6 курс / Кардиология / СЕРДЕЧНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

агулянты (гепарин) – 53 чел. (19,1%), варфарин – 33 пациента с фибрилляцией предсердий (11,9%), нитра ты – 210 чел. (75,8%), антагонисты кальция (амлоди пин, верапамил, нифедипин) – 25 чел. (9,0%), антиарит мики (амиодарон, пропафенон) – 67 чел. (24,2%). При наличии сопутствующей патологии проводилось соот ветствующее лечение.

По итогам годичного наблюдения больные, у кото рых дополнительно проводили специальное биохими ческое исследование (n=94), были разделены на две группы: пациенты, у которых отмечалось благоприятное течение заболевания, определили в группу А; пациен ты, у которых отмечалось неблагоприятное течение за болевания, включили в группу Б.

Клиническое течение заболевания оценивали как благоприятное у больных (вошедших в состав группы А), если в течение исследуемого периода (12 мес.) на

фоне адекватно проводимой терапии состояние паци ента отвечало следующим критериям:

–стабильное состояние гемодинамических показате лей, отсутствие нарастания симптомов и признаков ХСН;

–отсутствие госпитализаций по поводу СН или не бо лее 1 раза в год;

–отсутствие снижения ФВ ЛЖ;

–сохранение прежнего ФК ХСН по NYHA или его уменьшение;

–более высокое качество жизни по результатам Шка лы оценки клинического состояния при ХСН (ШОКС) (Мареев В.Ю., 2000).

81

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

Рис. 2.1. Дизайн проспективного исследования

82

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

Критерии неблагоприятного течения ХСН у больных, вошедших в состав группы Б:

–увеличение ФК ХСН по NYHA на 1 и более в течение периода проспективного наблюдения;

–госпитализация по поводу СН более 1 раза на протя жении 12 мес. наблюдения;

–прогрессивное снижение фракции выброса ЛЖ в те чение исследуемого периода;

–снижение качества жизни по результатам ШОКС;

–летальность либо другие неблагоприятные клиничес кие события (повторные ИМ, мозговой инсульт, ТЭЛА и др.).

Таким образом, в группу А (с благоприятным тече нием заболевания) вошло 49 пациентов (52%), а в груп пу Б (с неблагоприятным течением) – 45 пациентов (48%).

Дизайн проспективного исследования представлен на рисунке 2.1.

В группе контроля однократно проводили клиничес кое обследование, общие анализы крови и мочи, био химическое исследование крови, ЭКГ, R графию орга нов грудной клетки, также проводили забор генетичес кого материала с последующим типированием аллелей генов p53, каспазы 8, GPX1, SOD, GSTP1, NQO1, BNP, VEGF, ИЛ 6, MTHFR, MMП, GP1BA и ENDRA. Кроме это

го проводили специальное биохимическое исследова ние сыворотки крови для определения уровня цитоки нов, факторов роста, sFas L, гомоцистеина, эндотели на 1 и NТ proBNP.

83

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

2.3. Функциональные и лабораторные методы исследования

Разделение пациентов на функциональные клас сы проводили согласно классификации Нью Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA) (1964 г.) с использо ванием теста с 6 минутной ходьбой [80].

Оценка семейного анамнеза проводилась на осно ве опроса больного с помощью стандартного опросни ка ВОЗ “Семейный анамнез”. Регистрировали наличие у родственников 1 й степени родства (родители, род ные братья и сестры, дети) наличие смерти от инфаркта миокарда или инсульта, перенесенные НМК или инфарк ты миокарда, наличие артериальной гипертонии. Семей ный анамнез считали отягощенным при наличии у боль ного двух или более пораженных родственников.

Качество жизни (КЖ) пациентов анализировалось по Шкале оценки клинического состояния при ХСН (ШОКС) (Мареев В.Ю., 2000).

Биохимические методы исследования. Липидный спектр крови определяли на биохимическом анализа торе “Synchron CX 7” фирмы “Beckman” (США) с ис пользованием реактивов фирмы “Human” (Германия). Оценивали следующие показатели: общий холестерин сыворотки крови (ОХС), холестерин липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицериды, холес

терин липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП). Индекс атерогенности (ИА) рассчитывали по формуле:

ИА = ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПНП.

84

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

Определение содержания в капиллярной крови на тощак производили энзиматическим (глюкозооксидаз ным) методом на автоматическом анализаторе “Биосен 5030” (Германия).

Электрокардиографическое исследование прово дили в 12 отведениях по общепринятой методике на электрокардиографе “SONOS 2500” (Hewlett Packard).

Эхокардиографическое исследование проводи лось на ультразвуковом аппарате ACUSON 128XP (США). Объемы ЛЖ в систолу и диастолу определялись из верхушечного доступа в плоскости четырехкамерно го сечения сердца на уровне створок митрального кла пана с визуализацией выносящего тракта ЛЖ. Для вы числения объемов ЛЖ использовалась формула “пло щадь длина”. ФВ ЛЖ определялась по методу Симпсо на.

Массу миокарда ЛЖ (ММЛЖ, в г) и индекс ММЛЖ

(в г/м2) рассчитывали в М режиме в конце диастолы по формуле:

ММЛЖ = 1,04 х [(толщина МЖП + толщина ЗСЛЖ + + КДР ЛЖ)3 – КДР ЛЖ3] – 13,6 г.

Индекс ММЛЖ рассчитывали как отношение ММЛЖ к площади поверхности тела пациента [301]. Критери ем гипертрофии ЛЖ, согласно Фрамингемскому иссле дованию, считали величину индекса ММЛЖ 134 г/м2 и более у мужчин и 110 г/м2 и более у женщин. Опреде ляли размер левого предсердия (ЛП).

85

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

2.4. Исследование полиморфизмов генов

Исследование полиморфизмов генов проводили в лаборатории фармакогеномики под руководством за ведующего лабораторией, канд. биол. наук М.Л. Фили пенко в Институте химической биологии и фундамен тальной медицины в г. Новосибирске (ИХБФМ СО РАН). В работе были использованы реактивы: Tween 20 (“Serva”, USA), SDS, Tris base (ICN, USA), акриламид (ICN, USA), N,N метилен бисакриламид (ICN, USA), ПСА (Sigma), ТЭМЕД (Reanal). Ферменты: Taq полимераза (ИХБФМ), лизоцим (Serva), протеиназа К (Serva). Все остальные реактивы: KCl, MgCl2, (NH4)2SO4, ЭДТА, NaCl, NaAc, NaOH, HCl – были отечественного производства. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и олигонуклео тидные праймеры были синтезированы в ИХБФМ СО РАН.

Выделение ДНК. Пробирки с клиническими образ цами (буккальный эпителий) центрифугировали на 14 тыс. об/мин 15 мин. Осадок ресуспендировали в 300 мкл раствора №1 (100 мМ Tris HCl pH = 8,0; 10 мМ ЕДТА, 100мМ NaCl). Добавляли 50 мкл раствора №2 (10% додецил сульфат натрия (SDS)) и 10 мкл протеи назы К (10 мг/мл). Хорошо перемешивали и инкубиро вали 1 ч при 55 °С. Добавляли 200 мкл фенола, уравно

вешенного ТЕ и 200 мкл хлороформа. Интенсивно пе ремешивали и центрифугировали 10 мин на максималь ной скорости (14 тыс. об/мин). Верхнюю фазу перено сили в чистую пробирку, не трогая нижнюю и интерфа

86

Глава 2. Характеристика больных и методы исследования

зу. Добавляли 400 мкл хлороформа. Перемешивали и центрифугировали 5 мин на максимальной скорости (14 тыс. об/мин). Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку. Добавляли 10 мкл ЛПААГ, 40 мкл 3М AcNa pH5.4, 800 мкл EtOH, тщательно перемешивали. Инку бировали ночь на –20 °С. Центрифугировали 15 мин на максимальной скорости (14 тыс. об/мин). Супернатант удаляли, к осадку добавляли 400 мкл 75% EtOH. Инку бировали 10 мин при комнатной температуре. Отбира ли супернатант, следя за тем, чтобы осадок остался в пробирке. Сушили пробирки с открытыми крышками в термостате для микропробирок при 37 °С в течение 15 мин. К осадку добавляли 100 мкл дистиллированной воды и прогревали при 65 °С 10 мин.

Нами были проведены исследования по полиморфиз мам 14 генов модификаторов, характеризующих белок р53, систему каспаз, натрийуретических пептидов, ме

таллопротеиназ, цитокинов, антиоксидантной защиты, эндотелина, метилентетрагидрофолатредуктазу и фак торы роста в группе наблюдаемых больных и в группе контроля. Материалом для молекулярно генетическо го исследования полиморфизмов послужили образцы ДНК, выделенной из клеток буккального эпителия ме тодом фенольно хлороформной экстракции (Маниа тис Т. и соавт., 1984).

87

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

2.4.1. Генотипирование однонуклеотидных замен в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК

Методы генотипирования однонуклеотидных замен в генах p53, GP1BA, каспазы 8, GPX1, SOD, GSTP1 раз работаны с помощью ПЦР в режиме реального време ни с использованием конкурирующих TaqMan зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК (табл. 2.3). Зонды отличаются по структуре на один нук леотид, соответствующий SNP (находится в центре оли гонуклеотидного зонда). В реакционной смеси зонды конкурируют друг с другом за гибридизацию с матри цей. При полной комплементарности матрицы и зонда гибридизация будет эффективнее, чем в случае непол ной комплементарности. Следовательно, накопление флуоресцентного сигнала, соответствующего полнос

тью комплементарному зонду, будет преобладать. Основным параметром, который мы учитывали для

каждой из реакций, являлось соотношение значений флюоресценции (relative fluorescence unit, или RFU) в диапазонах эмиссии красителей FAM и R6G. Для гено типа С/С(GP1BA) интенсивность флюоресценции уве личивалась преимущественно в диапазоне FAM, при ге нотипе Т/Т (GP1BA) интенсивность флюоресценции

увеличивалась преимущественно в диапазоне R6G, при гетерозиготном генотипе интенсивность флюоресцен ции увеличивалась в обоих диапазонах.

При оптимизации условий амплификации варьирова ли соотношение концентраций зондов, температуру от

88

89

Таблица 2.3

Структуры праймеров и зондов, используемых для генотипирования в режиме реального времени методом конкурирующих TaqMan.зондов

Локус	Праймеры	Зонды
GP1BA 5’GAAAGGCAATGAGCTGAAGAC3’ 3’BHQCTCCTGATGCCCACACCFAM5’
(T145M)	5’GATTCTCCAGCCCATTCAG3’	3’BHQCTCCTGACGCCCACACCR6G5’
р53	5’GCTCCCAGAATGCCAGAG	CTCCCCGCGTGGCCCFAM5’ 3’BHQ
(Arg72Pro)	5’GGGAAGGGACAGAAGATGAC	CTCCCCCCGTGGCCCR6G5’ 3’BHQ

Каспаза8 U5’AGACTTTTTCCTAGGCTTATAAAGC3’ Del 3’BHQCTCTGCCAAGCTGCGTGACCTT5’ROX (652(6N)I/D) R 5’CACTGAGACGTTAAGTAACTTGC3’ 5’ 3’BHQCTCTGCCACTTACTAGCTGCGTR6G

8Каспаза U 3’CCACGACCTTTGAAGAGCTTC5’		5’ FAMAAGCCCCACGATGACTGCA3’
(D302H)
	R 3’TTACTGTAGTCCATGAGTTGGTAG5’ 5’ Cy5AAGCCCCACCATGACTGCA3’
MnSOD	3’CTGTGCTTTCTCGTCTTCAG5’	5’R6GCTGGCTCCGGTTTTGGGGFQ3’
(Ala16Val) 3’CGTTGATGTGAGGTTCCAG5’
		5’FAMCTGGCTCCGGCTTTGGGGRTQ3’

GPX1 3’GCTTCCAGACCATTGACATC5’ 3’BHQ2CTCAAGGGCTCAGCTGTGCR6G5’ (Pro198Leu) 3’CGAGGTGGTATTTTCTGTAAGATC5’ 5’FAMCTCAAGGGCCCAGCTGTGCBHQ23’

GSTP1 5’GATGCTCACATAGTTGGTGTAG3’ 3’BHQ2CTGCAAATACGTCTCCCTCAT5’R6G (A313G) 5’GGTGGACATGGTGAATGAC3’ 5’FAMCTGCAAATACATCTCCCTCATBHQ23’

исследования методы и больных Характеристика .2 Глава

Тепляков А.Т., Березикова Е.Н., Шилов С.Н. Сердечная недостаточность

жига праймеров, состав амплификационного буфера. Достоверность генотипирования подтверждалась сек венированием. Важным критерием достоверности гено типирования служила кластеризация генотипов в груп пы, строившаяся на основе показателей интенсивности флюоресценции (в относительных единицах флюорес ценции – RFU).

Каждый образец амплифицировался с использова нием пары праймеров и двух зондов, несущих “гаси тель” на 3’ конце и разные флюоресцентные красители (FAM либо R6G) на 5’ конце. Структуры праймеров и зондов приведены в таблице 2.3. Общий объем реакци онной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 40–100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100–200 нМ Taqman зондов, конъюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ ные dNTP, амплификационный буфер, термо стабильную Taq полимеразу – 0,5 ед.акт./реакц.

ПЦР проводилась в следующих условиях: начальная денатурация 3’ при 96 °С; затем 40 циклов, включаю щих денатурацию при 96°С 8”, отжиг праймеров и пос ледующую элонгацию при 60 °С 35” (каждый шаг со провождался регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующих интервалам флюорес ценции флюорофоров FAM и R6G).

2.4.2. Генотипирование однонуклеотидных замен методом ПДРФ анализа

Генотипирование однонуклеотидных замен MTHFR, NQO1. Данные полиморфные варианты представляют собой нуклеотидные замены, которые могут быть за

90