6 курс / Кардиология / СЕРДЕЧНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

регистрированы по появлению или потере сайтов узна вания для ферментов эндонуклеазной рестрикции, что проявляется на электрофореграмме полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов.

Структуры праймеров, длины амплификационных фрагментов, эндонуклеазы рестрикции и длины полу чаемых фрагментов представлены в таблице 2.4.

ПЦР проводили в конечном объеме 12 мкл, содер жащем 650 мМ трис. HCl (рН 8,9), 160 мМ сульфат ам мония; 20 мМ MgCl2; 0,05% Tween 20; 2 mM dNTP; 0,5 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 20–100 нг ДНК и 1 ед. Taq полимеразы. Реакцию про водили на амплификаторе “Eppendorff” с начальной де натурацией при 95 °С 3 мин., далее в течение 42 циклов с денатурацией 5 с при 95 °С, отжигом 5 с при Тотж и элонгацией 15 с при 72°С. Финальная элонгация прово дилась при 72 °С 5 мин.

Для проведения ПДРФ анализа полученных фраг ментов ДНК рестрикцию осуществляли следующим об разом. К амплификационной смеси добавляли 1/10 V 10х буфера для рестрикции и эндонуклеазу ре стрикции (1–3 ед. акт. фермента) и инкубировали 2 ч при 65 °С. Буфер для рестрикции использовали с уче том рекомендаций производителя эндонуклеазы рест рикции. Фермент инактивировали добавлением 1 мкл 0,5М ЭДТА.

Анализ продуктов гидролиза проводили в 7% ПААГ, гель окрашивали бромистым этидием с визуализацией ДНК УФ светом, затем фотографировали с помощью цифровой видеокамеры “Vatec” (Япония).

91

92

Таблица 2.4

Структуры праймеров и температура их отжига, длины амплификационных фрагментов, эндонуклеазы рестрикции и длины получаемых фрагментов, используемые

для типирования полиморфных локусов методом ПДРФанализа

		Длина	Тотж	Эндонук		Длины
Локус	Праймеры	амплифика	прай	леаза	Аллели	рестрик
		ционного	меров,	рестрик		ционных
		фрагмента	°С	ции		фрагментов
MTHFR	GTTACCCCAAAGGCCACCC	126	64	TaqI	C	106+20
(С677Т)	GGAAGAATGTGTCAGCCTCGAAG 126		64	TaqI	T	79+27+20
NQO1	TCCTCAGAGTGGCATTCTGC	211	62	HinfI	C	211
(С609Т)	TCTCCTCATCCTGTACCTCT	211	62	HinfI	T	165+46

недостаточность Сердечная .Н.С Шилов ,.Н.Е Березикова ,.Т.А Тепляков

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

2.4.3. Аллель специфичная амплификация в режиме Real time с использованием красителя SYBR Green I для индукции флюоресценции

Для анализа аллельных полиморфных вариантов ге нов BNP, MMП 3, ИЛ 6, рецептора эндотелина 1 типа А, VEGF данным методом используют две пары прайме ров (табл. 2.5). Один из праймеров в паре является об щим, два других отличаются 3’ концевым нуклеотидом. Таким образом один из праймеров комплементарен последовательности ДНК дикого типа, другой – после довательности, содержащей однонуклеотидную замену. Каждый образец амплифицируется с исполь зованием обеих пар праймеров. При полной комплемен тарности матрицы и праймера реакция амплификации будет идти с большей эффективностью, чем в случае наличия неспаренного нуклеотида на 3’ конце прайме ра. Детекция результатов ПЦР проводится в режиме реального времени. Для этого в реакционную смесь добавляется флуоресцентный краситель SYBR Green I. SYBR Green I представляет собой интеркалирующий краситель, который флюоресцирует приблизительно в 200 раз интенсивнее, если связан с двуцепочечной мо лекулой ДНК. Продуктом ПЦР является двуцепочечный ДНК фрагмент. Таким образом, интенсивность флюо ресцентного сигнала будет прямо пропорциональна количеству образующегося продукта.

93

94

Таблица 2.5

Структуры праймеров и зондов, используемых для генотипирования аллельспецифичной амплификацией в режиме Realtime с использованием красителя SYBR Green I

для индукции флюоресценции

		Темп. Расчетн.
Локус	Праймер общий	Праймеры специфичные отжига темп.
			плавления
			продукта
			ПЦР
ENDRA 3’TCATACCTAAGTCATTCACATCG5’ 3’CTTTGCTGGTTCCCTCTTCAT5’ 63 79,9
(С1363Т)		3’CTTTGCTGGTTCCCTCTTCAC5’ – –
VEGF	3’TGCTCTACTTCCCCAAATCAC5’ 3’ACTCACTTTGCCCCTGTCG5’ 64		89,2
634C)(G		3’ACTCACTTTGCCCCTGTCC5’ – –
BNP	3’CTCCCTACCTTTTCCAGCAAC5’ 3’CTTCCTTTCCTGCTAATGTCCG5’ 64		87,7
381T)(C		3’CTTCCTTTCCTGCTAATGTCCA5’ – –
6IL	3’GTGCATGACTTCAGCTTTACTC5’ 3’AATGTGACGTCCTTTAGCATG5’ 64		82
174G)(C		3’AATGTGACGTCCTTTAGCATC5’ – –
MMP3	3’GGATTACAGACATGGGTCACG5’ 3’ATCAGGACAAGACATGGTTTTTTC5’ 63		83
1171( 5A/6A)		3’ATCAGGACAAGACATGGTTTTTC5’ –	–

недостаточность Сердечная .Н.С Шилов ,.Н.Е Березикова ,.Т.А Тепляков

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

2.5. Иммуноферментный анализ

Определение уровня цитокинов, факторов роста, sFas L, гомоцистеина, эндотелина 1 и NТ proBNP в сы воротке крови проводили методом иммуноферментно го твердофазного анализа (ELISA) (табл. 2.6).

Принцип метода иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA)

Специфические моноклональные антитела (СМА) к определяемому агенту (ОА) в избытке фиксированы на внутренней стенке ячейки микротитрационного планше та. В первой иммунореакции (рис. 2.2) свободный плаз менный антиген ОА взаимодействует и образует комп лекс с пристеночными моноклональными антителами. Затем присутствующие в тест системе компоненты плаз мы удаляются промыванием на промывателе микротит рационных микропланшет. Поскольку антиген имеет постоянную антигенную детерминанту, то добавление (в избытке) меченых пероксидазой антител к ОА при водит к формированию сэндвич комплексов (вторая иммунореакция), в которых антиген ОА закрыт антите лами с обеих сторон. Число меченых пероксидазой ан тител пропорционально количеству ОА, содержащему ся в исследуемом материале.

Индикаторная реакция (детекция) запускается добав лением субстрата – о фенилдиамина/Н2О2 (O.P.D./

Н2О2), который расщепляется пероксидазой фиксиро ванного на внутренней стенке комплекса антитело ан тиген антитело с выделением хромогена (красящего вещества), определяемого фотометрически (на имму ноферментном фотометре с длиной волны 492 нм).

95

96

Таблица 2.6

Коммерческие наборы, использованные для проведения ELISA

Показатель	Коммерческий набор – № по каталогу
Фактор некроза опухолиальфа (ФНОα )	ВЕКТОРБЕСТ (РФ) – 8756
Интерлейкин1β в (IL1β )	ВЕКТОРБЕСТ (РФ) – 8766
Интерлейкин6 (IL6)	ВЕКТОРБЕСТ (РФ) – 8768
Антагонист рецептора IL1 (IL1Pa)	ВЕКТОРБЕСТ (РФ) – 8764
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)	ВЕКТОРБЕСТ (РФ) – 8784
Основной фактор роста фибробластов (FGF basic) RD Systems (USA) – DFB 50
Тромбоцитарный фактор роста (PDGF)	RD Systems (USA) – DAAOOB
Растворимый sFАSлиганд (sFas L)	Bender MedSystems (Австрия) – BMS 260/2
Гомоцистеин	AxisShield (UK) – fHCY 100
Эндотелин1	Biomediсa Gruppe (Австрия) – 4420082
Мозговой натрийуретический пропептид	Biomediсa Gruppe (Австрия) – 4421204
(NTproBNP)

недостаточность Сердечная .Н.С Шилов ,.Н.Е Березикова ,.Т.А Тепляков

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

Рис. 2.2. Схема иммуноферментного твердофазного анализа

97

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

Используемый материал: плазма крови. Приготовление образцов: перед исследованием 1

часть плазмы разводится в 30–50 раз трис буфером в зависимости от вида тест системы и инструкции произ водителя набора.

Ход определения:

1)подготовка микротитрационных стрипов;

2)добавить разведенный буфером материал в лунку микротитрационного стрипа и инкубировать в тече ние 1 ч при комнатной температуре;

3)промывание;

4)добавить в лунку микротитрационного стрипа имму ноконъюгаты и инкубировать в течение 1 ч при ком натной температуре;

5)промывание;

6)добавить раствор субстрата о фенилдиамина/Н2О2;

7)ровно через 3 мин добавить соляной кислоты (1 моль/л);

8)чтение результатов на ИФА анализаторе через 10–120 мин.

2.6. Статистический анализ

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета статистических программ STATISTICA v.7.0. Для первичного анализа качествен ных переменных была проведена оценка распределе ния по уровням каждой переменной, представленной в настоящем исследовании, отдельно в группах мужчин и женщин. Для количественных переменных кроме опи

98

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

сания структуры данных, которая оценивалась при по мощи квантильных (процентильных или просентильных) статистических оценок (10% – десятая процентиль или первая дециль, 25% – двадцать пятая процентиль или нижняя квартиль, Me – медиана, 50 я процентиль, 75%

– верхняя квартиль, 90% – девятая дециль), была про ведена проверка соответствия выборочных распреде лений теоретическому нормальному распределению (Гаусса–Лапласа) с использованием сравнения мер цен тральной тенденции (М – средней арифметической ве личины; Ме – медианы; М , Мо – моды), наличия мно жественной моды, а также основного критерия провер ки нормальности – критерия Колмогорова–Смирнова.

Определяли среднее значение и стандартную ошиб ку среднего значения исследуемых количественных пе ременных (M±m). Для сравнительного анализа этих зна чений показателей был использован H критерий Крас

кела–Уоллеса с последующим post hoc (множествен ным) сравнением между отдельными группами. Для сравнения мужчин и женщин был применен U критерий Манна–Уитни. Для анализа качественных признаков ис пользовался критерий хи квадрат (χ 2), а post hoc (мно жественное) сравнение проводилось двусторонним ва риантом точного критерия Фишера (Fisher exact, two tailed) с поправкой Бонферрони (Bonferroni– Korrektur).

Для проведения корреляционного анализа был ис пользован коэффициент ранговой корреляции Ч. Спир мена (Spearman R).

Для выявления вероятных предикторов (факторов,

99

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

влияющих на формирование) неблагоприятного тече ния ХСН было проведено сравнительное изучение, от дельно для мужчин и женщин, значений показателей всех исследованных переменных в группах: 1) с благо приятным течением и 2) с неблагоприятными сердечно сосудистыми событиями в течение периода наблюде ния (1 год). Для отбора возможных предикторов или проверки влияния различных показателей использова лась оценка OR (odds ratio – отношение шансов) при указанном значении исследованной переменной в срав нении с отсутствием этого значения, с границами дове рительных интервалов (–95%CL; +95%CL) и ошибкой первого рода (p) по критерию χ 2 Вальда (Wald’s Chi square). Для проведения этого анализа все переменные были преобразованы в альтернативные. Для этого но минативные переменные преобразовывались либо в несколько дихотомических, либо, если это не противо

речило смысловому наполнению показателя, несколь ко близких по смыслу градаций объединялись в одну. Преобразование количественных показателей осуще ствлялось делением на два интервала, по значению ме дианы.

Для оценки прогностического влияния факторов вы полнили анализ соответствующих ROC (receiver operating characteristic) кривых. На ROC кривой опре деляли точку, соответствующую оптимальному соотно шению чувствительности и специфичности.

В зависимости от значения медианы количественных показателей стоились кривые времени наступления не благоприятных сердечно сосудистых событий (Капла

100