Введение .1
Базовое .2 исследование
исследование	Расширенное 3:
исследования	Углубленные.4
сперматозоидов	подготовки Методы .5
сперматозоидов	Криоконсервация .6
качества Обеспечение .7 качества контроль и
	Приложения .8
Справочная .9 литература

Глава 5.

Методы подготовки сперматозоидов

5.1	Введение...........................................................................	183
5.2	Общие принципы..............................................................	185
5.3	Простое отмывание.........................................................	186
5.4	Прямое всплытие.............................................................	187
5.5	Прерывистые градиенты плотности..............................	188

5.6Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS)..189

5.7Подготовка образцов ВИЧ-инфицированного

	эякулята............................................................................	190
5.8	Подготовка сперматозоидов из ткани яичка
	и придатка яичка.............................................................	191
5.9	Подготовка образцов при ретроградной эякуляции...	192
5.10 Подготовка образцов при ассистированной
	эякуляции.....................................................................	193

5.1 Введение

5.1.1 Обоснование

Для некоторых целей сперматозоиды необходимо отделять от семенной плазмы, например для проведения диагностических и исследовательских тестов функциональных параметров, оценки воздействия состава среды и извлечения сперматозоидов для вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Предпосылками, на основании которых рассматриваются методы подготовки сперматозоидов для ВРТ, являются обеспечение хорошего качества сперматозоидов и устранение факторов, оказывающих негативное воздействие на оплодотворение. Если необходимо провести исследование функции сперматозоидов, крайне важно отделить их от семенной плазмы в течение 1 часа после эякуляции, с тем чтобы ограничить любое негативное воздействие клеток, не относящихся к сперматозоидам (284), и пагубные последствия повышения осмоляльности в образцах эякулята, хранящихся in vitro (147, 342).

Идеальный метод подготовки сперматозоидов должен обеспечить получение высокофункциональной популяции сперматозоидов, которая сохраняет ДНК и не вызывает дисфункцию из-за выработки АФК сперматозоидами и лейкоцитами.

183

	Введение .1
Базовое .2 исследование
исследование	Расширенное 3:
исследования	Углубленные.4
сперматозоидов	подготовки Методы .5
сперматозоидов	Криоконсервация .6
качества Обеспечение .7 качества контроль и
	Приложения .8
Справочная .9 литература

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Несмотря на то, что некоторые компоненты смешанной семенной плазмы, повидимому, способствуют проникновению сперматозоидов в цервикальную слизь по сравнению, например, с раствором Тироде (документ Оверстрита и др., 1980 г.), негативное воздействие жидкости семенных пузырьков на подвижность, выживание и защиту ДНК сперматозоидов документально подтверждено (13, 256), как и присутствие «факторов декапацитации» в семенной плазме (343). Кроме того, некоторые компоненты семенной плазмы препятствуют наступлению беременности в тех случаях, когда естественные барьеры преодолеваются с помощью ВРТ, таких как ВМИ или ЭКО. Отделение сперматозоидов человека от семенной плазмы и их обработка для получения конечного препарата, содержащего высокую процентную долю морфологически нормальных и подвижных клеток со сниженным уровнем повреждения ДНК и свободного от дебриса, неполовых клеток и мертвых сперматозоидов, важны как для клинической практики, так и для обеспечения прогностической значимости исследования.

5.1.1.1 Выбор метода

Выбор метода подготовки сперматозоидов зависит от свойств образца эякулята (344, 345) и его назначения. Для вспомогательной репродукции, включая процедуры ЭКО, методы подготовки сперматозоидов должны обеспечивать получение популяции сперматозоидов с минимальным повреждением ДНК (346). Идеальный метод подготовки сперматозоидов должен обеспечить получение высокофункциональной популяции сперматозоидов (347), которая сохраняет ДНК и не вызывает дисфункцию из-за выработки АФК сперматозоидами и лейкоцитами (348, 349). Извлеченные сперматозоиды должны иметь подходящую морфологию и сохранять функциональную подвижность для рассматриваемого спектра ВРТ. Для подготовки нормозооспермических образцов для ВМИ предлагается разведение эякулята культуральной средой и центрифугирование (345, 350), при этом выбор метода зависит также от показаний или предназначения. Например, метод прямого всплытия целесообразно применять при отборе подвижных сперматозоидов, поскольку в его основе лежит способность сперматозоидов всплывать в культуральной среде. Исследования показали, что фрагментация ДНК, для которой характерны однонитевые или двунитевые повреждения, отрицательно коррелирует с результатами ВРТ (346, 351, 352) (раздел 3.2 на стр. 97). Как метод прямого всплытия, так и метод всплытия осадка способствуют значительному снижению общего показателя фрагментации ДНК, хотя при использовании метода всплытия осадка предусматривается центрифугирование, которое может повлиять на другие функциональные параметры сперматозоидов (353, 354). В случаях, когда образцы эякулята считаются в основном нормальными, часто используется метод прямого всплытия, тогда как в случаях тяжелой олигозооспермии, тератозооспермии или астенозооспермии предпочтение обычно отдается ЦГП из-за более высокой результативности и, следовательно, большего общего количества извлеченных подвижных сперматозоидов. Для оптимальной обработки отдельных образцов с учетом их специфических свойств могут быть также изменены градиенты плотности: может быть уменьшен общий объем градиентного материала, что ограничивает расстояние до осаждения сперматозоидов и максимально увеличивает общее количество извлеченных подвижных сперматозоидов, или для образцов с высокой вязкостью может быть увеличено время центрифугирования.

184

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

	Введение .1
Базовое .2 исследование
исследование	Расширенное 3:
исследования	Углубленные.4
сперматозоидов	подготовки Методы .5
сперматозоидов	Криоконсервация .6
качества Обеспечение .7 качества контроль и
	Приложения .8
Справочная .9 литература

Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов

Каждая лаборатория должна определить центробежную силу и время центрифугирования, необходимые для формирования приемлемого осадка сперматозоидов. Если число сперматозоидов крайне незначительно, может возникнуть необходимость в изменении центробежной силы или времени центрифугирования, чтобы расширить возможности для извлечения максимального количества сперматозоидов. Модификации рекомендуемого времени центрифугирования или центробежной силы должны быть тщательно протестированы до клинического применения. Наиболее подходящий метод подготовки можно определить по функциональным параметрам подготовленных сперматозоидов, определяемым, например, по их подвижности (раздел 2.4.6 на стр. 27) и жизнеспособности (раздел 2.4.7 на стр. 30).

5.1.1.2 Эффективность отделения сперматозоидов от семенной плазмы и обращение с возбудителями инфекции

Эффективность метода отбора сперматозоидов обычно выражается в абсолютном количестве сперматозоидов, общем числе подвижных сперматозоидов или извлеченных морфологически нормальных подвижных сперматозоидов. Метод всплытия обычно позволяет извлечь меньше подвижных сперматозоидов (менее 20%), чем ЦГП (более 20%). Метод всплытия и ЦГП приводят также к разным уровням загрязнения конечного препарата эякулята компонентами семенной плазмы. При использовании цинка из секрета простаты в качестве маркера растворимых компонентов эякулята была продемонстрирована зависящая от времени диффузия цинка из эякулята в покрывающую среду для всплытия (355). Конечная концентрация цинка в препаратах, подготовленных методом всплытия, была выше, чем после центрифугирования в градиенте плотности.

Образцы эякулята могут содержать возбудителей опасных инфекционных заболеваний, поэтому технический персонал должен обращаться с ними с особой осторожностью как с биологически опасными веществами. Помимо удаления некачественных, в том числе неподвижных, сперматозоидов, в рамках подготовки эякулята необходимо удалять другие клетки, такие как лейкоциты и бактерии (356), а также токсичные или биологически активные вещества (347). Методы подготовки эякулята не могут считаться на 100% эффективными с точки зрения удаления возбудителей инфекционных заболеваний из эякулята (раздел 5.7 на стр. 190). Необходимо строго соблюдать правила техники безопасности, изложенные в разделе 8.2 на стр. 249. В основе лабораторной безопасности лежит надлежащая лабораторная практика (48, 357).

5.2 Общие принципы

Некоторые из доступных методов подготовки сперматозоидов описаны в следующих разделах. Для всех из них в качестве культуральной среды предлагается сбалансированный солевой раствор, обогащенный белком и содержащий буфер, подходящий условиям окружающей среды, в которых будут обрабатываться сперматозоиды. Для проведения вспомогательных репродуктивных процедур, таких как ИКСИ, ЭКО и искусственная инсеминация, необходимо, чтобы сывороточный альбумин человека был высокоочищенным и не был загрязнен вирусами, бактериями или прионами. Альбумин, специально разработанный для таких процедур, является коммерчески доступным. Для диагностических целей можно использовать

185

	Введение .1
Базовое .2 исследование
исследование	Расширенное 3:
исследования	Углубленные.4
сперматозоидов	подготовки Методы .5
сперматозоидов	Криоконсервация .6
качества Обеспечение .7 качества контроль и
	Приложения .8
Справочная .9 литература

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

гораздо более дешевый BSA (раздел 8.4 на стр. 263). Если в инкубаторе содержится только атмосферный воздух, а температура составляет 37°C, среда должна быть забуференной (см. раздел 8.4.1 на стр. 263). При соблюдении этого требования pH культуральной среды благоприятен для выживания сперматозоидов. Выбор буферной среды зависит от конечного предназначения обработанных сперматозоидов. Например, для исследований функции сперматозоидов в целом требуется среда, поддерживающая капацитацию сперматозоидов, которая обычно содержит бикарбонат натрия (25 ммоль/л).

Сбор эякулята для ВРТ должен проводиться в стерильных условиях (раздел 2.5.12 на стр. 77). При подготовке эякулята для использования в терапевтических целях необходимо обеспечить стерильность методов и материалов.

Примечание. Хотя среда может быть приготовлена в лаборатории, следует отметить, что эффективность раствора и его безопасность невозможно полностью контролировать. Обычно предполагается, что при наличии возможности для ВРТ используются среды, изготовленные на коммерческой основе, протестированные и одобренные для терапевтического использования.

Ниже приводятся среды, которые можно приготовить или приобрести, однако это не означает, что они рекомендуются для терапевтического использования в рамках ВРТ.

5.3 Простое отмывание

Процедура простого отмывания позволяет получить большое количество сперматозоидов в случае хорошего качества образцов эякулята, но она не устраняет дебрис или лейкоциты, присутствующие в нем.

5.3.1 Реагенты

•BWW, EBSS, sEBSS, HTF (коммерчески доступные или см. раздел 8.4 на стр.263)илидругиепатентованныеинадлежащимобразомпротестированные и изготовленные среды, обогащенные предпочтительно сывороточным альбумином человека (HSA) или сывороткой, как описано ниже.

•HSA, высокоочищенный и свободный от вирусного, бактериального и прионного загрязнения и эндотоксинов.

•Обогащение HSA: к 50 мл среды добавьте 300 мг HSA, 1,5 мг пирувата натрия, 0,18 мл лактата натрия (60%-ный (v/v) концентрат) и 100 мг бикарбоната натрия.

•При необходимости, обогащение сывороткой (например, в случае использования описанной непатентованной среды): к 46 мл среды добавьте 4 мл термоинактивированной (при 56°C в течение 20 минут) сыворотки пациента, 1,5 мг пирувата натрия, 0,18 мл лактата натрия (60%-ный (v/v) концентрат) и 100 мг бикарбоната натрия.

186

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/