Блокирование

•мера по исключению взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка (т.к антитело само по себе белок).

•Блокирование неспецифичных связываний достигается помещение мембраны в разбавленный раствор белка — бычий сывороточный альбумин (BSA) или нежирное сухое молоко, с небольшим процентом детергента типа Tween 20.

•Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Поэтому, при добавлении антител, им (антителам) нет свободного места на мембране, куда бы они могли прикрепиться, кроме сайтов связывания на специфичных целевых белках.

Детекция

• Во время процесса детекции мембрана «метится» исследуемым белком с модифицированным антителом, которое связано с репортёрным ферментом

• После полоскания мембраны для удаления несвязавшихся первичных антител, мембрану выдерживают в других антителах, напрямую связывающихся с класс-специфическими участками первичных антител.

•Наиболее распространенные, связанные с пероксидазой хрена вторичные антитела

•Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который излучает в ближней инфракрасной области

•Третий альтернативный метод использует радиоактивную метку вместо фермента

Анализ

• После отмывки несвязавшихся меток, вестерн блот готов к

детекции зондов, связавшихся с целевым белком.

•Приблизительный размер вычисляют сравнивая окрашенные бэнды с маркерами молекулярной массы, добавленными при электрофорезе.

Применение

иммуноблота

•Иммуноблотинг применяется в диагностике бактерийных заболеваний, как Лайм- боррелиоз, вызываемый спирохетой Borelia burgdorferi, туберкулёз, вызываемый Mycobacterium tuberculosis.

•В диагностике заражений и инфекций вирусами, как напр. ВИЧ, коронавирус, вызывающий САРС или вирус простого герпеса (HSV).

•Можно диагностировать некоторые паразитические болезни, как финноз, вызванная личинками вооружённого солитёра, а также генетические болезни, как напр. некоторые формы анемии Фанкони.

•Возможно проведение подробного анализа антигенспецифических-IgE (АС-IgE) к различным компонентам сложных аллергенов.

Преимущества метода

•Этот метод выскочувствительный, легко выполним и не требует использования специального оборудования. Время постановки реакции занимает около 3 часов.

•Возможность хранения стрипов, содержащих антиген, при комнатной температуре, без потери активности в течении более чем одного года, что означает безопасную возможность транспортировки реагентов.

Недостатки метода.

• Классический иммуноблот – неколичественный метод. Некоторые биотехнологические компании создали наборы, которые позволяют исследователям определить количества, но это работает только с чистыми образцами одного и того же белка.

• Иммуноблот может быть выполнен только при наличии первичных антител к исследуемому белку. Хотя сейчас возможно получить

специфические антитела против многих белков, они, как правило дорогие. Если белок имеет модификации, то необходимы АТ, специфичные именно к данной модификации белка.

• Сообщается, что у данного метода довольно высок процент ложноположительных результатов.