5. Патогенез

Локализация и выделение вируса. Многочисленные исследова­ния патогенеза бешенства позволили условно разделить острую рабическую инфекцию на три основных фазы: I фаза — экстраневральная, без видимого размножения вируса в месте инокуляции; II фаза — интраневральное, центростремительное распростране­ние инфекции; III фаза — диссеминация вируса по всему организ­му, сопровождаемая появлением симптомов болезни и, как прави­ло, гибелью животного.

Распространение вируса бешенства по нервным путям впервые доказали Пастер и Ру. Вирус проникает в организм животного со слюной в местах укуса, непродолжительное время сохраняется в месте внедрения (до 2 нед), а затем по центростремительным не­рвам продвигается к спинному и головному мозгу. Из мозга по центробежным нервам он попадает в слюнные железы, где репро­дуцируется в нервных узлах и после дегенерации нервных клеток выходит в протоки желез, инфицируя слюну. Из мозга вирус так­же нейрогенным путем попадает в слюну, роговицу, надпочечни­ки. Выделение вируса со слюной начинается за 10 сут до проявле­ния клинических признаков, поэтому французский регламент предусматривает 15-суточный срок наблюдения за покусавшим животным. У бешеной лисицы накапливается в слюнных железах столько вируса, что можно заразить 67 млн лисиц. Доказано на­хождение вируса во всех внутренних органах и крови, кроме саль­ника, селезенки и желчного пузыря. Из центральной нервной сис­темы по нервным волокнам вирус попадает во внутренние органы, а затем в кровь. Таким образом происходит генерализация инфекционного процесса.

Вирус бешенства проникает в организм восприимчивого жи­вотного, продвигается по центральным нервным волокнам, голов­ному и спинному мозгу, где размножается и вызывает негнойный полиэнцефалит. По центробежным нервным волокнам вирус по­падает в слюнные железы, размножается в нервных ганглиях и после их дегенерации появляется в слюне. Наибольшее количе­ство вируса содержится в аммоновых рогах, продолговатом мозге, мозжечке, в ядрах черепно-мозговых нервов и в поясничной части спинного мозга. Воздействие вируса вначале вызывает раздраже­ние нервных клеток, а затем их дегенерацию, обусловливающую паралитическое явление.

Синтез РНК. Первой стадией в инфекционном цикле любых РНК-содержащих вирусов с негативным геномом является синтез мРНК. В эукариотических клетках нет РНК-зависимой РНК-по-лимеразы, поэтому для экспрессии своего генома рабдовирусы должны иметь собственную полимеразу и упаковывать этот фер­мент в зрелые вирусные частицы. Сразу же после удаления обо­лочки инфекционный вирус с помощью фермента, привлеченного им в клетку, начинает транскрипцию.

Репликация рабдовирусов осуществляется в две стадии. Ми­нус-цепь в составе рибонуклеокапсида служит матрицей для син­теза комплементарной РНК, совпадающей по размеру с геномной. N-белок связывается с новосинтезированной РНК, образуя рибо-нуклеокапсид, создающий плюс-геномную РНК, после чего процесс повторяется и на плюс-РНК этого рибонуклеокапсида, как на Матрице, образуются новые минус-цепи.

Синтез и созревание вирусных белков. МРНК рабдовирусов эффективно транслируется рибосомами клетки-хозяина. Для регуля­ции количества каждого белка используется не трансляционный, а транскрипционный контроль. Количество синтезируемых вирус­ных белков пропорционально количеству соответствующих мРНК. Поскольку транскрипция рабдовирусов последовательна и полярна, ее наиболее высокий уровень достигается для N-мРНК и, следовательно, для N-белка, а наименьший — для L-мРНК и L-белка. Фракционирование клеточных экстрактов и опыты с им­пульсной меткой показали, что каждый вирусный белок проходит свой путь созревания, который завершается переносом на клеточ­ную мембрану, где происходят сборка и почкование зрелых вирионов.

Рабдовирусы состоят из двух отдельных морфологических еди­ниц — оболочки и рибонуклеопротеина (РНП). РНП, состоящий из РНК и белков N, NS и L, собирается как отдельная структура в цитоплазме координировано с репликацией вирусной РНК. Ос­новным белком РНП является N-белок, который включается в РНП, не подвергаясь постгрансляционным модификациям. Ново­синтезированный N-белок перед сборкой в РНК входит в пул ра­створимых цитоплазматических белков. При этом он избира­тельно инкапсидирует только решшкативные РНК, хотя более 90 % последовательностей, входящих в состав репликативной плюс-геномной РНК, представлено и в мРНК.

Добавление N-белка приводит к накоплению в цитоплазме РНП, содержащих как плюс-, так и минус-геномные РНК. РНП, содержащие плюс-РНК, остаются в цитоплазме; их единственная функция — служить матрицей для синтеза минус-цепей. Новосин­тезированные минус-РНП могут использоваться им как матрицы для синтеза мРНК (вторичная транскрипция), или для реплика-тивного синтеза плюс-цепей РНК, или для включения в почку­ющиеся вирионы.

С цитоплазматическими РНП ассоциированы также два белка с полимеразной активностью (NS и L), но пути их созревания раз­личны, причем эти пути отличаются и от пути созревания N-белка. NS-белок интенсивно фосфорилируется по сериновым и трео-ниновым остаткам, что приводит к гетерогенности популяции его молекул.

Сборка оболочки вириона начинается с включения вирусного гликопротеина в плазматическую мембрану клетки. Гликопротеин претерпевает сложный путь созревания, включающий протеолитическое нарезание, присоединение и процессинг олигосахаридов, присоединение жирных кислот. Эти модификации осуществ­ляются одна за другой в ходе синтеза и последующего транспорта G-белка к поверхности клетки. Изучение кинетики этого процес-са показало, что для достижения клеточной мембраны новосинтезированному G-белку требуется по меньшей мере 15 мин. В отличие от четырех других вирусных белков G-белок всегда связан с мембраной; его мРНК обнаруживается в рибосомах, связанных с мембранами.

М-белок имеет относительно простой механизм созревания. Хотя он является белком наружной мембраны, его мРНК трансли­руется на свободных полисомах, а сам белок проходит через не­большой пул растворимых цитоплазматических белков. Посколь­ку М-белок выстилает внутреннюю поверхность липидной обо­лочки вириона, а также связывается с нуклеокапсидом, оказалось неожиданным, что он, не накапливаясь ни на клеточной мембра­не, ни в цитоплазматических РНП, непосредственно включается в состав вирионов из растворимой фракции. Опыты по кинетике позволяют предложить следующее объяснение: М-белок образует центр нуклеации при почковании, и стоит ему начать взаимодей­ствие с мембраной или РНП, как дальнейшие стадии этого взаи­модействия произойдут с такой быстротой, что их невозможно за­регистрировать.

Сборка вирионов. Почкование зрелых вирионов — сложный процесс, для которого необходимы ассоциированный с мембра­ной G-белок, растворимый М-белок и РНП-частицы. Все эти компоненты собираются на определенном участке мембраны. М-белок обеспечивает почкование благодаря образованию ло­кальных кластеров с G-белком, после чего происходят быстрое присоединение РНП и почкование.

Хотя липидный состав оболочки вириона близок к аналогично­му составу клеточной плазматической мембраны, часто он с ним не совпадает, т. е. включение липидов в мембрану вириона носит в какой-то степени избирательный характер. В ходе почкования из вирусной мембраны практически полностью исключаются вирус­ные белки.

Влияние на метаболизм клетки-хозяина. Рабдовирусы представ­ляют собой цитолитические вирусы, быстро убивающие заражен­ные клетки. Гибели клетки предшествует эффективное выключе­ние синтеза хозяйских белков, ДНК и РНК. До сих пор до конца неизвестно, что служит причиной гибели клетки: кумуляторное действие вируса на клеточный метаболизм или его действие на специфическую мишень. Почему клетка гибнет так быстро? Что­бы понять это, нужно иметь в виду, что при заражении затрагива­ются, три основные пути биосинтеза и различные клеточные ли­нии обладают разной чувствительностью. Хотя общая картина того, как вирус убивает клетку, еще не сложилась, уже частично изучены факторы, включающие отдельные биосинтетические пути. Для гибели зараженной клетки необходима не репликация вируса, а транскрипция вирусного генома, так же как для включе­ния всех трех биосинтетических путей.

Поскольку репликация рабдовирусов происходит в цитоплазме зараженных клеток и может осуществляться даже в клетках, ли­шенных ядра, столь сильное влияние вируса на процессы, проте­кающие в ядре, вызывает удивление. Например, существенно сни­жают уровень синтеза РНК всеми тремя клеточными РНК-поли-меразами: Pol 1, 2, 3.

Опыты в реконструированных системах in vitro показали, что блокирование синтеза РНК обусловлено необратимой инактива­цией не хозяйских транскриптаз, а скорее частоты инициации in vitro. Эксперименты с 15-мутантами свидетельствуют о том, что для подавления синтеза клеточных РНК необходима транскрипция вирусного генома. Но по данным опытов с УФ-инактивацией, транскрипции должна подвергнуться лишь малая часть генома, возможно, только лидерная последовательность. Появление на­дежных систем для эукариотической транскрипции in vitro дало возможность изучать непосредственно влияние продуктов вирусов бешенства на транскрипцию, обусловленную Pol 2.

Вирусная персистенция. Несмотря на то, что в целом рабдовирусы относятся к высоковирулентным цитопатическим вирусам, оказалось возможным получить несколько персистентно заражен­ных линий, или линий—носителей вируса бешенства. Для них ха­рактерны слабый цитопатический эффект и непрерывный, но низкий уровень продукции вируса. Некоторые зараженные куль­туры клеток поддерживаются более 5 лет.

Чтобы установить и поддерживать персистентную инфекцию, следует нейтрализовать нормальное цитопатическое действие виру­са; при этом резко снижается его способность реплицироваться. Персистентная инфекция может запускаться стандартным вирулент­ным вирусом, если его репликацию подавить предварительной об­работкой клеток интерфероном или заражать им совместно с боль­шим количеством дефектных интерферирующих частиц (ДИЧ). Поддержание персистентной инфекции коррелирует со многими факторами, которые варьируют в разных линиях, но все без исклю­чения снижают уровень репликации вируса. ДИЧ и интерферон важны не только для установления, но и для поддержания персистенции. Тем не менее оказалось, что главную роль в поддержании персистенции играет отбор мутантов. Вирусы, выделенные из пер­систентно зараженных клеток, существенно отличаются от тех, ко­торые использовали для заражения: как правило, они образуют мелкие бляшки, реплицируются хуже, чем родительский штамм.

Принимая во внимание сложный механизм гибели клетки при рабдовирусной инфекции, кажется вероятным, что персистентная инфекция отражает не нарушение специальной летальной функ­ции вируса, а угнетение вирусных функций ниже уровня, необхо­димого для гибели клетки.

Изучение персистентно зараженных клеточных линий показа­ло, что in vitro стандартный цитопатический характер взаимодействия между рабдовирусом и клеткой может быть изменен, однако все еще неясно, справедливо ли это для природных условий in vivo.

За последние годы описаны казуистические случаи неоднок­ратного выделения вируса бешенства из слюны здоровых собак на протяжении почти 2 лет после их инфицирования. Аналогич­ная картина наблюдалась и у некоторых экспериментально зара­женных кошек. В 1981 г. представлены результаты 4-летнего изу­чения вируса бешенства мангустов, выловленных в ряде районов Гренады. С помощью ИФ вирус бешенства обнаружен в срезах мозга 100 (2,1 %) из 4754 обследованных мангустов. Среди 1675 обследованных животных обнаружены ВНА в пробах 498 сыво­роток (30 %). При сопоставлении результатов обнаружения виру­са бешенства и соответствующих антител (АТ) оказалось, что число больных животных в течение 1971—1974 гг. ежегодно сни­жалось (с 3,5 до 0,6 %), а число мангустов с определяемыми АТ увеличилось с 20,8 до 43,2 %. АТ к вирусу бешенства, как отмече­но в опытах с отловленными в природе мангустами (20 особей), циркулировали в крови еще 35 мес. У животных с наиболее вы­сокими титрами АТ (1:1400) наблюдалась и наибольшая скорость их снижения.

Одно из свойств вируса бешенства — способность к персистенции in vivo и in vitro. Хроническая инфекция клеток Нер-2/2 и ВНК-21/13 фиксированным вирусом бешенства сопровождается определенными изменениями клеточного метаболизма. Антиген (АГ) вируса бешенства образуется в цитоплазме клеток независи­мо от включений. Персистенцию вируса бешенства удается на­блюдать при хронической инфекции в клеточных культурах, при­чем по морфологии и скорости размножения клеток хронически инфицированные культуры не отличались от незараженных. Ви­русный АГ передавался при делении клеток. После того как была показана возможность образования ДИЧ вируса бешенства при первичной инфекции in vivo, ДИЧ были выделены и охарактери­зованы при хронической инфекции вируса бешенства клеток ВНК. Генерация ДИЧ в нейронах ЦНС может не только опреде­лять окончательный исход инфекции, но и объяснять ее латент­ный характер. В настоящее время данные о роли интерферона и ДИЧ в механизме хронической инфекции вируса бешенства в кле­точных культурах противоречивы. Показано, что ts-мутанты, представляющие собой условно дефектные вирусы, могут интер­ферировать с размножением вируса дикого типа. Роль ts-мутантов при хронической инфекции изучена недостаточно. Современные представления о мутации этого вируса подтверждаются рядом примеров. Так, с помощью моноклониальных АТ из популяции вирулентного вируса бешенства удавалось селекционировать ва­рианты с измененным поверхностным гликопротеином и призна­ками аттенуации для ЦНС. Мутант вируса бешенства, имеющий две аминокислотные замены (лейцин-132 на фенилаланин и аргинин-333 на глютамин), утратил нейровирулентность для взрослых мышей.

Вирулентность штаммов ЕКА и СУ5 вируса бешенства для мы­шей зависела от наличия аргинина или лизина в положении 333 вирусного гликопротеина. Замена аргинина в положении 333 на лейцин, изолейцин, метионин, цистин или серии обеспечивала полную авирулентность. Такие варианты характеризовались ми­нимальным количеством точечных мутаций.

Особенности репродукции вируса бешенства. При связывании с тканью вирус бешенства концентрируется в неврологических кон­тактах. Этот процесс ингибируется d-бунгаротоксином и d-тубакурарином, каждый из которых способен связываться с ацетилхолиновыми рецепторами. Следовательно, последние служат высо­коэффективными рецепторами для вируса бешенства. Этот вывод помогает понять природу нейротропности вируса, но поскольку в условиях in vitro он поражает не только нервные клетки, должны существовать также и другие рецепторы.

Хотя рабдовирусы имеют липидную оболочку, в клетки они проникают в основном с помощью эндоцитоза, а не путем прямо­го слияния с мембраной. Этот процесс удается наблюдать только при кислых значениях рН или после осаждения вирионов на клет­ки с помощью центрифугирования.