоит из трёх аминокислот, а для нуклеиновых кислот из 11 нуклеотидов) и сходных «слов».

Затем в базе данных проводится их поиск. Когда обнаруживается соответствие, то делается попытка продлить размеры «слова» (до 4 и более аминокислот и 12 и более нуклеотидов) сначала без гэпов (пробелов), а затем с их использованием. После максимального продления размеров всех возможных «слов» изучаемой последовательности, определяются выравнивания с максимальным количеством совпадений для каждой пары запрос — последовательность базы данных, и полученная информация фиксируется в структуре SeqAlign. Форматер, расположенный на сервере BLAST, использует информацию из SeqAlign и представляет её различными способами (традиционным, графическим, в виде таблицы).

Для каждой обнаруженной в базе данных программами BLAST последовательности необходимо определить, насколько она сходна с изучаемой последовательностью (запрос) и значимо ли это сходство. Для этого BLAST вычисляет число битов и величину Е (expected value, E-value) для каждой пары последовательностей.

При определении сходства ключевым элементом является матрица замен, так как она определяет показатели сходства для любой возможной пары нуклеотидов или аминокислот. В большинстве программ серии BLAST используется матрица BLOSUM62 (Blocks Substitution matrix 62 % identity, блоковая матрица замен с 62 % идентичности). Исключением являются blastn и megablast (программы, которые выполняют нуклеотид — нуклеотидные сравнения и не используют матрицы аминокислотных замен).

С помощью модифицированных алгоритмов Смита-Уотермана или Селлерса определяются все пары сегментов (продленные «слова»), которые нельзя увеличить, так как это приведёт к уменьшению показателей сходства. Такие пары продленных «слов» называются парами сегментов с максимальным сходством (high-scoring segment pairs, HSP). В случае достаточно большой длины изучаемой последовательностей (m) и последовательности базы данных (n) показатели сходства HSP характеризуются двумя параметрами K (размера области поиска) и P (системы подсчёта). Эти показатели необходимо указывать при приведении показателей сходства изучаемой последовательности и последовательности базы данных (S).

Для сравнения показателей сходства различных выравниваний независимо от используемой матрицы, их необходимо преобразовать. Для получения преобразованного показателя сходства (числа битов, B) используют формулу:

B = (P*S-lnK)/ln2

Величина B показывает, насколько сходны последовательности (чем больше число битов, тем больше сходство). Так как в формулу расчёта B заложены показатели К и P, то нет необходимости указывать их при приведении значений B. Величина E (Е-value), соответствующая показателю B, показывает достоверность данного выравнивания (чем ниже значение E, тем достовернее выравнивание). Она определяется по формуле:

E = m*n*2^(-B)

Программы BLAST преимущественно определяют значение E, а не P (вероятности наличия хотя бы одного HSP с показателем, превышающим или равным S). Но при E < 0,01 значения P и E почти идентичны.

Величина E определяется по формуле (2) при сравнении лишь двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Сравнение изучаемой последовательности длиной m с множеством последовательностей базы данных может основываться на двух положениях. Первое положение состоит в том, что все последовательности базы данных одинаково сходны с изучаемой. Это подразумевает, что значение E для выравнивания с короткой последовательностью, содержащейся в базе данных, следует приравнять со значением E для выравнивания с длинной последовательностью. Для вычисления значения E по базе данных необходимо умножить значение E, полученное при попарном сравнении, на число последовательностей в ней. Второе положение заключается в том, что изучаемая последовательность более сходна с короткими, а не с длинными последовательностями, потому что последние часто состоят из различных участков (многие белки состоят из доменов). Если предположить, что вероятность сходства пропорциональна длине последовательности, то попарное значение E для последовательности базы данных длиной n надо умножить на N/n, где N — общая длина аминокислот или нуклеотидов в базе данных. Программы BLAST преимущественно используют этот подход для вычисления значений E по базе данных.

Теоретически локальное выравнивание может начинаться с любой пары нуклеотидов или аминокислот выровненных последовательностей. Однако HPS, как правило, не начинаются близко к краю (началу или концу) последовательностей. Для коррекции такого краевого эффекта необходимо вычислять эффективную длину последовательностей. В случае последовательностей длиной более 200 остатков происходит нейтрализация краевого эффекта.