6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Руководство_ВОЗ_по_исследованию_и_обработке_эякулята

x

Бокс 7.8 Расписание процедур контроля качества		211
Бокс 7.9 Обзор методов контроля качества		211
Бокс А2.1 Вычисление силы центрифугирования		246
Бокс А3.1 Объективы		252
Бокс А5.1 Определение объема цервикальной слизи		267
Бокс А5.2 Наблюдаемый объем при микроскопии с высоким разрешением
на препарате глубиной 100 мкм		268
ТАБЛИЦЫ
Таблица 2.1	Приемлемые различия между двумя процентными значениями
	средних, определенных из двойного расчета 200 сперматозоидов
	(всего 400 подсчитанных сперматозоидов)	26
Таблица 2.2	Округленные значения стандартной ошибки (%) согласно общему
	числу подсчитанных сперматозоидов	39
Таблица 2.3	Требуемые разведения спермы, исходя из используемой камеры
	и оцениваемого поля зрения	41
Таблица 2.4	Приемлемые различия суммы, полученной двумя
	последовательными подсчетами	44
Таблица 2.5	Приемлемые различия между двумя расчетами полученной суммы:
	низкая концентрация сперматозоидов	52
Таблица 2.6	Сокращения, используемые в комментариях к вклейкам
	по морфологии 1–14	74
Таблица 2.7	Количество спермы, необходимое для проведения теста
	с иммунными шариками	116
Таблица 3.1	Подсчет индексов множественных дефектов сперматозоидов	121
Таблица 3.2	Индекс деформированности сперматозоидов (SDI),
	рассчитанный у мужчин в фертильных и бесплодных парах	122
Таблица 3.3	Определение ранга плотности пенетрации сперматозоидов	134
Таблица 3.4	Классификация результатов теста с капиллярными трубочками	135
Таблица 7.1	Коэффициенты контрольных пределов для графиков Xbar и S
	на основе среднего стандартного отклонения (Sbar)	198
Таблица 7.2	Источники вариаций (ошибок) при оценке концентрации
	сперматозоидов и возможные решения	212
Таблица 7.3	Источники вариаций (ошибок) при оценке морфологии
	сперматозоидов и возможные решения	214
Таблица 7.4	Источники вариаций (ошибок) при оценке подвижности
	сперматозоидов и возможные решения	216
Таблица 7.5	Источники вариаций (ошибок) при оценке жизнеспособности
	сперматозоидов и возможные решения	217
Таблица А1.1	Минимальные референсные значения показателей эякулята
	(5-й процентиль и 95%-й доверительный интервал)	240
Таблица А1.2	Распределение значения показателей эякулята мужчин,
	чьи половые партнерши забеременели в течение 12 мес.
	после прекращения предохранения	241
Таблица А1.3	Классификация показателей эякулята	242
Таблица А7.1	Приемлемые различия между двумя повторными подсчетами,
	исходя из полученной суммы значений	274
Таблица А.7.2	Приемлемые различия между двумя процентными значениями,
	исходя из полученного среднего значения при повторных
	расчетах 100 сперматозоидов (суммарно 200 сперматозоидов)	278
Таблица А.7.3	Приемлемые различия между двумя процентными значениями,
	исходя из полученного среднего значения при повторных расчетах
	200 сперматозоидов (суммарно 400 сперматозоидов)	278
Таблица А7.4	Приемлемые различия между двумя процентными значениями,
	исходя из полученного среднего значения при повторных расчетах
	400 сперматозоидов (суммарно 800 сперматозоидов)	279

xi

Благодарности

Данная публикация была выполнена благодаря специальной программе UNDP/UNFPA/ВОЗ/Мирового банка по исследованию, развитию и подготовке специалистов в области репродукции человека (HRP), Департаменту репродуктивного здоровья и исследований ВОЗ (RHR). Выражаем признательность

за участие в подготовке и редактировании данного Руководства следующим ученым:

Главный редактор

Dr Trevor G Cooper

Centre of Reproductive Medicine and Andrology of the University,

Mьnster, Germany

(WHO Collaborating Centre

for Research in Male Reproduction)

Редакционная коллегия

Dr John Aitken

Biological Sciences

School of Life and Environmental Sciences

University Drive

Callaghan, New South Wales, Australia

Dr Jacques Auger

Service de Biologie de la Rйproduction Pavillon Cassini Hфpital Cochin

Paris, France

Dr HW Gordon Baker

University of Melbourne

Department of Obstetrics and

Gynaecology

Royal Women’s Hospital

Carlton, Victoria, Australia

Dr Chris LR Barratt

Division of Maternal and

Child Health Sciences

The Medical School

Ninewells Hospital

Dundee, Scotland

Dr Hermann M Behre

Centre for Reproductive

Medicine and Andrology

Martin-Luther-University

Halle, Germany

Dr Lars Bjо¨rndahl

Andrology Centre,

Karolinska University Hospital

and Institute,

Stockholm, Sweden

Ms Charlene Brazil

Center for Health and the Environment University of California Davis, CA, USA

Dr Christopher De Jonge

University of Minnesota

Reproductive Medicine Center

Minneapolis, MN, USA

Dr Gustavo F Doncel

CONRAD

Department of Obstetrics and

Gynecology Eastern Virginia

Medical School

Norfolk, VA, USA

Dr Daniel Franken

Department of Obstetrics and

Gynaecology

Tygerberg Hospital

Tygerberg, South Africa

Dr Trine B Haugen

Faculty of Health Sciences

Oslo University College

Oslo, Norway

Dr Aucky Hinting

Andrology Unit,

Department of Biomedicine

School of Medicine

Airlangga University,

Surabaya, Indonesia

xii

Mr Godwin E Imade	Dr Christina CL Wang
Department of Obstetrics and Gynaecology	Harbor-UCLA Medical Center
Faculty of Medical Sciences University	Torrance, CA, USA
of Jos
Jos, Nigeria	Dr William Shu-Biu Yeung
	Department of Obstetrics and Gynaecology
Dr Thinus F Kruger	University of Hong Kong
Reproductive Biology Unit	Hong Kong SAR, China
Stellenbosch University
Tygerberg, South Africa	Секретариат ВОЗ,
	Департамент репродуктивного
Dr Hesbon O Odongo	здоровья и исследований
Department of Zoology
University of Nairobi	Dr Kirsten M Vogelsong
Nairobi, Kenya	Scientist
	Research Area Manager
Ms Elizabeth Noonan
Fred Hutchinson Cancer Research Center	Dr Sigrid von Eckardstein
Statistical Center for HIV/AIDS Research	Former Acting Research Area Manager
and Prevention
Seattle, WA, USA	Dr Michael T Mbizvo
	Director ad interim
Dr Steven M Schrader
National Institute for Occupational	Ms Maud Keizer
Safety and Health	Secretary
Centers for Disease Control and Prevention
Cincinnati, OH, USA

Также выражаем благодарность:

Cathy Treece, Charlene Tollner и профессору Jim Overstreet (Университет Калифорнии, США) за предоставление микрофотографий сперматозоидов для оценки морфологии и контрольной среды;

доктору Rune Eliasson (клиника Hospital, Стокгольм, Швеция) за помощь в оценке неспермальных клеток;

доктору Timothy Farley (ВОЗ, Женева, Швейцария) за обзор Раздела, посвященного контролю качества,

доктору Roelof Menkveld (Tygerberg Academic Hospital и University of Stellenbosch, Tygerberg, Южная Африка);

идоктору Gary N Clarke (The Royal Women’s Hospital, Карлтон, Австралия)

ипрофессору Pieter Wranz (University of Stellenbosch, Tygerberg, Южная Африка) за дополнительную информацию, используемую в Руководстве.

Благодарим Международное сообщество андрологии за финансовую поддержку.

Данное издание Руководства посвящается памяти покойного Geoffrey Waites (1928–2005), бывшего руководителя экспертной группы ВОЗ по методам оценки мужского бесплодия и одного из редакторов второго, третьего и четвертого изданий данного Руководства. Преданность редакционного комитета данной задаче обусловлена честностью, справедливостью и заботой об обездоленных Джефри

xiii

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ab	Антитело
AI	Искусственная инсеминация
AID	Искусственная инсеминация спермой донора
AIH	Искусственная инсеминация спермой мужа
ALH	Амплитуда латерального смещения головки сперматозоида
ANOVA	Анализ вариаций
APAAP	Комплекс щелочная фосфатаза — антищелочная фосфатаза
AR	Прореагировавшая акросома
ART	Вспомогательные репродуктивные технологии
ASA	Антиспермальные антитела
BAEE	N-бензол-L-аргинин этил эфир
BCF	Частота перекрестного биения (Гц)
BSA	Бычий сывороточный альбумин
BWW	Biggers, Whitten и Whittingham
CASA	Компьютерный сперманализатор
CASMA	Компьютерная морфометрия сперматозоидов
CBAVD	Конгенитальное билатеральное отсутствие vas deferens
CD	Компактный диск
CD	Цитоплазматическая капля
CD45	Кластер определения 45 (маркер лейкоцитов)
CD46	Кластер определения 46 (акросомный антиген)
CI	Доверительный интервал
CL	Доверительные пределы
CO2	Углекислый газ
DMSO	Диметил сульфоксид
DNA	ДНК
DPBS	Фосфатный буфер Дульбекко
DVD	Диск DVD
EDTA	Этиленамин тетрауксусная кислота
EQC	Внешний контроль качества
ERC	Чрезмерная резидуальная цитоплазма
FITC	Флуоресцентный изотиоцианат
FMLP	Формил-метионин-лейцин-фенилаланин
GIFT	Перенос гамет в фаллопиевы трубы
GPC	Глицерофосфохолин
H2O2	Пироксид водорода
HBSS	Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
HBV	Вирус гепатита В
hCG	Хорионический гонадотропин человека
HCV	Вирус гепатита С
HIV	Вирус иммунодефицита человека
HOP	Пенетрация ооцита хомячка
HOS	Тест на гипоосмотическое набухание
HPF	Поле высокого разрешения
HRP	Пероксидаза хрена
HSA	Сывороточный альбумин человека
HTF	Трубная жидкость человека
IB	Иммунные шарики
IBT	Тест с иммунными шариками
ICSI	Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит человека
Ig	Иммуноглобулин
IM	Неподвижные сперматозоиды
IQC	Внутренний контроль качества

xiv

IU	Международная единица
IUI	Внутриматочная инсеминация
IVF	Экстракорпоральное оплодотворение
KRM	Среда Кребса-Рингера
LIN	Линейность
LLQ	Нижний предел квантования
LPF	Поле низкого разрешения
MAD	Среднее угловое смещение
MAI	Индекс множественных аномалий
MAR	Смешанная антиглобулиновая реакция
NA	Числовая апертура
NP	Непрогрессивная подвижность
PBS	Фосфатно-буферная соль
PDCA	Планируй, делай, проверяй, исправляй
PMA	Форбол 12-миристат 13-ацетат
PMSG	Сывороточный гонадотропин беременных кобыл
PNPG	p-Нитрофенол глюкопиранозада
PR	Прогрессивная подвижность
PSA	Агглютинин Pisum sativum
QA	Обеспечение качества
QC	Контроль качества
RCF	Относительная сила центрифугирования
RI	Индекс рефракции
RNA	РНК
ROS	Свободные радикалы кислорода
r.p.m.	Обороты в минуту
SD	Стандартное отклонение
SDI	Индекс деформированности сперматозоидов
SDS	Соль додецилсульфата
SE	Стандартная ошибка
SOP	Стандартная процедура
STR	Прямолинейность (VSL/VAP)
TBS	Трис-буферная соль
TGG	Раствор Тироде
TZI	Индекс тератозооспермии
VAP	Средняя скорость пути
VCL	Криволинейная скорость
VSL	Прямолинейная скорость
WHO	Всемирная организация здравоохранения
WOB	Колебание (VAP/VCL)

Список дополнительных сокращений и обозначений (в русском издании):

АСАТ	Антиспермальные антитела
ВОЗ	Всемирная организация здравоохранения
ВРТ	Вспомогательные репродуктивные технологии
ДМСО	Диметилсульфоксид
ИКСИ	Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит

КККонтроль качества

МВР	Микроскопия с высоким разрешением
ХГЧ	Хорионический гонадотропин человека
ЧСА	Сывороточный альбумин человека
ЭКО	Экстракорпоральное оплодотворение

1

ГЛАВА 1 Предисловие

1.1 Введение

Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью было впервые опубликовано в 1980 году в ответ на все возрастающую потребность в стандартизации методов исследования эякулята человека.

С тех пор оно обновлялось три раза и было переведено на несколько языков. За прошедшие 30 лет Руководство расценивали как всемирный стандарт, его широко использовали исследовательские и клинические лаборатории по всему миру.

Несмотря на успех, стало понятно, что некоторые рекомендации из предыдущих изданий Руководства необходимо пересмотреть в свете современных данных, а некоторые концепции нуждаются в большем разъяснении и основании. Следуя этим соображениям, ВОЗ учредил редакционный совет для пересмотра всех методов, описанных в Руководстве, на предмет их актуальности и применимости. Во многих случаях это относительно трудно сделать из-за недостаточности имеющихся данных с использованием методов, описанных в Руководстве.

В некоторых случаях одна аккредитованная лаборатория получила непротиворечивые данные, однако другие не подтвердили ее данные. Для таких ситуаций редакционный совет после анализа соответствующей литературы разработал консенсусную позицию. Для получения большей информации по многим методам описаны до-

полнительные рекомендации, полученные от лабораторных работников и ученых. Отсутствие деталей в предыдущих изданиях предполагало, что некоторые лаборатории предпочитают использовать другие методы либо разработали свои собственные протоколы выполнения семиологического анализа. Для упрощения сравнения полученных результатов данное Руководство включает более подробную информацию о методах проведения анализа, а когда присутствует альтернативный метод проведения анализа, приведено разумное обоснование его включения. Когда в научных статьях публикуются результаты, при ссылке на данное руководство ВОЗ лабораториям следует указывать, какие альтернативные методы были использованы.

1.2 Пятое издание

Пятое издание состоит из трех частей: семиологический анализ (главы 2–4), методы обработки спермы (главы 5 и 6) и контроль

качества (глава 7). Часть 1, описывающая проведение семиологического анализа, подобна соответствующим главам в предыдущих изданиях, но здесь она поделена на три главы: стандартные процедуры, которые являются рутинными методами по определению качества спермы; дополнительные тесты, которые используются в определенных ситуациях либо по выбору лаборатории; и научные тесты, которые в настоящее время не признаны рутинными. Так как культивирование эякулята обычно не проводят в андрологической лаборатории, о стерильном сборе спермы указано только в соответствующем разделе. В разделе

2ГЛАВА 1 Предисловие

ометодах приготовления спермы приведено описание как работы

с эякулятом, так и со сперматозоидами, полученными из яичек и эпидидимиса. Дополнительные пояснения к методическим инструкциям перечислены под пометками «Важно» (пояснения к методу), «Комментарии» (интерпретация результатов) и «Боксы» (содержат дополнительный разъяснительный материал).

Главные особенности пятого издания перечислены ниже.

•Главы о семиологическом анализе включают описание всех рабочих растворов, процедур, расчетов и интерпретаций так, чтобы информация о применяемом методе была полной, с минимальными перекрестными ссылками на другие части Руководства.

•Раздел о подготовке спермы расширен и добавлена глава о криоконсервации сперматозоидов. Процедуры, связанные с анализом цервикальной жидкости, поделены между главой «Дополнительные тесты» и приложением о характеристиках цервикальной слизи.

•Добавлено несколько приложений по сравнению с предыдущими изданиями, они содержат узко специализированную или редко используемую информацию.

•Оценка числа сперматозоидов. Разведение спермы и области расчетных камер, используемые для оценки числа сперматозоидов в образце спермы, меняются для того, чтобы оценить 200 сперматозоидов на один расчет. Подчеркивается важность ошибки измерения и полученный численный результат. Редакторский совет считает, что суммарное количество сперматозоидов в эякуляте дает более точную оценку тестикулярной функции, чем концентрация сперматозоидов, но при точно измеренном объеме эякулята.

•Оценка азооспермии. Несмотря на внешний вид образца, при постановке диагноза азооспермия не учитывают множество факторов, включая ошибки, связанные с подсчетом небольшого числа сперматозоидов, большого числа анализируемых полей зрения и трудности в оценке осадка эякулята, содержащего клеточный дебрис. Рекомендовано включить оценку зафиксированных образцов без центрифугирования и указывать чувствительность используемого метода расчета. При этом также следует включать методы с центрифугированием, необходимые для оценки достаточного числа клеток при клинических оценках и методы определения подвижных сперматозоидов в нативных препаратах для оценки спермы после вазэктомии.

•Оценка подвижности сперматозоидов. Основное изменение по сравнению с предыдущими изданиями заключается в катего-

ризации сперматозоидов по подвижности. Здесь рекомендовано распределять сперматозоиды на следующие категории: прогрессивно подвижные, непрогрессивно подвижные и неподвижные (вместо категорий a, b, c и d).

•Оценка морфологии сперматозоидов. Некоторые лаборатории оценивают только морфологически нормальные формы, при этом другие

ГЛАВА 1 Предисловие

3

оценивают тип, локализацию и степень аномальности, что более важно. Увеличивают ли эти или другие полуколичественные методы оценки значение семиологического анализа, остается спорным. Очевидность поддержания соотношения между процентом нормальных форм (согласно строгим критериям или оценке морфологии CASA)

и процентом оплодотворения in vivo подтверждают попытки определить морфологически нормальную субпопуляцию сперматозоидов

всперме. В данное издание включено большее число и лучшего качества микрофотографий сперматозоидов, демонстрирующих нормальные и пограничные формы, приводятся пояснения, почему каждый сперматозоид отнесен к той или иной категории. Это поможет специалистам научиться распределять сперматозоиды по категориям. Недавние данные о фертильной популяции позволили определить референсные значения содержания морфологически нормальных форм сперматозоидов в сперме.

•Контроль качества. Данная глава полностью переписана. Необходим строгий контроль качества семиологического анализа с помощью серьезных аналитических методов. Для повышения качества лабораторной деятельности приведены советы и описание возможных ошибок, в случаях неудовлетворительного контроля качества.

•Референсные диапазоны и минимальные референсные значения. Данные, характеризующие качество спермы фертильных мужчин, чьи партнерши оказались беременными в течение 12 месяцев после окончания предохранения, дают диапазон референсных значений

вданном руководстве. Необработанные данные, полученные на 400–1900 образцах спермы мужчин, недавно ставших отцами

ввосьми странах на трех континентах, были положены в основу референсного диапазона. Статистическая традиция использовать 2,5-й процентиль при двухстороннем референсном интервале как порога оцениваемой величины верна для разнородной популяции. Однако односторонний референсный интервал, как показано,

вбольшей степени подходит для описания показателей эякулята,

так как высокие значения любого параметра, вероятно, не вызывают нарушение фертильности. 5-й процентиль предложен в качестве минимального референсного значения, а все показатели эякулята также приведены в Приложении 1.

1.3 Обзор руководства

Методы, описанные здесь, предназначены как рекомендации для улучшения качества проведения семиологического анализа и сравнения полученных результатов. Их не следует в обязательном порядке утверждать как стандарт для местных, национальных или мировых лабораторных учреждений. Проведение анализа эякулята может быть полезно как для клинических, так и исследовательских целей, для изучения фертильного статуса мужчин, а также для мониторинга сперматогенеза во время лечения.

ЧАСТЬ 1

Исследование эякулята человека