ПРИЛОЖЕНИЕ

Приборы и техника люминесцентного спектрального анализа клеток

Введение

Какие бы заманчивые перспективы не открывались в биологии клетки в связи с внедрением в практику лабораторного эксперимента методов люминесцентного спектрального анализа, возможность их реализации зависит прежде всего от наличия в распоряжении исследователя соответствующей техники эксперимента. Важнейшими приборами, необходимыми для этой цели, являются микроспектрофлуориметры.

В настоящее время большинство исследований на клеточном уровне выполняется на приборах, изготовленных непосредственно в лаборатории. Основная причина, определяющая эту ситуацию, заключается в том, что промышленные приборы обычно весьма консервативны и трудно поддаются приспособлению их для наиболее оптимального решения конкретных задач.

Поэтому, несмотря на некоторые трудности самостоятельного изготовления микроспектрофлуориметров, многие исследователи как за рубежом [342-346, 122, 196], так и в нашей стране [347-357) идут по пути самостоятельного создания приборов, наиболее полно отвечающих требованиям поставленной задачи. Такого типа приборы обладают в то же время значительной гибкостью и легко могут быть модернизированы при смене объекта или цели исследования.

Наиболее рациональным подходом при этом является, по-видимому, максимальное использование стандартных блоков и узлов [21, 168, 358-365], выпускаемых промышленностью. Рациональное сочленение стандартных блоков позволяет получить установки, способные решать достаточно широкий круг задач.

Такой подход может быть проиллюстрирован описанием серии микроспектрофлуориметров, разработанных и эксплуатировавшихся в течение ряда лет в Институте биологической физики АН СССР. Важной особенностью этих приборов, как и большинства отечественных микроспектрофлуориметров, является использование интерференционных светоделительных пластинок в качестве опак-иллюминатора. Именно это позволяет применять специальные высокоапертурные микрообъективы и получать высокую яркость люминесценции микрообъекта, что является особенно важным для устойчивости работы спектроанализирующего устройства.

Приложение 1

П1. Микроспектрофлуориметры

П1.1. Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов

Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов [168] является наиболее простым в изготовлении и заслуживает описания, так как его принципиальная схема, приведенная на рис. 1.1, послужила основой нескольких интересных модификаций, описываемых ниже.

Основным элементом оптической схемы прибора служит трехпризменный светосильный спектрограф ИСП-51 со стеклянной оптикой на область спектра от 370 до 1000 нм. Сочленение спектрографа 1 с микрообъективом 14, достигается тем, что входная щель 7 спектрографа помещена в плоскость промежуточного изображения микроскопа, состоящего из микрообъектива 14 и окуляра Гюйгенса 4 (линзы 6 и 8).

Оптическая система микроспектрофлуориметра при регистрации спектров люминесценции клеток работает следующим образом. Источник света - ртутная дуговая лампа 25 типа ДРШ-250 (или ДРШ-100) - освещает коллекторную линзу 24, действующие размеры которой ограничиваются

диафрагмой 23. После этого световой поток проходит через водный теплофильтр 22 (4%-ный раствор СuSO4) и светофильтры 21, выделяющие необходимую для возбуждения люминесценции линию излучения ртути. Все эти детали представляют собой единый узел 20, в качестве которого используется система освещения люминесцентного осветителя ОСЛ-1 [21]. Возбуждающее люминесценцию излучение отражается опак-иллюминатором ОИ-17 с интерференционной светоделительной пластинкой 12 и микрообъективом 14, установленным в стандартном револьверном держателе от любого биологического микроскопа, направляется на микрообъект 15. При этом в плоскость микрообъекта проецируется изображение диафрагмы 23, являющейся, таким образом, полевой диафрагмой.

Рис. 1.1. Блок-схема микроспектрофлуориметра на базе стандартных деталей и узлов.

1	– призменный монохроматор (ИСП-51);	13	– револьверный держатель	24	– коллекторная линза;
2	– мотор развертки спектра;		микрообъективов;	25	– дуговая лампа ДРШ-250;
3	– поворотная призма;	14	– объектив;	26	– реостат;
4	– визирная трубка;	15	– препарат;	27	– блок электролитических
5	– узел входной щели;	16	– предметный столик;		конденсаторов фильтра;
6	– 8 – линзы окуляра Гюйгенса ×4;	17	– конденсор;	28	– выпрямитель;
7	– входная щель монохроматора (полевая	19	– осветитель с лампой накаливания;	29	– электронный стабилизатор сетевого
	диафрагма окуляра Гюйгенса);	20	– блок осветителя ОСЛ-1 в сборе;		напряжения;
9, 11, 18, 34, 35 – зеркала;		21	– светофильтры;	30	– стабилизированный источник
10 – кювета;		22	– жидкостный теплофильтр;		высокого напряжения;
12 – светоделительная пластинка с		23	– ирисовая диафрагма;	31	– фотоумножитель;
	интерференционным покрытием;			32	– милливольтметр (рН-метр ЛПУ-01;
				33	– самописцы.

Свет люминесценции препарата, собранный высокоапертурным микрообъективом 14 и прошедший через пластинку 12 с интерференционным покрытием, поворотным зеркалом 11 (деталь осветителя ОСЛ-1) и линзой 6, направляется в спектрограф ИСП-51. При этом в плоскости входной щели 7 спектрографа находится промежуточное люминесцентное изображение микрообъекта. Таким образом, входная щель 7 спектрографа вырезает требуемый участок увеличенного изображения исследуемой клетки. Этот участок и его расположение во входной щели спектрографа можно визуально наблюдать при введении в ход лучей поворотной призмы 3. В этом положении призма 3 вместе с линзами 6 и 8 представляет собой видоизмененный окуляр Гюйгенса ×4, в плоскости полевой диафрагмы которого размещена входная щель спектрографа.

Промежуточное изображение объекта исследования в плоскости полевой диафрагмы окуляра Гюйгенса (входной щели 7 спектрографа) рассматривается с помощью визирной трубки 4 от фотонасадки типа МФН-1. При этом окончательно выбирается для исследования участок микрообъекта. Затем поворотная призма 3 выводится из хода лучей и световой поток из входной

щели поступает в колиматор спектрографа. В качестве узла поворотной призмы 3 может быть использован с незначительной переделкой узел призм насадки сравнения ОКС-1. Свет люминесценции выбранного участка объекта исследования, ограниченного входной щелью, разлагается призмами в спектр, изображение которого фокусируется выходным объективом фотокамеры в плоскость кассеты для фотопластинок, где устанавливается выходная щель спектрографа. Непосредственно за ней находится фотокатод фотоэлектронного умножителя типа ФЭУ-51 со спектральной чувствительностью от 400 до 800 нм.

Таким образом, регистрирующий узел вместе с выходной щелью и кожухом ФЭУ и его делитель напряжения может быть установлен вместо обычной кассеты для фотопластинок. Разрешающая способность спектрографа при этом несколько ухудшается, однако для широких линий люминесценции биологических объектов это улучшение не столь существенно.

Препарат 15 размещается на предметном столике 16 от микроскопа МС-51. С помощью конденсора 17, зеркала 18 и осветителя 19 (типа ОИ-19) возможно освещение препарата проходящим светом от лампы накаливания. Такое освещение может быть полезным для предварительного выбора участка клетки без излишнего освещения его лучами сине-фиолетовой или УФ-области спектра. Излучение этого же источника света, выделенное узкополосным интерференционным светофильтром, может быть использовано для контроля рассеивающих свойств изучаемой области объекта, как это упоминалось выше. Для облегчения юстировки столика относительно оптической оси микроскопа он имеет одну точку опоры (стальной шарик) и три регулировочных винта.

Описываемый прибор позволяет изучать также спектры люминесценции раствора в кюветах. Для этого возбуждающее люминесценцию излучение может направляться дополнительными зеркалами 34 и 9 на кювету 10 с исследуемым веществом. Поворотное зеркало 11 переключается при этом в верхнее положение и направляет свет люминесценции кюветы во входную щель 7 спектрографа. На практике, однако, особенно при наличии контактных микрообъектов [21], удобнее бывает производить эти исследования в микрокюветах, размещенных на предметном столике вместо микропрепарата 15. Развертка спектра в описываемой первой модели микроспектрофлуориметра осуществлялась мотором 2 типа РД-0,9, на валу которого были закреплены контакты метчика длин волн.

Электронная схема микроспектрофлуориметра была построена также по принципу максимального использования доступных стандартных приборов. Регистрация спектров люминесценции производилась фотоумножителем 31 типа ФЭУ-51, питающимся от стабилизированного источника напряжения 30 типа ВС-22. Сигнал с сопротивления нагрузки ФЭУ подавался на вход рН-метра 32 типа ЛПУ-01, используемого в режиме высокоомного нульиндикатора, на выходные клеммы которого подключался электронный самопишущий милливольтметр 33 типа ЭПП-09 (КСП-4). Таким образом, в этой системе регистрации рН-метр ЛПУ-01 играет роль буферного каскада для согласования высокого выходного сопротивления фотоумножителя с низким входным сопротивлением самописца.

Поступающий на вход ЛПУ-01 сигнал постоянного тока с выходного сопротивления ФЭУ модулируется вибропреобразователем, и дальнейшее усиление его по мощности осуществляется усилителями переменного тока, лишенными такой неприятной особенности, как дрейф нуля. Регистрирующая система на базе ЛПУ-01 работает исключительно стабильно и надежно. Компенсация темнового тока ФЭУ осуществляется ручкой «настройка но буферному раствору» на лицевой панели прибора после предварительной установки пределов компенсации ручкой «рН» под откидной крышкой на боковой панели прибора. Ручка «крутизна» может быть использована для регулировки усиления сигнала после предварительной калибровки ее положения, однако более удобно изменять чувствительность, используя набор калиброванных сопротивлений нагрузки ФЭУ при установленной в крайнее по часовой стрелке положение ручки «крутизна» на лицевой панели ЛПУ-01. Одна из выходных клемм ЛПУ-01, к которым подключается самописец 33, периодически замыкается на землю контактами метчика длин волн. Ртутная дуговая лампа 25 типа ДРШ-250 питается постоянным током от выпрямителя 28 типа ВСА-III через реостат 26 (R =30 Ω). На выходе выпрямителя включен электролитический конденсатор 27 емкостью 800 мкФ на рабочее напряжение 300 В для сглаживания пульсаций напряжения.

Существенным элементом схемы является электронный стабилизатор сетевого напряжения 29 типа St = 2000 (Tesla), от которого питаются все элементы электронной схемы микроспектрофлуориметра. Применение этого стабилизатора позволяет снизить, по крайней мере, на порядок пульсации светового потока ртутной лампы без использования сложных систем стабилизации светового потока.

Ценным качеством описанной выше базовой модели является простота ее изготовления из узлов по сути дела снятых с вооружения современных лабораторий оптических приборов. Обладая высокой чувствительностью, эта модель микроспектрофлуориметра может быть использована для

исследования спектров люминесценции клеток в области 500—700 нм без коррекции регистрируемой кривой на спектральную чувствительность установки.

Основным недостатком модели являлся завал спектральной характеристики в области от 400 до 500 нм, определяемый спектральной характеристикой стандартной «желтой» интерференционной светоделительной пластинки 12 опак-иллюминатора ОИ-17, использованного в описанном микроспектрофлуориметре. По спектру отражения (под углом 90°) и обратному ему спектру пропускания «желтой» пластинки (рис. 1.2, 1) можно видеть, что она хорошо отражает излучение в области 380—460 нм, используемое для возбуждения люминесценции, и пропускает с малыми искажениями свет люминесценции объекта в области >530 нм. Пластинками такого типа комплектуется большинство отечественных люминесцентных микроскопов (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3) и осветителей (ОИ-17, ОСЛ-1, ОИ-30).

Расширить спектральный диапазон микроспектрофлуориметра можно, заменив эту пластинку на «синюю» светоделительную пластинку, спектральная характеристика которой приведена на рис. 1.2, 2 [169]. Для возбуждения люминесценции будут использоваться только лучи УФ-области спектра в диапазоне от 300 до 400 нм.

При этом спектральный диапазон микроспектрофлуориметра, в котором можно регистрировать спектры люминесценции объекта практически без коррекции их на спектральную чувствительность прибора, увеличивается от 420 до 700 нм. Приведенные на рис. 1.3 спектры люминесценции стандартных образцов стекол ЖС-19 (1, 2) и БС-10 (3, 4), полученные на микроспектрофлуориметре с «синей» пластинкой, незначительно отличаются от паспортных характеристик этих образцов [361].

Рис. 1.2. Спектральные характеристики «желтой» (1) и «синей» (2) светоделительных пластинок. По оси абсцисс – длина волны в нм; по оси ординат справа – пропускание в %, слева – оптическая плотность.

Рис. 1.3. Спектры люминесценции стандартных образцов стекол ЖС-19 (1, 2) и БС-10 (3, 4). 1, 3 – спектры, полученные на микроспектрофлуориметре; 2, 4 – паспортные характеристики.

В ряде случаев бывает необходимо использовать для возбуждения люминесценции излучение сине-фиолетовой области спектра (400—460 нм). В этом случае «желтая» пластинка вновь становится необходимой. Поэтому желательно иметь в составе микроспектрофлуориметра обе светоделительные пластинки. Наиболее удобно использовать с этой целью вместо опакиллюминатора ОИ-17 узел сменных светоделительных пластинок от люминесцентного осветителя типа ОИ-30 с контактными объективами [21], предварительно заменив в этом узле нейтральную полупрозрачную светоделительную пластинку на «синюю» пластинку с интерференционным покрытием. Это тем более возможно, что контактные объективы, входящие в комплект осветителя ОИ-30, необходимо иметь в составе микроспектрофлуориметра не только для исследования подвижных клеток и тканей, таких, например, как мышечные, но и для работы с суспензиями клеток или органелл. В этом случае преимущества контактного объектива заключаются в том, что его

выступающая фронтальная линза погружается в кювету с суспензией на фиксированную глубину и изменение высоты поверхности жидкости при добавлении в кювету субстратов, ингибиторов или иных агентов не влияет на величину регистрируемого сигнала.

Приведенные на рис. 1.3 спектры имеют линейную развертку по шкале длин волн. Это достигается применением профилированного кулачка (рис. 1.1, узел 2), компенсирующего нелинейность дисперсии призменного спектрографа ИСП-51.

Приведенный на рис. 1.1 одноканальный самописец ЭПП-09 (КПС-4), несмотря на свою широкую распространенность, неудобен в работе, так как регистрируемые на нем спектры оказываются равномерно распределены по длине диаграммной ленты, что затрудняет их сравнение непосредственно в процессе эксперимента. В этом отношении более удобны двухкоординатные самописцы (например, ПДС-01 или ПДП4-002), ось Х которых питается напряжением с ползунка потенциометра, жестко связанного с валом кулачка развертки спектра. Для питания потенциометра может быть использован любой низковольтный источник стабильного постоянного напряжения. В этом случае семейство спектров люминесценции исследуемого объекта может регистрироваться на одном листе бумаги, что позволяет непосредственно в процессе эксперимента следить за изменением формы спектра.

Продолжая перечисление возможных усовершенствований микроспектрофлуориметра при замене стандартных блоков, входящих в его состав, необходимо особо коснуться источника возбуждающего люминесценцию излучения - дуговой ртутной лампы типа ДРШ-250. Стабильность этого источника может быть резко повышена.

Примером газоразрядных дуговых ламп с ртутным (см. Приложение 4) и ксеноновым (см Приложение 5) наполнением, отличающихся высокой стабильностью положения излучающего плазменного шнура, является ртутная дуговая лампа типа ДРШ-250-2 [362], уровень собственных шумов которой не превышает 0,02% в полосе 1 Гц - 10 кГц [363]. Однако столь высокая стабильность может быть реализована только при питании этой лампы от стабилизированного источника тока.

Ввиду большой перспективности применения подобного типа источников излучения в микроспектрофлуориметрах представляется полезным привести здесь схему (рис. 1.4, а) одного из стабилизированных источников тока [363]. Выпрямитель, выполненный на диодах Д-245 и имеющий на входе автотрансформатор Атр, при положении 1 переключателя П2 нагружен на цепь, состоящую из дуговой лампы Rн и балластного сопротивления Rб == 0,8- 1,5 Ом. Пока лампа не зажжена, напряжение на ней равно напряжению холостого хода выпрямителя, что для лампы типа ДРШ-250-2 должно составлять 80—90 В. Это напряжение достаточно для зажигания лампы при подаче поджигающего импульса.

Рис. 1.4. Схема лабораторного источника питания дуговых ламп (а) и блок-схема источника питания Ип-16 (б).

После поджига лампы и выхода ее в рабочий режим, когда падение напряжения на ней составляет 30-35 В, переключатель П2 переводится в положение 2. При этом вместо балластного сопротивления Rб в цепь лампы включается регулирующий элемент, состоящий из трех параллельно соединенных транзисторов П-210. Обратная связь по току осуществляется напряжением, снимаемым с измерительного сопротивления (Rи=0,6 Ом), включенного последовательно с нагрузкой. Установка тока в цепи лампы осуществляется переменным сопротивлением 2,5 кОм в цепи обратной связи.

Ценной особенностью описанного стабилизатора тока является возможность с помощью автотрансформатора регулировать напряжение на его входе и таким образом изменять напряжение на нагрузке от 0 до 100 В и ток в цепи от 5 до 12,5 А. Это дает возможность не только обеспечивать оптимальный режим питания ртутной дуговой лампы типа ДРШ-250-2, рабочее напряжение которой к концу срока службы увеличивается от 32 до 50 В, но и использовать этот источник как для питания дуговых ламп другого типа (ксеноновых), так и для питания низковольтных галогенных ламп накаливания высокой яркости типа КГМ (см. Приложение 5).

Вкачестве промышленного блока питания высокостабильных дуговых ламп типа ДРШ-250-2

иДКСШ-150, а также галогенных ламп накаливания типа КГМ-10-90 и КГМ-9-75 может быть рекомендован универсальный источник питания ИП-16М, разработанный в СКБ БП АН СССР

(Пущино). Относительно небольшие габариты и высокие качественные показатели этого устройства достигнуты за счет использования двойного импульсного и линейного регулирования.

Упрощенная схема источника питания ИП-16 [364] приведена на рис.1.4, б. Она включает в себя управляемый выпрямитель (Д1-Д5) на тиристорах (импульсный регулятор) и компенсационный транзисторный стабилизатор тока (линейный регулятор). Напряжение с управляемого выпрямителя через фильтр (Др1 и С1) подается в цепь, состоящую из нагрузки Rн коллекторной цепи регулирующего транзистора РТ и эталонного сопротивления R7, падение напряжения на котором сравнивается с опорным напряжением. Разность опорного напряжения на R7 усиливается балансным каскадом УПТ (Т1 и Т2) и воздействует на регулирующий транзистор таким образом, чтобы ток в его коллекторной цепи оставался постоянным.

Источником опорного напряжения служит термокомпенсированный стабилитрон Д818Е, что в сочетании с балансным каскадом УПТ, выполненном на высокочастотных транзисторах, обеспечивает высокую стабильность тока нагрузи.

Напряжение с регулирующего транзистора РТ подается на схему управления [365] тиристорами (Д2 и Д4) выпрямителя, которая, изменяя момент включения тиристоров, поддерживает напряжение на РТ постоянным (4-5 В) при всех изменениях напряжения в сети и на нагрузке. К недостаткам этой схемы авторы относят высокий уровень импульсных наводок, связанных с переключением тиристоров. Однако ввиду малой длительности фронтов влиянием этих наводок в ряде случаев можно пренебречь.

Блочность конструкции, легкость замены узлов дают возможность гибкого использования описанного микроспектрофлуориметра (рис. 1.1) для решения разнообразных задач, связанных не только с изучением спектров люминесции, но и с регистрацией кинетики изменения люминесценции одновременно в нескольких спектральных интервалах.

С этой целью в плоскости фокусировки выходного объектива спектрографа устанавливается 2-3 или более выходных щелей постоянной ширины, вырезающих несколько заранее выбранных участков спектра шириной 10-15 нм.

Прошедшие через эти щели потоки света определенной длины волны направляются на фотокатоды соответствующих фотоумножителей. Фотоумножители, регистрирующие интенсивность люминесценции каждый в своем, определяемом положением щели спектральном интервале, питаются от одного и того же источника высокого напряжения 30, но имеют раздельные каналы усиления - согласования 32 на ЛПУ-01.

Естественно, что в этом случае необходим многоканальный самописец 33. Таким способом можно получать информацию о быстро протекающих в клетке процессах.

Вряде случаев для учета интенсивности поглощения и рассеяния возбуждающего люминесценцию излучения, вместо осветителя с лампой накаливания 19 может быть установлен дополнительный фотоумножитель на УФ-область спектра типа ФЭУ-39 или ФЭУ-71 со своим блоком усилителя-согласователя 32 (ЛПУ-01). С той же целью учета рассеяния препаратом возбуждающего люминесценцию излучения может быть использован один из каналов регистрации в плоскости фокусировки спектра люминесценции.

Вчастности, может быть выбран диапазон длин волн 650-700 нм, в который попадает отраженная объектом красная компонента возбуждающего люминесценцию излучения дуговой лампы 25. Это возможно при условии, что в области 650-700 нм не имеется полос люминесценции объекта, и поэтому при подборе светофильтров 21 можно не полностью блокировать красную компоненту. В более общем случае такой опорный канал регистрации может быть выбран в любой, свободной от полос люминесценции объекта области спектра. Соответственно этому выбирается узкополосный интерференционный светофильтр для осветителя с лампой накаливания 19. В этом случае об изменении оптических характеристик объекта судят по интенсивности проходящего через него светового потока источника 19. Аналогичным образом можно поступать и при регистрации спектров люминесценции. Регистрируемая при этом узкая полоса проходящего светового потока, не затрудняя анализа спектральных характеристик, позволяет следить за изменениями абсорбционных характеристик объекта.

Вкачестве довольно простого, но ценного приспособления необходимо упомянуть также управляемую электромагнитным реле заслонку, устанавливаемую в осветителе 20 на пути возбуждающего люминесценцию излучения. Это дает возможность резко снизить дозу УФоблучения клетки при достаточно длительных измерениях, когда есть опасность, что это облучение внесет заметные изменения в измеряемый параметр люминесценции объекта.

Всущности, описанный микроспектрофлуориметр нельзя назвать прибором. Скорее - это в значительной мере универсальная установка, в состав которой могут входить дополнительные устройства, поставляющие информацию о функциональном состоянии исследуемого объекта, регистрируемую на том же многоканальном самописце синхронно с оптическими характеристиками. Особую важность при этом имеют такие дополнительные параметры, как потребление кислорода, изменение рН, сила натяжения мышцы. В результате установка становится довольно громоздкой, однако в лабораторных условиях это обычно не имеет существенного значения.

Приведенная установка в течение ряда лет успешно использовалась для описанных в предыдущих главах спектральных исследований собственной люминесценции нервных, мышечных и растительных клеток, а также суспензий митохондрий. Она же применялась при изучении биолюминесценции и взаимодействия красителей-меток с органоидами клеток и целыми клетками.

Как видно из рис. 1.1 , особенностью установки является то, что осветитель 20, микроскоп и предметный столик 16 не связаны жестко друг с другом. Это имеет как свои преимущества, так и свои недостатки.

Основным преимуществом такой системы является то, что вокруг предметного столика имеется значительное свободное пространство. Это дает возможность закреплять на предметном столике мелких животных (лягушка [169, 192], крыса [197]) при исследовании их клеток в невыделенном из живого организма виде, т. е. in situ. Известно, что при исследованиях функциональных механизмов живой клетки, т. е., по сути дела, при изучении физиологии клетки, наиболее трудной для экспериментатора задачей является обеспечение ей нормальных условий существования. В случае же исследования клеток in situ вся ответственность за их жизнеобеспечение возлагается на само подопытное животное, и полученные таким образом данные наиболее полно отражают суть протекающих в живой клетке процессов. При исследовании in situ клетки более крупных животных (кролик [198], собака) предметный столик 16 может быть временно удалён из установки.

Недостатки такой системы очевидны. Это, прежде всего, ее малая жесткость. В результате проведение морфологических исследований при больших увеличениях затруднено. Отсутствие фотоаппарата также несколько снижает универсальность.

П1.2. Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований на базе стандартных узлов

Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований на базе стандартных узлов. Отмеченные выше недостатки предыдущей системы во многом устранены в установке, представляющей собой модификацию базовой модели. Ее основным отличием является то, что вместо отдельных узлов осветителя, микроскопа и предметного столика (рис. 1.5), использован люминесцентный микроскоп МЛ-3 [21]. При этом микроскоп МЛ-3 подвергся следующим конструктивным изменениям.

1.Плоская станина заменена полым прямоугольным основанием, в котором размещена кварцевая поворотная призма 8, позволяющая либо освещать препарат снизу проходящими лучами источника света с лампой накаливания 9, либо направлять прошедшее через микрообъект возбуждающее люминесценцию излучение источника света (ДРШ-250) на фотоумножитель (ФЭУ-4) для регистрации его интенсивности.

2.Единственная «желтая» светоделительная интерференционная пластинка заменена блоком из двух сменных пластинок - «желтой» и «синей» (см. рис. 1.2). Это позволяет выбирать наиболее оптимальные условия возбуждения и регистрации спектров люминесценции объекта. [В новых выпускаемых ЛОМО микроскопах серии ЛЮМАМ установлены сменные светоделительные пластинки].

3.В корпусе микроскопа в районе размещения жидкостного теплофильтра выфрезеровано отверстие и закреплена обойма. Это позволяет на место теплофильтра устанавливать зеркало 3 под углом 45° к оптической оси осветительного устройства. Помещаемая в обойму оптическая система сопрягает с микроскопом выходную щель монохроматора 26 и дает возможность использовать для возбуждения люминесценции монохроматическое излучение от ксеноновой дуговой лампы 27 мощностью 500 В, питаемой стабилизированным источником тока 29 (рис. 1.5).

4.К изменениям микроскопа можно отнести также сменный сканирующий предметный столик. Он представляет собой стандартный предметный столик микроскопа МЛ-3, на котором жестко закреплены синхронный двигатель и коробка скоростей, приводящие в движение винт

поперечной подачи. Полное перемещение поперечной подачи соответствует одному обороту прецизионного потенциометра, сигнал с которого подается на ось Х двухкоординатного самописца 22 (рис. 1.5). Это позволяет исследовать распределение интенсивности люминесценции вдоль выбранного направления микрообъекта, а также изучать микротонкослойные хроматограммы и электрофореграммы в отраженном и проходящем свете, а также в свете люминесценции [366].

При проведении этих исследований сканирующий предметный столик устанавливается взамен стандартного предметного столика МЛ-3 и многожильный кабель управления разъемом соединяют с системой управления и регистрации.

В остальном эта система (рис. 1.5) по конструкции и применению аналогична предыдущей

(рис. 1.1).

Рис. 1.5. Блок-схема универсального микроспектрофлуориметра для морфологических исследований.

1	– дуговая ртутная лампа ДРШ-	9 – лампа накаливания;		25	– 6-канальный самописец;
	250-2;	10, 19, 20, 21 – фотоумножители;		26	– монохроматор возбуждения;
2, 17 – линзы;		11	– запирающий светофильтр;	27	– ксеноновая дуговая лампа;
3, 14, 16 – зеркала;		12	– сферическое зеркало с	28	– стабилизатор сетевого
4	– блок сменных		отверстием 13;		напряжения;
	светоделительных пластинок;	15	– окуляр;	29, 30 – стабилизированные источники
5	– микрообъектив;	18	– монохроматор;		питания дуговых ламп;
6	– предметный столик;	22	– двухкоординатный самописец;	31	– источник питания ФЭУ.
7	– конденсор;	23	– кулачок;
8	– призма;	24	– реохорд;

Использование жесткой системы микроскопа МЛ-3 совместно с зондовой системой ФМЭЛ-2 дает возможность уверенно регистрировать спектры люминесценции участков клетки диаметром до 1 мкм.

П1.3. Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр

Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр [367]. Обе описанные выше установки для микроспектрального люминесцентного анализа клеток обладают большим весом и довольно громоздки. В лабораторных условиях эти обстоятельства не играют существенной роли. В то же время необходимость поисков объектов исследований, наиболее удобных для решения проблемы, требует зачастую проведения экспедиционных работ. Особенно важным это бывает при изучении молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки. В этих условиях

компактность прибора, его малый вес и габариты, а следовательно, транспортабельность приобретают существенное значение.

Блок-схема малогабаритного микроспектрофлуориметра приведена на рис. 1.6. Этот прибор представляет собой дальнейшую модификацию базовой модели (рис. 1.1). Основное отличие заключается, прежде всего, в применении инвертированной схемы наблюдения и регистрации люминесценции. Это создает большие удобства при исследовании люминесценции и биолюминесценции клеток мелких морских животных, которых можно в специальной кювете поместить на предметный столик 20, отпрепарировать с помощью бинокулярной лупы 22 и, разместив в поле зрения объектива 19 микроспектрофлуориметра необходимый участок клетки, приступить к его спектральным исследованиям.

Рис. 1.6. Блок-схема инвертированного микроспектрофлуориметра.

		12	– полевая диафрагма;	26	– электролитический
1	– призменный монохроматор;	14	– апертурная диафрагма;		конденсатор фильтра;
2	– кулачок разверстки спектра;	15	– светофильтры;	27	– блок питания дуговой лампы4
3	– призма;	16	– жидкостный фильтр;	28	– электронный стабилизатор
4	– окуляр;	17	– коллектор;		сетевого напряжения;
5	– поворотная призма;	18	– источник света;	29	– блок питания дуговой лампы;
6	– щелевая диафрагма;	19	– микрообъектив;	30	– ЛПУ-0,1;
7	– зеркало;	20	– предметный столик с	31	– двухкоординатный самописец;
8	– окуляр;		препаратом;	32	– зеркало;
9	– сменная интерференционная	21-23 - бинокулярная лупа;		33	– выходная щель
	светоделительная пластинка;	24	– проекционная система		монохроматора;
10 – запирающий светофильтр;			осветителя (11 - 17);	34, 35 – компенсация темнового
11, 13 – линзы;		25	– реостат;	36	тока ФЭУ;
					– ФЭУ.

Остальные изменения по сравнению с базовой моделью (рис. 1.1) носят непринципиальный конструктивный характер и направлены на увеличение компактности системы. Основу прибора составляют люминесцентный микроскоп МЛ-3 и монохроматор УМ-2. От микроскопа МЛ-3 используется оптическая система 24 проекции возбуждающего люминесценцию излучения ртутной дуговой лампы 18 типа ДРШ-250 с модифицированным кожухом, а также револьвер объективов 19,

узел светоделительной пластинки 9 и узел визуального наблюдения 7, 8. При этом ввиду необходимости оснащения микроспектрофлуориметра дополнительной «синей» светоделительной пластинкой в стандартном корпусе узла 9 вырезается сквозное фигурное отверстие, в котором на салазках типа «ласточкин хвост» размещается узел сменных («синей» и «желтой») светоделительных пластинок.

Применение инвертированной схемы потребовало изменения угла наклона тубуса визуального наблюдения 8 относительно оптической оси и соответственно изменения угла наклона зеркала в корпусе блока 7. В плоскости люминесцентного изображения объекта 21 установлена оптическая щель 6 с изменяемыми как по высоте, так и по ширине размерами. Она является одновременно как диафрагмой, выделяющей необходимый для исследования участок микрообъекта, визуально наблюдаемый через тубус 4 при вдвинутой в ход лучей призме 3, так и входной щелью монохроматора 1 типа УМ-2.

Для уменьшения габаритов монохроматора в его схему дополнительно введены поворотные призмы 5 и 32. При выведении призмы 5 из хода лучей световой поток поворотным зеркалом направляется на пленку фотоаппарата, закрепляемого на тубусе для фотографирования выделенного щелью 6 исследуемого участка микрообъекта.

Изображение спектра люминесценции объекта фокусируется в плоскость выходной щели 33, непосредственно за которой расположен фотокатод фотоумножителя 36 типа ФЭУ-51. При изменении угла поворота призмы монохроматора с помощью профилированного для линеаризации спектра кулачка 2, закрепленного на оси коробки скоростей развертки спектра, изображение спектра сканируется в плоскости выходной щели 33 и регистрируется фотоумножителем 36. Сигнал с выходного сопротивления фотоумножителя 33 через рН-метр 30 типа ЛПУ-01, включенный по описанной выше схеме, регистрируется по оси Y двухкоординатного самописца 31, по оси Х регистрируется сигнал угла поворота призмы (длина волны), снимаемый с прецизионного потенциометра, закрепленного на одном валу с кулачком развертки спектра 2. Таким образом, самописец регистрирует спектр люминесценции исследуемого участка микрообъекта.

В состав электрической схемы микроспектрофлуориметра входят также: электронный стабилизатор сетевого напряжения 28 типа St—200 (Tesla), стабилизированные источники высокого 29 (типа ВС-22) и низкого 27 напряжения, питающие фотоумножитель 36 и ртутную дуговую лампу 18 соответственно.

Следует отметить, что при необходимости дальнейшего уменьшения габаритов и веса микроспектрофлуориметра ряд стандартных узлов его электрической схемы (блоки 27, 28, 29, 30) может быть заменен на более экономичные и малогабаритные устройства собственного изготовления. Некоторые из примеров узлов такого типа описаны ниже.

П1.4. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны

Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны [368]. Дальнейшее уменьшение габаритов и веса микроспектрофлуориметра возможно при замене диспергирующего элемента призменного типа на интерференционный фильтр переменной длины волны. Такого типа микрофлуориметры использовали в биологических исследованиях [196, 369, 370]. Отличительной особенностью их является исключительная простота, и потому они заслуживают подробного описания.

Принципиальная схема одной из модификаций микроспектрофлуориметра с интерференционным светофильтром переменной длины волны приведена на рис. 1.7. В основу прибора положен люминесцентный микроскоп типа МЛД (МЛ-3) с некоторыми конструктивными изменениями. Первым из них является уже описанная выше замена единственной «желтой» светоделительной пластинки на узел 9 сменных («желтой» и «синей») пластинок. Второе изменение в конструкции микроскопа заключается в установке на его станину системы развертки спектра, состоящей из электродвигателя 30, коробки скоростей 29 и конической передачи 28 с гибкими валиками привода.

Таким образом, люминесцентный микроскоп работает в обычном стандартном режиме и позволяет наблюдать люминесценцию объекта 11 через окуляр 14 при введенном в ход лучей зеркале 13. При выведении зеркала 13 из хода лучей люминесцентное изображение микрообъекта проецируется в плоскость щелевой диафрагмы 16, ограничивающей размеры подлежащего исследованию участка микрообъекта 11. При введенной в ход лучей поворотной призме 17 изображение объекта и щель 16 рассматриваются с помощью окуляра 18, и изменением горизонтального и вертикального размера щели 16 окончательно устанавливаются размеры исследуемого участка. Перед щелевой диафрагмой 16 на пути светового потока, создающего

люминесцентное изображение микрообъекта, в специальном кожухе установлен линейный интерференционный светофильтр 15 переменной длины волны. Спектральная характеристика использованного в данном приборе интерференционного светофильтра переменной длины волны приведена на рис. 1.8 в виде кривой 1, огибающей зарегистрированные на спектрофотометре «Shimadzu МРS-50 L» спектры пропускания участков шириной 1 мм, выбираемых вдоль по пластине фильтра.

В пределах от 400 до 700 нм фильтр обладает удовлетворительной по своей линейности характеристикой (рис. 1.8, 1) и пропускает 40% падающего на него света. При этом ширина выделяемого спектрального диапазона составляет на полувысоте 16 нм на 1 мм длины фильтра (рис. 1.8, 2).

Следует особенно отметить наличие вторых гармоник фильтра. Это выражается в том, что, например, при установке линейки фильтра в синей области в спектре его пропускания помимо полосы с максимумом 390 нм (рис. 1.8, 3) имеется дополнительная (и довольно интенсивная) полоса пропускания в красной (720 нм) области спектра (рис. 1.8, 3'). Соответствующие вторые гармоники имеются и у других полос пропускания. Например, полоса пропускания 400 нм (рис. 1.8, 4) имеет вторую гармонику с максимумом 750-760 нм (рис. 1.8, 4'). Такая особенность линейного фильтра переменной длины волны может привести к грубым ошибкам, если не принять соответствующих мер по полному устранению красной компоненты из возбуждающего люминесценцию излучения ртутной дуговой лампы 1 (рис. 1.7). Это обстоятельство вызывает необходимость тщательного контроля при настройке микроспектрофлуориметра.

Рис. 1.7. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны.

источник света;	– запирающие светофильтры;	– блок питания ФЭУ;
коллектор;	– зеркало;	– электронный стабилизатор сетевого
жидкостный фильтр;	– окуляр;	напряжения;
светофильтры;	– интерференционный светофильтр	– блок питания источника света;
апертурная диафрагма;	переменной длины волны;	– проекционная система (2-8);
линза;	– щелевая диафрагма;	– реечная передача;
полевая диафрагма;	– поворотная призма;	– реохорд;
линза;	– окуляр;	– коническая передача;
– сменная светоделительная	– фотоумножитель;	– коробка скоростей;
пластинка;	– усилитель ЛПУ-0,1;	– двигатель СД-0,9.
– микрообъектив;	– двухкоординатный самописец;
– предметный столик с
препаратом;

Рис. 1.8. Спектральные характеристики интерференционного фильтра переменной длины волны. По оси ординат – пропускание в %; по оси абсцисс – длина волны в нм.

Таким образом, в описываемом устройстве анализ спектра люминесценции объекта производится путем перемещения светофильтра переменной длины волны системой развертки спектра (30, 29, 28) перед щелевой диафрагмой 16. При выведенной из хода лучей поворотной призме 17 пропущенный светофильтром 15 свет люминесценции микрообъекта попадает на фотокатод фотоумножителя 19 типа ФЭУ-51 и через усилитель-согласователь 20 (может быть использован рНметр ЛПУ-01) подается на ось Y двухкоординатного самописца 21, на ось Х которого снимается напряжение с линейного потенциометра, пропорциональное длине перемещения светофильтра 15, т. е. длине волны пропускания. В результате двухкоординатный самописец 21 регистрирует спектр люминесценции исследуемого участка микрообъекта 11.

В качестве высоковольтного источника 22 питания ФЭУ может быть использован стабилизированный выпрямитель ВС-22, в то время как для питания дуговой ртутной лампы 1 применяется сильноточный источник низкого напряжения 24. Вся электрическая схема прибора подключается к сети через электронный стабилизатор сетевого напряжения 23 типа St-2000. Таким образом, может быть использована электрическая система питания и регистрации, применявшаяся в описанных выше микроспектрофлуориметрах.

При необходимости дальнейшего уменьшения габаритов и веса прибора усилительсогласователь 20 типа ЛПУ-01 может быть заменен малогабаритным усилителем на полевых транзисторах, монтируемым непосредственно в кожухе делителя напряжения ФЭУ. Такого типа усилители постоянного тока могут быть собраны по различным схемам. Возможные варианты представлены на рис. 1.9 и 1.10.

Рис. 1.9. Принципиальная схема усилителя с высоким входным сопротивлением.

Рис. 1.10. Принципиальная схема усилителя с полевым транзистором на входе.

Усилитель постоянного тока (рис. 1.9) представляет собой усилитель с обратной связью, выполненной на микросхеме К284 УД1В с высоким входным сопротивлением. Резисторы R12-R14 служат для установки нуля на выходе усилителя при отсутствии сигнала на входе. На выходе усилителя включен делитель напряжения R17-R23, позволяющий ступенчато изменять глубину обратной связи и тем самым - коэффициент усиления сигнала.

Аналогичный описанному выше усилитель может быть выполнен на основе интегральной микросхемы операционного усилителя К1УТ401А (рис. 1.10). Входной каскад, собранный на униполярном полевом транзисторе КП1ОЗА по схеме истокового повторителя, служит для

повышения входного сопротивления устройства. Делитель R2-R4 создает необходимое смещение на одном из входов (10) операционного усилителя, на второй вход которого подается сигнал с нагрузки истокового повторителя R1). Цепочка R5С1 введена для предотвращения самовозбуждения усилителя на высоких частотах. С выхода усилителя напряжение обратной связи подается через сопротивление R7 на затвор истокового повторителя. Применение двух независимых источников питания позволяет существенно снизить дрейф нуля усилителя.

Полное устранение дрейфа нуля возможно, по-видимому, только при переходе на усиление по переменному току. При этом модуляцию сигнала можно производить различными способами: периодически прерывая световой поток, модулируя ток ФЭУ или используя вибропреобразователь для модуляции выходного тока ФЭУ, как это и осуществляется при использовании ЛПУ-01 в качестве согласующего усилителя. Помимо этих способов для модуляции выходного сигнала ФЭУ может быть использован транзисторный прерыватель [371].

Для дальнейшего уменьшения габаритов и веса установки возможна также замена источника 22 высоковольтного питания ФЭУ малогабаритным и экономичным блоком преобразователя, одна из схем которого приведена на рис. 1.11.

Особенностью всех описанных выше микроспектрофлуориметров является применение механической щелевой диафрагмы 16 (рис. 1.7) в плоскости люминесцентного изображения микрообъекта. Единственным критерием выбора этой системы явилась возможность самостоятельного изготовления ее в любой механической мастерской, хотя зондовая система с диафрагмой, представляющей собой свободный от отражающего покрытия участок сферического зеркала, типа применяемой в микроскопах МУФ-5 и МУФ-6 [21], несомненно, более удобна в работе. В этом случае исследователь имеет возможность рассматривать при поиске необходимого участка микрообъекта все поле зрения. Сейчас, когда налажен серийный выпуск фотоэлектрических насадок типа ФМЭ-1 и ФМЭЛ-1 [21], представляется возможным применить эту систему при изготовлении микроспектрофлуориметров.

Рис. 1.11. Принципиальная схема высоковольтного преобразователя напряжения для питания ФЭУ.

Одним из примеров может служить модификация описанного выше экспедиционного микроспектрофлуориметра (рис. 1.7), в которой механическая щелевая диафрагма 16 заменена зондовой системой 18 фотоэлектрической насадки типа ФМЭЛ-1. Тогда все устройство остается неизменным, но становится более удобным в работе. Конечно, узел визуального наблюдения (см. рис. 1.7, 13, 14) является излишним и может быть удален (вместе с согласующей линзой ФМЭЛ-1) из состава микроскопа МЛД (МЛ-3). Однако, имея в виду возможность фотографирования объекта при снятой зондовой системе, этот узел может быть и сохранен.

В описании экспедиционного микроспектрофлуориметра необходимо отметить возможность использования при работе с ним унифицированного сканирующего предметного столика. Эксплуатация этого прибора в экспедиционных установках показала его высокую надежность. Сборка и надстройка системы после транспортировки до места назначения производится за 1-2 ч.

П1.5. Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией

Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией. Рассматривая описание различных конструкций микроспектрофлуориметров, уместно уделить некоторое внимание одной интересной системе бесщелевого малогабаритного микроспектрофлуориметра. Его оптическая схема приведена на рис. 1.12. Источник света 1 освещает коллекторную линзу 2. Ограниченный щелевой диафрагмой 3 равномерно светящийся участок линзы 2 проектируется микрообъективом 6 в

плоскость микрообъекта 7 с помощью интерференционной светоделителъной пластинки 5. Введенный в ход лучей светофильтр 4 выделяет требуемую для возбуждения люминесценции линию излучения ртутной лампы 1. Таким образом, люминесцирующий участок имеет щелевидную форму.

Рис. 1.12. Схема бесщелевого микрофлуориметра с фоторегистрацией.

1 – ртутная дуговая лампа;

2 – коллектор;

3 – щелевая диафрагма;

4 – светофильтр;

5 – интерференционная светоделительная пластинка;

6 – микрообъектив;

7 – препарат;

8 – запирающий светофильтр;

9 – отражательная реплика дифракционной решетки;

10 – фотопленка;

11 – зеркало;

12 – окуляр;

13 – поворотная призма;

14 – визирная трубка.

Микрообъектив 6 собирает свет люминесценции щелевого участка микрообъекта 7, и с помощью плоской дифракционой решетки 9 в нулевом порядке создается увеличенное изображение щелевидной области микрообъекта 7 в свете его люминесценции. В другом участке плоскости 10 в первом порядке дифракционной решетки 9 получается спектральное разложение света люминесценции этой же области микрообъекта.

В составе попадающего на решетку 9 светового пучка имеется также частично прошедшая через запирающий светофильтр 8 возбуждающая люминесценцию линия излучения дуговой лампы 1, отраженная от покровного стекла микрообъекта 7. Изображение этой линии в спектре первого порядка дифракционной решетки может быть использовано в качестве реперной точки при последующей обработке фотопленки на микрофотометре с целью получения спектра люминесценции объекта в графической форме.

Для предварительного просмотра микрообъекта 7 и выбора подлежащего спектральному исследованию участка его в ход лучей нулевого порядка микрообъектива 6 и дифракционной решетки 9 вводится зеркало 11, направляющее световой поток в плоскость полевой диафрагмы окуляра 12. Полученное в этой плоскости изображение визуально просматривается с помощью визирной трубки 14 и поворотной призмы 13. Система описанного типа может найти применение в полевых условиях.

П1.6. Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр

Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр [372, 373]. Хотя, строго говоря, этот прибор не предназначен для исследования микропрепаратов, его следует упомянуть здесь, так как в конструкции этого спектрофлуориметра заложена идея бесщелевого микроспектрофлуориметра. Важнейшая задача, которую необходимо решить в первую очередь при разработке приборов для спектрального анализа сверхслабого свечения тканей, заключается в создании оптической системы с максимально возможным светосбором. При люминесцентных исследованиях одиночных клеток эта задача решается достаточно просто путем применения высокоапертурных микрообъективов.

Однако увеличение яркости объекта по мере увеличения апертуры микрообъективов сопровождается уменьшением поля зрения. Таким образом, выигрывая в яркости, можно проиграть в общей интенсивности светового излучения за счет уменьшения массы (объема) излучающего материала.

Сцелью в той или иной мере обойти возникающие противоречия была разработана оптическая система, сочетающая в себе высокую апертуру микрообъектива и относительно большое поле зрения (рис. 1.13, 2, 3). Все элементы этой системы выполнены в виде отражающих зеркальных поверхностей, что дает возможность использовать ее в диапазоне от ультрафиолетовой до инфракрасной области спектра.

Излучающий объект 1 помещен в фокусе объектива, состоящего из собирающего вогнутого сферического зеркала 2 и формирующего параллельный пучок выпуклого зеркала 3. Сформированное в виде параллельного пучка излучение объекта 1 попадает непосредственно на дифракционную решетку 4 и с помощью плоского зеркала 5 направляется на выходное сферическое зеркало 6, в плоскости фокусировки которого размещена выходная щель 7. За выходной щелью 7 установлен фотоумножитель 8, регистрирующий спектр излучения.

Сцелью сравнения спектров сверхслабого хеми- и биолюминесцентного излучения объекта 1 со спектрами собственной фотолюминесценции этого же объекта в описываемое устройство введена

дополнительно система возбуждения фотолюминесценции, содержащая в своем составе дуговую лампу 9, линзу 10 и светоделительную пластинку с интерференционным покрытием 11.

Рис. 1.13. Схема высокоапертурного бесщелевого спектрофлуориметра.

1 – объект исследования; 2, 3 – зеркальный светосильный объектив; 4 – дифракционная решетка; 5 – плоское зеркало; 6 – сферическое зеркало;

7 – выходная щель монохроматора;

8 – ФЭУ;

9 – дуговая лампа;

10 – конденсор;

11 – светоделительная пластинка;

12 – контротражатель.

Эффективное относительное отверстие светоотбирающей системы равно примерно 1:0,6. Светосила прибора может быть повышена за счет использования контротражателя 12.

П1.7. Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток

Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток [376]. Описывая фотоиндуцированное излучение микрообъекта, обычно приходится определять его как люминесценцию, не уточняя, идет ли речь о флуоресценции или о фосфоресценции. Причиной этого является в основном отсутствие приборов, необходимых для определения типа наблюдаемой люминесценции. В то же время этот вопрос в ряде случаев приобретает принципиальное значение, так как триплетные состояния возбужденных хромофоров, при дезактивации которых возникает фосфоресценция, могут играть значительную роль в таких важных внутриклеточных процессах, как, например, зрение и фотосинтез. Более того, иногда оказывается важным точно знать, из какого возбужденного состояния - синглетного (флуоресценция) или триплетного (фосфоресценция) - происходит излучение красителя-метки, связанного с объектом исследования. В связи с этим были предприняты успешные попытки создания ряда приборов для изучения фосфоресценции микрообъектов [374—379]. Одну из этих установок [376], по-видимому, наиболее удачную, целесообразно рассмотреть подробнее.

Оптическая схема установки приведена на рис. 1.14. В качестве источника возбуждающего излучения 1 использована ртутная дуговая лампа типа ДРШ-100-2, помещенная в фокусе кварцевого конденсора 2. Изображение светящегося тела лампы переносится коллектором 4 в плоскость апертурной диафрагмы 5, которая коллектором 6 изображается в плоскости входного зрачка микрообъектива 9. Плоские зеркала 3 и 7 и сменная интерференционная светоделительная пластинка 8 меняют направление светового потока. Три сменных пластинки 8, отличающиеся одна от другой границей между областями пропускания и отражения, закреплены в специальном опакиллюминаторе. Это позволяет выбрать наиболее оптимальные условия возбуждения и регистрации люминесценции объекта.

Плоскость полевой диафрагмы 10 сопряжена оптически с плоскостью объекта 11, что позволяет менять размеры исследуемого участка препарата, изменяя размер полевой диафрагмы. В установке предусмотрена возможность использования охлаждающего столика 12, представляющего собой миниатюрный газовый холодильник [378], работающий на основе эффекта Джоуля-Томпсона. При этом температура исследуемого объекта может поддерживаться в интервале от комнатной до - 192° С.

Для разделения во времени возбуждающего излучения и света фосфоресценции применяется механическая модуляция, осуществляемая сменным диском 16, закрепленным на оси двигателя постоянного тока 17. На разных расстояниях от оси вращения диска расположены две системы вырезов, одна из которых служит для модуляции возбуждающего излучения, в то время как другая - для модуляции света фосфоресценции. При этом соотношение между длительностью возбуждения, длительностью наблюдения и интервалом между ними определяется геометрией диска, а абсолютные значения этих временных интервалов изменяются линейно с изменением числа оборотов диска, которое в данной установке может плавно меняться от 5 до 100 об/с. Специальное стробоскопическое устройство служит для точного определения числа оборотов диска. Модуляция возбуждающего излучения осуществляется в плоскости апертурной диафрагмы 5, а модуляция света фосфоресценции

- в плоскости выходного зрачка микроскопа, расположенного за окуляром 18, т. е. в местах наименьших сечений световых пучков.

Рис. 1.14. Оптическая схема фосфоресцентного микроскопа с одним модулирующим диском

[376].

лампа ДРШ 100-2;	– модулирующий диск;
кварцевый конденсор;	– электродвигатель;
плоское зеркало;	– окуляр;
кварцевый коллектор;	– микрофотонасадка;
апертурная диафрагма;	– откидывающаяся призма;
кварцевая линза;	– входная щель монохроматора;
плоское зеркало;	– вогнутое зеркало;

–интерференционная – выходная щель;

светоделительная пластинка;	–	реплика дифракционной
микрообъектив;	решетки;
– полевая диафрагма;	–	откидывающееся плоское
– объект;	зеркало;
– микрохолодильник;	– фотоумножитель;
– лампа накаливания СЦ-61;	– опорный ФЭУ;
– стеклянный коллектор;	– кварцевая пластинка.

–выдвижное зеркало;

Внаборе имеются специальные диски для исследования флуоресценции. Система модулирующих прорезей в этих дисках такова, что возбуждающее излучение и свет флуоресценции прерываются одновременно и, таким образом, вся установка превращается в обычный микроспектрофлуориметр. Естественно, что при этом в оптическую систему необходимо ввести светофильтры для выделения области возбуждения и запирающий светофильтр.

Исследуемое излучение объекта из окуляра 18 попадает в микрофотонасадку 19 типа МФН-3. Наблюдение объекта в свете фосфоресценции осуществляется с помощью призмы 20. При фотографировании и спектральных исследованиях призма 20 выводится из хода лучей. Для регистрации спектральных характеристик вместо фотоаппарата устанавливается монохроматор с фотоумножителем, как это показано на рис. 1.14. При этом плоскость входной щели 21 монохроматора совпадает с плоскостью изображения объекта. Алюминированное вогнутое зеркало изображает входную щель 21 в плоскости выходной щели 23. Диспергирующим элементом служит реплика дифракционной решетки 24, поворотом которой осуществляется развертка спектра. В случае исследования слабосветящихся объектов перед репликой может быть введено зеркало 25. При этом изображение входной щели 21 совпадает с выходной щелью 23 и регистрируется изменение интенсивности свечения объекта в широком спектральном диапазоне.

Вкачестве, приемника излучения используется фотоумножитель 26 типа ФЭУ-39, питание которого осуществляется высоковольтным источником ВС-22. Регистрирующая часть установки выполнена в нескольких вариантах, соответствующих разным режимам ее работы. В одном варианте сигнал с ФЭУ через усилитель У1-2 подается на самописец, на ленте которого при повороте реплики дифракционной решетки записывается спектр исследуемого свечения. Кривая затухания в этом случае может сниматься или по точкам, или посредством изменения скорости вращения модулирующего диска и применения дисков разной геометрии, или при помощи стробирования [371] ФЭУ в определенный момент времени после окончания возбуждающего импульса. Последняя система позволяет значительно увеличить постоянную времени регистрации и существенно

улучшить соотношение сигнал - шум.

Для быстрой регистрации кривых затухания послесвечений с временем жизни 10-4-10-1с служит система, состоящая из ФЭУ-39, широкополосного усилителя переменного тока типа Ф-73 и осциллографа С1-4 (С1-19). Развертка осциллографа по времени может быть как линейной, так и экспоненциальной.

Опорный сигнал, необходимый для стробирования ФЭУ-39, подается с дополнительного фотоумножителя 27, на который с помощью кварцевой пластинки 28 отражается 5-7% модулированного светового потока, возбуждающего свечение объекта. Этот же сигнал служит для синхронизации экспоненциальной развертки осциллографа при исследовании кривых затухания.

Определенным недостатком этой системы является относительно малое временное разрешение (не более 10-4 с). Существенное повышение временного разрешения вряд ли возможно в

системах с механической модуляцией световых потоков. По-видимому, дальнейшие перспективы в этой области связаны с применением импульсных источников света, в том числе лазерных умножителей частоты, а также различных электрических и магнитных модуляторов световых потоков.

В заключение этого раздела следует отметить, что в зависимости от конкретной задачи исследования схема микроспектрофлуориметра и его устройство могут широко варьировать.

Приложение 2 П2. Микрофлуориметры

Простота изготовления одноканальных микрофлуориметров, позволяющих объективно измерять интенсивность люминесценции в том или ином выделяемом светофильтром участке спектра, привела к довольно широкому распространению их. При этом используются как электронные [380-384], так и фотографические [385-386] системы регистрации.

Однако, учитывая, что промышленностью выпускается удобная в работе фотоэлектрическая насадка типа ФМЭЛ-1, представляющая собой в комплекте с люминесцентным микроскопом, в особенности с такими, как МЛ-4 [21] или «Люмам ИЗ» [387], хороший и надежно работающий микрофлуориметр, нет надобности описывать здесь устройства лабораторного изготовления.

Необходимо только еще раз подчеркнуть изложенные выше соображения о трудностях интерпретации результатов измерения интенсивности одной полосы люминесценции, тем более, что широкий набор входящих в состав ФМЭЛ-1 интерференционных фильтров позволяет проводить измерения последовательно в нескольких участках спектра.

Определенный интерес представляют собой используемые в ряде лабораторий многоканальные микрофлуориметры, позволяющие производить измерения интенсивности люминесценции одновременно в заранее выбранных участках спектра [388-404].

П2.1. Трехканальный микрофлуориметр

Одним из примеров подобного типа устройств является трехканальный микрофлуориметр, блок-схема которого приведена на рис. 2.1. Прибор позволяет одновременно измерять интенсивность люминесценции в синей (420-480 нм), желтой (500-560 нм) и красной (600-750 нм) областях спектра. Здесь светоделительные пластинки (рис. 2.1, 3, 10, 11) использованы не только для отделения света люминесценции от возбуждающего его излучения (3), но и для грубого разделения света люминесценции по трем спектральным областям (10, 11).

Основой прибора является люминесцентный микроскоп МЛ-3, подвергнутый некоторым конструктивным изменениям. С целью построения инвертированной системы произведена перестройка крепления зеркала визуального наблюдения 8. Кроме того, стандартная «желтая» пластинка, которой комплектуется микроскоп МЛ-3, заменена «синей» светоделительной пластинкой

3.

Таким образом, ультрафиолетовое излучение источника 1 типа ДРШ-250, организованное оптической системой осветителя 2 микроскопа МЛ-3, отражается «синей» пластинкой 3 и микрообъективом 4 фокусируется на микрообъект 5, возбуждая его видимую люминесценцию. Свет люминесценции микрообъекта, собранный объективом 4, свободно проходит через «синюю» светоделительную пластинку 3 и запирающий светофильтр 7 типа ЖС-3 и попадает на «желтую» светоделительную пластинку 10.

Как видно из спектральной характеристики, приведенной на рис. 2.2, 1, пластинка 10 отражает лучи синей области спектра, направляя их на фотокатод ФЭУ-51 (1), и пропускает лучи желто-зеленой и красной областей спектра на «красную» светоделительную пластинку 11. Спектральная характеристика пластинки 11 такова, что она отражает лучи желто-зеленой области спектра, направляя ее на фотокатод ФЭУ-51 (2) следующего канала, и пропускает лучи красной области спектра.

Прошедший через «красную» светоделительную пластинку свет люминесценции поворотной призмой 12 направляется на фотокатод ФЭУ-51 третьего канала прибора для регистрации. Для улучшения спектральных характеристик каждого из каналов перед фотокатодами фотоэлектронных умножителей могут быть установлены дополнительные запирающие фильтры.

Подбором этих дополнительных запирающих фильтров и изменением коэффициентов усиления фотоумножителей чувствительность всех трех каналов может быть установлена одинаковой. Визуальное наблюдение объекта в этом приборе осуществляется с помощью окуляра 9 при введении в ход лучей зеркала 8. Полевая диафрагма осветителя 2 используется для ограничения поля зрения и выбора, таким образом, подлежащего исследованию участка изучаемого объекта.

Рис. 2.1. Блок-схема трехканального инвертированного микрофлуориметра.

1 – ртутная дуговая лампа ДРШ-250;

2– проекционная система осветителя микроскопа МЛ-3 (МЛД);

3– интерференционная светоделительная пластинка («синяя»);

4– микрообъектив;

5– препарат;

6– предметный столик;

7– запирающий светофильтр;

8– зеркало;

9– окуляр;

10– интерференционная светоделительная пластинка («желтая»);

11– интерференционная светоделительная пластинка («красная»);

12– поворотная призма;

13, 14, 15 – каналы электронной регистрации.

На рис.2.1 не приводится электрические блоки питания и регистрации. Для этой цели могут быть использованы любые из описанных выше систем, а также специальная система импульсного возбуждения и регистрации люминесценции.

П2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр

Двухканальный импульсный микрофлуориметр [393]. Другим примером построения схемы микрофлуориметра, позволяющей существенно уменьшить ошибки измерения, обусловленные как нестабильностью источника возбуждающего люминесценцию излучения, так и изменением интенсивности и цвета люминесценции объекта за счет фотохимического разрушения флуорохрома, может служить схема, приведенная на рис. 2.2. Прибор собран на основе опытного образца люминесцентного микроскопа «Люмам» (1, 2, 6-10, 17—20, 35-38), выпускаемого ЛОМО.

Одной из отличительных особенностей этого микрофлуориметра является использование импульсной лампы 3 типа ИФТ-200 с непрерывным спектром излучения [394] для возбуждения люминесценции препарата 19. При этом часть (≈7%) возбуждающего люминесценцию излучения, выделяемого светофильтром 8 из общего потока лампы 3 полированной кварцевой пластинкой 11, ответвляется в канал сравнения, состоящий из диафрагмы 12, позволяющей регулировать величину оптического сигнала, оптических элементов 13-15 и фотоумножителя 16 типа ФЭУ-71.

Основной поток возбуждающего излучения, прошедший через пластинку 11, отражается интерференционной светоделительной пластинкой 17 и микрообъективом 18 фокусируется в плоскость препарата 19, возбуждая его люминесценцию. Люминесцентное излучение объекта, собранное микрообъективом 18, проходит через светоделительную пластинку 17, запирающий светофильтр 21 и линзу 23, с помощью интерференционной пластинки 24 создает два изображения объекта (в коротковолновой и длинноволновой) областях спектра люминесценции) в плоскостях диафрагм 25 и 31 соответственно. Изображение в плоскости регулируемой зеркальной диафрагмы 25

может рассматриваться с помощь визирной системы 29, 30. При этом производят совмещение фотометрируемого участка изображения микрообъекта с фотометрическим отверстием диафрагмы 25. Поскольку диафрагма 31 «красного» канала оптически сопряжена с диафрагмой 25, предполагается, что отверстие диафрагмы 31 будет совмещено с тем же участком изображения микрообъекта.

Рис. 2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр [393].

лампа накаливания КГМ-75;	, 28, 34 – ФЭУ;	, 31	– фотометрическая диафрагма;
4, 37 – коллекторы;	, 24 – сменные интерференционные -30		– система для визуального
импульсная лампа ИФТ-200;	светоделители;	наблюдения;
переключающееся зеркало;	– микрообъектив;	– зеленый светофильтр;
9, 14, 26, 32 – линзы;	– препарат;	– лампа накаливания;
апертурная диафрагма;	– фазовоконтрастный конденсор;	, 40	– интегрирующие емкости;
возбуждающий светофильтр;	– система фокусировки для , 42		– переключающиеся контакты.
12 – полевые диафрагмы;	контрастной микроскопии;
– кварцевая пластинка;	– ахроматическая тубусная линза;
35 – зеркала;
21, 27, 33 – запирающие
светофильтры;

Описанная система позволяет проводить два типа измерении. по одноволновому и по двухволновому методам.

Если препарат окрашен монохроматическим красителем, максимум излучения которого лежит, например, в желтой области спектра, то применяется одноволновый метод регистрации с помощью системы 25—28, как это показано на рис. 2.2. Второй измерительный канал 12-16 используется для устранения влияния нестабильности светового потока источника излучения 3. При этом во время импульсной вспышки источника 3 на фотоумножителе 28 регистрируется сигнал, обусловленный люминесценцией фотометрируемого участка объекта 19. Одновременно фотоумножитель 16 регистрирует сигнал, пропорциональный интенсивности возбуждающего люминесценцию излучения источника 3. Каждый из сигналов накапливается на интегрирующих конденсаторах 39 и 40 и усиливается усилителями постоянного тока. Частное от деления рабочего и опорного сигналов регистрируется цифровым вольтметром ВК2-6, перестроенным по схеме деления и показывающим интенсивность люминесценции в относительных единицах. Для измерения двухволновым методом на интегрирующий конденсатор 40, сигнал подается с фотоумножителя 34 «красного» измерительного канала. Цифровой вольтметр при этом показывает отношение интенсивностей люминесценции объекта в «желтой» и «красной» областях спектра, которое также не зависит от изменений интенсивности возбуждающего излучения.

Положительной особенностью прибора является применение цифрового индикатора, что повышает производительность труда при массовых измерениях большого количества препаратов.

Учитывая, что выход цифрового вольтметра может быть непосредственно подключен к перфоратору, можно параллельно фиксировать результаты измерения на перфоленте. Это существенно снижает трудоемкость подготовки материала для обработки на ЭЦВМ (в случае такой необходимости).

В описываемом устройстве для выбора объекта исследования с целью предохранения препарата от фотохимического выцветания может быть применено наблюдение в фазовом контрасте (система 20, 35-38) или в свете люминесценции, возбуждаемой лампой накаливания 1 типа КГМ9-75. В случае использования контактных объективов для фокусировки на разную глубину ткани линза 23 может быть заменена на фокусирующую систему 22.

Проведенные на этом приборе исследования показали, что при изучении окрашенных фиксированных препаратов степень фотохимического выцветания объектов при импульсном освещении такая же, как и при непрерывном, и зависит только от дозы облучения объекта.

П2.3. Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры

Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры [395]. Ввиду того, что при изучении взаимодействия люминесцентных красителей-меток с высокоупорядоченными структурами клеток (например, мышечных) может возникнуть потребность исследования степени поляризации люминесценции красителя, представляется полезным дать краткое описание двух усовершенствованных моделей [395] двухканального поляризационного микрофлуориметра [389]. Оба варианта с фотографической (рис.2.3) и фотоэлектрической (рис.2.4) системами регистрации предназначены для работы в широкой области спектра, включая его ультрафиолетовый диапазон.

Принцип действия прибора с фотографической регистрацией (рис. 2.3) состоит в следующем: на два кадра фотопленки, заряженной в специальную кассету 23, производится одновременное фотографирование исследуемого объекта в лучах люминесценции, прошедших через призмуанализатор 22 и отраженных от ее гипотенузной грани, поляризованных в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Затем с помощью обычной методики фотометрирования фотографических изображений осуществляется измерение плотностей почернения полученных на негативах изображений микроструктур и расчет степени поляризации люминесценции.

Люминесценция объекта возбуждается монохроматическим излучением источника 1, выделяемым с помощью зеркального монохроматора 2-5 с дифракционной решеткой 5, выходной щелью которого является зрачок микрообъектива 8. Поляризованное призмой 6 возбуждающее излучение отражается интерференционной светоделительной пластинкой 7 и фокусируется на объект 9 микрообъективом 8. Для устранения влияния интерференционной пластинки 7 на поляризацию возбуждающего излучения поляризатор 6 ориентируется относительно этой пластинки таким образом, чтобы колебания электрического вектора были ей параллельны. Ошибку, обусловленную влиянием пластинки на поляризацию, можно учесть, предварительно измерив ее действие в рабочей части спектра, либо скомпенсировать с помощью подобной по пропусканию пластинки, устанавливаемой над пластинкой 7 в перпендикулярной ей плоскости [396].

Визуальное наблюдение препарата с целью выбора подлежащей исследованию области его осуществляется с помощью системы 16 или, при работе в ультрафиолетовой области спектра, с помощью телевизионной установки ПТУ-26 на видиконе 20 с кварцевым окном. Прибор позволяет также измерять фотографическим способом величину двойного лучепреломления и дихроизма, для чего применяется освещение проходящим монохроматическим светом через конденсор микроскопа 10 при выведенных запирающем фильтре 21 и интерференционном светоделителе 7. При изменении двулучепреломления анизотропного объекта он устанавливается так, чтобы колебания электрического вектора света составляли с его оптической осью угол 45°. Фотографирование объекта производится в области спектра, не поглощаемой исследуемыми структурами.

Для регистрации дихроизма при выведенном из хода лучей поляризаторе производится фотографирование объекта в лучах выбранной длины волны, находящейся в зоне поглощения исследуемого участка препарата. Измерив на каждом из двух полученных негативов плотности почернения в изображении изучаемой структуры и пустого участка, подсчитывают коэффициенты

поглощения света с колебаниями, параллельными (k║) и перпендикулярными (k ) оптической оси этой структуры. Дихроизм в определенной длине волны определяется по формуле:

Д =( k║— k )/(k║ + k ).

Естественно, что перед фотографированием препарат ориентируется определенным образом относительно анализатора 22.

Отличием фотоэлектрического варианта прибора (рис. 2.4) от описанной выше модели с фотографической регистрацией является замена фотопленки двумя фотоумножителями 22 и 23. Отсутствует здесь также телевизионная система наблюдения в ультрафиолете, а оптическая система визуальной настройки 15-20 построена по зондовой схеме. В то же время в схему введена дополнительная система 24-27 возбуждения люминесценции объекта от источника 27. При этом интерференционная светоделительная пластинка 24 служит дополнительно для компенсации влияния пластинки 5 на поляризацию люминесценции объекта 7.

Рис. 2.3. Принципиальная оптическая схема фотографического варианта двухканального микрофлуориметра [395].

1

– источник света (лампа

7

– сменные интерференционные

17

– фотозатвор;

ДРШ-250-2);

светоделители;

18

– окуляр микроскопа;

2

– коллектор;

8

– микрообъектив;

20

– видикон;

3

–

входная

щель

9

– препарат;

21

–

запирающие

сменные

монохроматора;

10

– конденсор;

светофильтры;

4

– вогнутое зеркало;

11

– апертурная диафрагма;

22

– сменные интерференционные

5

– плоская дифракционная

12,

19

– переключающиеся

анализаторы для Уф и видимой

решетка;

алюмированные зеркала;

области спектра;

6,

6’

–

сменные

13, 15 – алюмированные зеркала;

23

– фотокассета.

интерференционные

14

– линза;

поляризаторы для УФ и

16

–

система

визуального

видимой

области

наблюдения;

спектра;

Имеются отличия и в системе измерения дихроизма. Под конденсором микроскопа располагается кристалл исландского шпата 14 с точечной диафрагмой 13, которая раздваивается этим кристаллом. Два изображения диафрагмы с помощью коденсора проецируются в плоскость анизотропного объекта, который устанавливается с помощью препаратоводителя так, чтобы одно изображение диафрагмы попало на исследуемый участок клетки, другое - на пустой участок препарата. Каждый из сигналов регистрируется своим ФЭУ (22, 23) при выведенном зеркале 15. Электронная система регистрации вычисляет отношение этих сигналов, фиксируемое на самописце, проградуированном для этой цели в значениях оптической плотности, т.е. измеряется коэффициент поглощения анизотропным объектом составляющей светового потока с колебаниями, параллельными оси объекта (k║). Затем объект перемещают так, чтобы оба изображения диафрагмы 13 в плоскости

препарата поменялись местами, и производят измерение k . Дихроизм определяется по приведенной выше формуле.

Рис. 2.4. Принципиальная схема фотоэлектрического варианта двухканального поляризационного микрофлуориметра [395].

1	– источник света;				9, 11, 12 – алюмированные		21	– сменные анализаторы;
2	– коллектор;				зеркала;		22, 23 – ФЭУ;
3	– двойной монохроматор;				10	– линза;	24	–	интерференционный
4	– сменные поляризаторы;				13	– точечная диафрагма;	светоделитель;
5		–	сменные		14	– кристалл испанского шпата;	25	– светофильтр;
интерференционные					15	– вогнутое алюмированное	26	– коллектор;
светоделители;					зеркало с отверстием;		27 – источник света;
6	– микрообъектив;				16	– зеркало;	25-27 – осветитель и
7	– препарат;				17, 19 – линзы;		интерференционный светоделитель
8	–	конденсор		или	18	– окуляр;	условно повернуты на 900
микрообъектив;					20	– защитные светофильтры;	относительно оптической оси
							микроскопа.

П2.4. Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением

Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением [284]. Основной сферой применения микрофлуориметров будеть являться, по-видимому, комплексный эксперимент, в котором регистрация интенсивности люминесценции объекта в определенных длинах волн предварительно изученного спектра люминесценции его сопровождает регистрацию физиологических параметров этого же объекта, таких как, например, электрическая или механическая активность, газообмен и др. В этих случаях применение громоздкой микроспектральной техники может оказаться как неудобным, так и излишним. Более того, возникает необходимость (см. гл. I) регистрировать внутриклеточную компартментализацию состояний тех или иных (например, энергетических) функциональных систем клетки. В этом случае представляет интерес не сам спектр люминесценции объекта, а прямая регистрация отношения интенсивности отдельных полос излучения в этом спектре (например, ξ, т. е. отношение интенсивности люминесценции окисленных флавопротеинов к таковой восстановленных пиридиннуклеотидов, а также упоминавшиеся выше параметры α, β и аналогичные им).

Одним из удобных для этой цели приборов может явиться двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением люминесценции двух исследуемых соединений. Его принципиальная

оптическая схема, собранная на основе люминесцентного микроскопа «Люмам», приведена на рис. 2.5. Возбуждение флуоресценции осуществляется падающим через микрообъектив 12 излучением с применением в опак-иллюминаторе сменных интерференционных светоделателей 11. В качестве источника света 1 использована ртутная лампа ДРШ-250-2. Ограничение размеров освещаемого поля осуществляется с помощью диафрагмы 10 типа «кошкин глаз», а выделение фотометрируемого участка - с помощью регулируемой зеркальной диафрагмы 17, расположенной в плоскости изображения объекта. Наблюдение объекта с целью выбора места препарата для фотометрирования и приведение измеряемой структуры внутрь зонда может осуществляться как в свете люминесценции, так и по методу фазового контраста. В последнем случае обычный микрообъектив 12 заменяется фазовым, а освещение производится в проходящем свете от лампы накаливания 27 через фазовоконтрастный конденсор 14. Преимуществом такого способа освещения является минимальное фотохимическое воздействие возбуждающего света на объект. Изображение объекта, полученное в плоскости зеркальной диафрагмы 17, наблюдается с помощью оптической системы 22. Интенсивность флуоресценции части объекта, изображение которой приходится на отверстие в этой диафрагме, регистрируется с помощью фотоумножителя 20 типа ФЭУ-71.

Рис. 2.5. Оптическая схема двухволнового микрофлуориметра с раздельным возбуждением [284].

1 – дуговая лампа;					14	– конденсор;
2, 5, 9, 18, 28 – линзы;					15, 21 – системы сопряжения;
3, 30 – теплофильтры4					16, 24, 31 – зеркала;
4 – затвор;					19, 19’ – светофильтры;
6, 10, 17, 25, 29 – диафрагмы;					20, 26 – ФЭУ;
7	–	сменный	диск	со	22	– система визуального наблюдения;
	светофильтрами;				23	– кварцевая пластинка;
8, 8’ – светофильтры возбуждения;					27	– лампа накаливания.
11	– сменные светоделители;
12	– микрообъектив;
13	– препарат;

Возбуждающие и запирающие стеклянные светофильтры попарно установлены в прорезях диска 7, как это показано на рис. 2.5, 4. Они находятся на разных расстояниях от оси вращения диска и ориентированы в нем таким образом, что каждому возбуждающему светофильтру в осветительной части прибора соответствует определенный запирающий светофильтр перед фотоумножителем в регистрирующей системе. Так, в одном из вариантов возбуждающий светофильтр 8" изготовлен из стекла УФС-6 (толщиной 4 мм), соответствующий запирающий светофильтр 19" - из стекол СС-5 (3 мм) и ЖС-3 (1 мм). Это пара светофильтров соответствует максимумам возбуждения и излучения восстановленных пиридиннуклеотидов. Для регистрации окисленных флавопротеинов применяется пара светофильтров: 8' - из стекла СС-5 (4 мм) и 19' - из стекла 3С-8 (4 мм). При вращении диска оптическую ось осветительной части прибора пересекают попеременно возбуждающие светофильтры 8 или 8', в эти моменты перед ФЭУ оказываются соответствующие запирающие светофильтры 19' и 19". Частота смены светофильтров 60 Гц. Это обеспечивает практически одновременную регистрацию различных полос люминесценции. Сигналы после ФЭУ усиливаются, распределяются на два канала и попадают в электрическую систему, которая может регистрировать абсолютные