ПРАКТИКУМ Гентех в мед ЛЕЧ 4 02 24

31

32.Аргиназная недостаточность (нарушения обмена цикла мочевины — E72.2 МКБ10); https://amg-genetics.ru/pdf/mr-narushenie-tcikla-mochevini.pdf

33.Бета-кетотиолазная недостаточность (другие виды нарушений обмена аминокислот с разветвленной цепью — E71.1 МКБ-10);

34.Недостаточность синтетазы голокарбоксилаз (недостаточность других уточненных витаминов группы B — E53.8 МКБ-10).

35.Спинальная мышечная атрофия (детская спинальная мышечная атрофия, I тип [Верднига-Гоффмана] — G12.0 МКБ-10; другие наследственные спинальные мышечные атрофии — G12.1 МКБ-10; спинальная мышечная атрофия неуточненная — G12.9

МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/recomend/593_3

36.Первичные иммунодефициты (иммунодефициты с преимущественной недостаточностью антител — D80 МКБ-10; комбинированные иммунодефициты — D81 МКБ-10; иммунодефициты, связанные с другими значительными дефектами — D82 МКБ-10;

другие иммунодефициты — D84 МКБ-10) https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/735_1

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА.

1.Разобрать современные биохимические методы диагностики наследственных болезней обмена. Перенести в тетрадь таблицу 7, в которой отметьте цель и сущность биохимических исследований.

Таблица 7

Цель и сущность биохимических исследований.

Метод

Цель

Основа метода

а) тандемная массспектрометрия

б) газовая хромато-масс- спектрометрия (ГХ-МС)

в) тонкослойная хроматография (ТСХ)

2.Разобрать критерии нозологий входящих в список массового неонатального скрининга. Внести критерии в тетрадь.

1._________________________________________________________________________

2._________________________________________________________________________

3._________________________________________________________________________

4._________________________________________________________________________

5._________________________________________________________________________

6._________________________________________________________________________

3.Разобрать новые технологии массового неонатального скрининга. Перенести схему в тетрадь, вписать определения.

ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ МУЛЬТИПЛЕКСНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ РАСШИРЕННОГО МАССОВОГО НЕОНАТАЛЬНОГО СКРИНИНГА

ТМС

NGS

32

4.Разобрать алгоритм проведения расширенного неонатального скрининга. Перенести схему в тетрадь и вписать сроки выполнения исследования.

Забор биоматериала, сроки

Доставка образцов в лабораторию МГК

Лабораторные исследования

Время проведения подтверждаю-		Время
щих биохимических и молекуляр-		повторного	Ретест для
но-генетических исследований в		исследования	новорожденных группы
референс-центре			высокого риска

5.Разобрать методы, используемые в диагностике генных болезней расширенного неонатального скрининга. Таблицу 8 перенести в тетрадь и заполнить.

Таблица 8

Методы диагностики генных болезней расширенного неонатального скрининга

	Название болезни	Метод неонатального
		скрининга
1.	Врожденный гипотиреоз
2.	Адреногенитальный синдром
3.	Галактоземия
4.	Муковисцидоз
5.	Фенилкетонурия
6.	Дефицит синтеза биоптерина (тетрагидробиоптерина)
7.	Дефицит реактивации биоптерина (тетрагидробиоптерин)
8.	Тирозинемия, тип I
9.	Болезнь с запахом кленового сиропа мочи
10.	Гомоцистинурия
11.	Пропионовая ацидемия
12.	Метилмалоновая ацидемия (метилмалонил КоА-мутазы не-
	достаточность)
13.	Метилмалоновая ацидемия (недостаточность кобаламина С)
14.	Метилмалоновая ацидемия (недостаточность кобаламина А)
15.	Метилмалоновая ацидемия (недостаточность кобаламина В)
16.	Метилмалоновая ацидемия (дефицит метилмалонил КоА-
	эпимеразы)
17.	Метилмалоновая ацидемия (недостаточность кобаламина D)
18.	Изовалериановая ацидемия
19.	Глутаровая ацидемия, тип I
20.	3-гидрокси-3-метилглутаровая недостаточность

	33
21.	Глутаровая ацидемия, тип II
22.	Первичная карнитиновая недостаточность
23.	Среднецепочечная ацил-КoА дегидрогеназная недостаточ-
	ность
24.	Длинноцепочечная 3-ОН ацил-КoА дегидрогеназная недо-
	статочность
25.	Очень длинноцепочечная ацил-КоА дегидрогеназная недо-
	статочность
26.	Недостаточность митохондриального трифункционального
	белка
27.	Недостаточность карнитинпальмитоилтрансферазы тип I
28.	Недостаточность карнитин/ пальмитоилтрансферазы, тип II
29.	Недостаточность карнитин/Ацилкарнитинтранслоказы
30.	Цитруллинемия тип I
31.	Аргиназная недостаточность
32.	Недостаточность синтетазы голокарбоксилаз
33.	Бета-кетотиолазная недостаточность
34.	Дефицит биотинидазы
35.	Спинальная мышечная атрофия
36.	Первичные иммунодефициты

34

ЗАНЯТИЕ № 4

Tема: Молекулярно-генетические методы в практической медицине.

Цель занятия: Изучить основные методы молекулярной генетики. Сформировать компетенции интерпретации результатов молекулярно-генетических исследований. Ознакомиться с общими принципами обработки данных, полученных с помощью NGS. Изучить методы оценки патогенности мутаций. Познакомиться с открытыми базами данных мутаций и полиморфизмов генов человека.

Вопросы для самополготовки:

1.Молекулярно-генетические методы идентификации известных частых мутаций в генах наследственных заболеваний человека: ПЦР, ПЦР -ПДРФ, MLPA, RT-ПЦР (показания, клиническая интерпретация полученного результата исследования, правила записи результатов исследований, номенклатура генных мутаций).

2.Сканирующие молекулярно-генетические методы: методы секвенирования нуклеотидной последовательности (основные принципы, возможности и ограничения, краткая сравнительная характеристика методов, основы интерпретации полученных результатов).

3.Особенности интерпретации результатов, полученных методом высокопроизводительного параллельного секвенирования (NGS): общие принципы обработки данных NGS, принципы оценки патогенности мутаций, открытые базы данных мутаций и полиморфизмов генов человека.

НЕОБХОДИМО ЗНАТЬ:

1.Методику полимеразной цепной реакции.

2.Виды ПЦР.

3.Основные принципы методов секвенирования ДНК.

4.Возможности и ограничения различных методов секвенирования.

5.Сравнительную характеристику современных методов секвенирования.

6.Изучить методы оценки патогенности мутаций.

НЕОБХОДИМО УМЕТЬ:

1. Ориентироваться в открытых базах данных мутаций и полиморфизмов генов человека.

НЕОБХОДИМО ВЛАДЕТЬ:

1. Интерпретировать результаты молекулярно-генетического исследования.

ВНЕАУДИТОРНАЯРАБОТА:

1.ПЦР, методика проведения, основные компоненты ПЦР.

6.Записать в тетрадь определение ПЦР.

1.2.При подготовке к занятию перенести в тетрадь и заполнить таблицу 9, в которой отразить основные компоненты ПЦР и их описание.

Таблица 9

	Основные компоненты ПЦР
Основные компоненты ПЦР	Описание компонента
Буфер
Праймеры
Taq-полимераза
Д-НТФ

35

Анализируемый образец

10.Изучить и записать в тетрадь основные показания к проведению ПЦР.

Показания для проведения ПЦР:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

11. При подготовке к занятию написать в тетрадь и заполнить, отражающую сущность основных этапов амплификации (табл. 10).

Таблица 10

		Основные этапы амплификации
	Этапы амплификации	Сущность этапа
1	Температурная
	денатурации ДНК
2	Отжиг праймеров
3	Элонгация

12. Изучить основные методы ПЦР, перенести в тетрадь и заполнить таблицу 11, отразив краткое описание и показания к применению методов ПЦР.

			Таблица 11
		Основные виды ПЦР
Название		Описание	Применение
ПЦР-ПДРФ (Полиморфизм
длин рестрикционных	фраг-
ментов)
MLPA (Множественная ли-
газная пробоподготовка)
RT-ПЦР (ПЦР с детекцией
результатов в режиме реаль-
ного времени)

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

1.Ознакомится со структурой и принципами работы в молекулярно-генетической лаборатории.

2.Изучить возможные генетические полиморфизмы генов системы свертывания в результате ПЦР в таблице 12.

		Таблица 12
	Полиморфизмы генов системы свертывания
Ген	Генотип	Описание
1	2	3
F2: 20210 G>A	GG	Нейтральный генотип
(протромби)
	GA	Повышение уровня протромбина в плазме на 30%. Гиперкоагуляция. Риски:
		венозные тромбозы, инсульт, потеря плода в I триместре.
	AG	Повышение уровня протромбина в плазме на 30%. Гиперкоагуляция. Риски:
		венозные тромбозы, инсульт, потеря плода в I триместре.
	AA	Повышение уровня протромбина в плазме на 30%. Гиперкоагуляция. Риски:
		венозные тромбозы, инсульт, потеря плода в I триместре.

1	2	3
F5: 1691 G>A	GG	Нейтральный генотип
(Arg506Gln)	GA	Повышение устойчивости фактора V к С-протеину («Лейденская мута-
(проакцелерин)		ция»). Гиперкоагуляция. Риски: тромбоз вен нижних конечностей, ТЭЛА,
		артериальные тромбозы в молодом возрасте, тромбозы церебральных сосу-
		дов, инсульт, потеря плода во II и III триместрах.
	AG	Повышение устойчивости фактора V к С-протеину («Лейденская мута-
		ция»). Гиперкоагуляция. Риски: тромбоз вен нижних конечностей, ТЭЛА,
		артериальные тромбозы в молодом возрасте, тромбозы церебральных сосу-
		дов, инсульт, потеря плода во II и III триместрах.
	AA	Повышение устойчивости фактора V к С-протеину («Лейденская мута-
		ция»). Гиперкоагуляция. Риски: тромбоз вен нижних конечностей, ТЭЛА,
		артериальные тромбозы в молодом возрасте, тромбозы церебральных сосу-
		дов, инсульт, потеря плода во II и III триместрах.
F7: 10976 G>A	GG	Нейтральный генотип
(Arg353Gln)	GA	Изменение фактора VII. Cнижена вероятность инфаркта и инсульта. Риски:
(проконвертин)		кровотечения на фоне антикоагулянтнойтерапии. Субарахноидальные кр о-
		вотечения.
	AG	Изменение фактора VII. Cнижена вероятность инфаркта и инсульта. Риски:
		кровотечения на фоне антикоагулянтнойтерапии. Субарахноидальные кр о-
		вотечения.
	AA	Изменение фактора VII. Cнижена вероятность инфаркта и инсульта. Риски:
		кровотечения на фоне антикоагулянтнойтерапии. Субарахноидальные кр о-
		вотечения.
F13: G>T	GG	Нейтральный генотип
(Val34Leu)	GT	Изменение фактора XIII. Cнижена вероятность тромбозов, инсульта.'
(фибриназа)	TG	Изменение фактора XIII. Cнижена вероятность тромбозов, инсульта.'
	TT	Изменение фактора XIII. Cнижена вероятность тромбозов, инсульта.'
FGB: -455 G>A	GG	Нейтральный генотип
(фибриноген)	GA	Повышение на 10-30% уровня фибриногена в крови. Увеличение вероятно-
		сти образования тромбов. Риски: инсульт, инфаркт.
	AG	Повышение на 10-30% уровня фибриногена в крови. Увеличение вероятно-
		сти образования тромбов. Риски: инсульт, инфаркт.
	AA	Повышение на 10-30% уровня фибриногена в крови. Увеличение вероятно-
		сти образования тромбов. Риски: инсульт, инфаркт.
ITGA2: 807 C>T	CC	Нейтральный генотип.
(Phe224 Phe)	CT	Изменение интегрина α-2 - тромбоцитарного рецептора к коллагену. Уве-
(интегрин a-2)		личение скорости адгезии тромбоцитов. Риски: сердечно -сосудистых забо-
		леваний и патологии беременности.
	TC	Изменение интегрина α-2 - тромбоцитарного рецептора к коллагену. Уве-
		личение скорости адгезии тромбоцитов. Риски: сердечно-сосудистых забо-
		леваний и патологии беременности.
	TT	Изменение интегрина α-2 - тромбоцитарного рецептора к коллагену. Уве-
		личение скорости адгезии тромбоцитов. Риски: сердечно -сосудистых забо-
		леваний и патологии беременности.
ITGB3: 1565	TT	Нейтральный генотип
T>C (Leu33Pro)	TC	Изменение интегрина β-3 - тромбоцитарного гликопротеина IIIA. Гипера-
(интегрин b-3)		грегация тромбоцитов, резистентность к аспирину и плавиксу. Риски: арте-
		риальный тромбоз, инфаркт, потери плода на ранних сроках. У ребенка:
		неонатальная тромбоцитопения, геморрагический диатез, посттрансфузи-
		онная тромбоцитопения.
	CT	Изменение интегрина β-3 - тромбоцитарного гликопротеина IIIA. Гипера-
		грегация тромбоцитов, резистентность к аспирину и плавиксу. Риски: арте-
		риальный тромбоз, инфаркт, потери плода на ранних ср оках. У ребенка:
		неонатальная тромбоцитопения, геморрагический диатез, посттрансфузи-
		онная тромбоцитопения.
	CC	Изменение интегрина β-3 - тромбоцитарного гликопротеина IIIA. Гипера-
		грегация тромбоцитов, резистентность к аспирину и плавиксу. Риски: арте-
		риальный тромбоз, инфаркт, потери плода на ранних ср оках. У ребенка:
		неонатальная тромбоцитопения, геморрагический диатез, посттрансфузи-
		онная тромбоцитопения.

1	2	3
SERPINE1	5G 5G	Нейтральный генотип
(PAI-1): -675	5G 4G	Изменение серпина-1 - антагониста тканевого активатора плазминогена,
5G>4G (серпин		способствующего фибринолизу. Риски: преэклампсия; привычное невына-
-1)		шивание беременности; снижение фибринолитической активности кр ови;
		венозные тромбозы; сердечно-сосудистые заболевания; повышенные риски
		послеоперационных тромбозов.
	4G 5G	Изменение серпина-1 - антагониста тканевого активатора плазминогена,
		способствующего фибринолизу. Риски: преэклампсия; привычное невына-
		шивание беременности; снижение фибринолитической активности крови;
		венозные тромбозы; сердечно-сосудистые заболевания; повышенные риски
		послеоперационных тромбозов.
	4G4G	Изменение серпина-1 - антагониста тканевого активатора плазминогена,
		способствующего фибринолизу. Риски: преэклампсия; привычное невына-
		шивание беременности; снижение фибринолитической активности кр ови;
		венозные тромбозы; сердечно-сосудистые заболевания; повышенные риски
		послеоперационных тромбозов.

3.Рассмотреть результат анализа исследование генов системы гемостаза, дать клиническую интерпретацию.

4.Секвенирование ДНК, основные принципы и методы.

4. 1. Изучить и записать в тетрадь определение севенирования ДНК, указать значение метода.

4.2.Изучить методы секвенирования, перенести в тетрадь и заполнить таблицу 13, указав краткое описание и применение метода и его возможности и ограничения.

		Таблица 13
	Методы секвенирования ДНК
Название	Описание и применение	Возможности и ограничения
Секвенирование
по Сэнгеру
Next-Generation
Sequencing (NGS)
Illumina
Ion Torrent
Third-Generation
Sequencing
PacBio
Oxford Nanopore

38

4.3. Интерпретация результатов секвенирования Изучить терминологию, используемую в анализе данных нуклеотидных после-

довательностей. Во избежание путаницы в терминологии предложено заменить широко используемые определения «мутация» и «полиморфизм» на «вариант нуклеотидной последовательности» со следующими пятью модификациями:

●патогенный (pathogenic)

●вероятно патогенный (likely pathogenic)

●неопределенного значения (uncertain significance)

●вероятно доброкачественный (likely benign)

●доброкачественный (benign)

Рекомендуется все утверждения патогенности представлять совместно с нозологией и типом наследования, например, c.1521_1523delCTT (p.Phe508del), патогенный, муковисцидоз, аутосомно-рецессивный.

4.4. Изучить распространенные базы данных нуклеотидных последовательностей. Таблица 14

Базы данных нуклеотидных последовательностей

Exome Aggregation Consortium	База данных вариантов, найденныхпри проведении экзомного
http://exac.broadinstitute.org/	секвенирования у 61,486 неродственныхиндивидуумов, явля-
	ющихся участниками различныхболезньспецифичныхи по-
	пуляционныхгенетическихисследований. Детские заболева-
	ния и связанные с ними лица были исключены из выборки.
Exome Variant Server	База данных вариантов, найденныхво время экзомного секве-
http://evs.gs.washington.edu/EVS/	нирования несколькихкрупныхкогорт лиц европейского и
	афроамериканского происхождения. Включает в себя данные
	о покрытии, для учета 6 информации об отсутствии варианта.
1000 Genomes Project	База данных вариантов, найденныхво время геномного и тар-
http://browser.1000genomes.org/index.html	гетного секвенирования с низким и высоким покрытием среди
	26и популяций. Обеспечивает большее разнообразия по срав-
	нению Exome Variant Server, но содержит данные более низко-
	го качества, а некоторые когорты содержат данные о род-
	ственных индивидуумах.
dbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp	База данных коротких генетическихвариантов (как правило,
	≤50 п.о.), собранныхиз различныхисточников. Может содер-
	жать и патогенные варианты.
dbVar http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar	База данных структурныхвариантов (как правило, >50 п.о.),
	составленная из многихисточников

4.5. Изучить структуру и содержание заключения о результатах исследования.

1.Информация о пациенте. Информация о пациенте должна включать: ФИО, дату рождения, пол, клинический диагноз, родственные отношения (если есть данные о других членах семьи)

2.Информация о выявленных вариантах:

список патогенных, вероятно патогенных и вариантов неопределенного значения, выявленных при анализе, по номенклатуре HGVS

название гена

положение (позиция замены в геноме по GRCh/hg)

зиготность

номер экзона

номенклатура на уровне нуклеотида и ДНК

номенклатура на уровне белка (в случаях, где используется историческая (альтернативная) номенклатура, рекомендуется указывать оба варианта

номер используемой референсной последовательности (NM)

39

●данные о покрытии

●название заболевания

●тип наследования

●частоты варианта в базах данных

●результаты программ предсказания 3. Дополнительная информация:

●семейное происхождение, если известно при анализе конкретных вариантов, пере-

числение списка искомых вариантов в рамках исследования При интерпретации результатов должна приводиться доказательная база, на

основании которой классифицированы варианты в отчёте.

Отчёт по вариантам в генах неопределённого значения, показанных к тестированию. Ген неопределённого значения - это ген без доказанной ассоциации с фенотипом пациента или с ассоциацией с другим фенотипом, отличным от фенотипа исследуемого пациента.

В случаях с генами неопределённого значения предлагаемая классификация применяться не может, по следующим причинам:

●de novo вариант не имеет сильной доказательной базы (в среднем человек имеет 1 de novo вариант на экзом и 100 de novo вариантов на геном)

●у здорового человека встречаются от 2 до 4 вариантов на геном, нарушающих ра-

боту гена с пагубным эффектом на синтезируемый белок.

Предлагается варианты, найденные в генах неопределённого значения помечать в отчёте как «варианты в генах неопределённого значения». Эти варианты всегдадолжны быть классифицированы как неопределённого значения.

Новые клинические случаи с редкими фенотипами и выявленными патогенными вариантами смогут позволить в дальнейшем классифицировать эти варианты по представленным рекомендациям.

4.6. Изучить рекомендации к проведению повторного анализа и подтверждения результатов.

Ввиду растущей и развивающейся базы знаний о геномных вариантах, может потребоваться повторный анализ результатов проведенного исследования. Врачу рекомендовано периодически запрашивать информацию у лабораторий.

Обязательно проведение подтверждения результатов анализа NGS с помощью ортогональных методов для всех вариантов сиквенса, классифицированных как патогенные, вероятно патогенные и неопределенного значения для менделевских заболеваний. Методы могут включать, но не ограничены:

●секвенирование таргетной области ДНК по Сенгеру

●рестрикционный анализ

●MLPA-анализ

●тестирование членов семьи пациента.

4.7. Изучить примеры заключений.

Пример 1:

Пациент: ФИО Пол: М/Ж

Дата рождения: дд.мм.гг Вид материала: Кровь (венозная) Дата забора: дд.мм.гг

Диагноз: Симптоматическая эпилепсия.

Данные секвенирования могут быть предоставлены по запросу лечащего врача. 1.Патогенные варианты нуклеотидной последовательности, являющиеся

40

вероятной причиной заболевания.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ У ФИО был проведен поиск патогенных мутаций, ассоциированных с наследствен-

ными эпилепсиями, а также с другими наследственными заболеваниями со сходными фенотипическими проявлениями. Выявлен ранее описанный вариант нуклеотидной последовательности в 6 экзоне гена TPP1 (chr11:6638271G>A, rs119455955) в гомозиготном состоянии, приводящий к появлению сайта преждевременной терминации трансляции в 208 кодоне (p.Arg208Ter, NM_000391.3). Вариант описан как мутация, которая в гомозиготной или в компаунд-гетерозиготной форме с другими мутациями приводит к развитию нейронального цероидного липофусциноза, тип 2 (OMIM:204500) основными симптомами которого являются атаксия, миоклонические приступы, постепенный регресс интеллектуального развития [ссылки на источники: или 2 статьи или база данных, в которой указано сколько раз встретился вариант (обязательно больше 2)]. Частота варианта в контрольной выборке ExAC составляет 0.0173%.

Результат требует проверки альтернативными методами (секвенирование по Сенгеру) и тщательного сопоставления с клиническими признаками. Других значимых изменений, соответствующих критериям поиска, не обнаружено.

Пример 2:

Персональные данные

Фамилия	Имя	Отчес тво	Дата рождения	Пол
				мужской

Данные об образце			Данные об исследовании
Биоматериал	Дата взятия	№ образца Genesis	№ заказа Genesis		№ iGC
	биоматериала
Кровь венозная
		Результаты исследования

Клиническая генетика

По результатам полного секвенирования экзома выявлены патогенные / вероятно патогенные генетические варианты в следующих генах:

	Ген			Экзон		Референсная последовательность				Глубина прочтения
	HFE			2			NM_000410.4				192
rs		Положение		Замена		Генотип	Зиготность	Замена	Частота		Патогенность
		(GRCh38/hg38)		нуклеотидов				аминокислоты	аллеля		аллеля
rs1799945		chr6:26090951		c.187C>G		G/G	гомозигота	p.H63D	0.101647		Патогенный

Выявленный генетический вариант ассоциирован с развитием таких наследственных заболеваний как:

	Название	MIM	Тип
			наследования
	Наследственный гемохроматоз	235200	AR

Оценка клинической значимости (патогенности) выявленных генетических вариантов проводилась на основании анализ следующих баз данных: OMIM, VarSome,

ClinVar, GnomAD, ExAC, dbSNP.