2.4. Возможная роль пероксигенации в инвазивном росте и метастазировании неоплазм

Проблеме инвазивной и метастазирующей способности опухолевых клеток посвящено огромное количество публикаций. В числе наиболее полно обобщающих работ последнего времени привлекает внимание обзор Ровенского (1998). В нём весьма убедительно показано, что феномен инвазии и метаста-зирования опухолевых клеток является «следствием приобретения ими целого ряда фенотипических характеристик: дисрегуляция адгезивных взаимодействий клеток неоплазмы друг с другом, с нормальными клетками микроокружения и с внеклеточным матриксом; продуцирование протеолитических энзимов, разрушающих внеклеточный матрикс; приобретение клеткой локомоторного фенотипа, включающего в себя изменения морфологии и цитоскелета; индуциро-вание ангиогенеза, обеспечивающего дополнительные пути эвакуации клеток первичной опухоли». Все эти признаки определяются экспрессией различных молекул, кодируемых генами-активаторами и генами-супрессорами инвазии и (или) метастазирования, рассмотрению действия которых и посвящена работа Ровенского. Полезная информация по этим же вопросам была ранее представлена в обзорах Бобро (1992), Сологуба и соавт. (1992) и некоторых других.

2.4.1. Несмотря на огромный фактический материал, механизм инвазии и метастазирования опухолевых клеток по ряду принципиальных моментов до конца ещё не установлен. Это касается и вопроса: какая наиболее характерная для состояния активно растущих опухолевых клеток физико-химическая ситуация или особенность причастна к индукции их инвазивных свойств и как этот процесс развивается? С точки зрения комплексного и системного подходов рассмотрение проблемы инвазии и метастазирования неоплазм логично начать с того, что такие проявления как антиадгезивность, инвазивный рост и подвижность клеток имеют конкретное функциональное назначение уже в норме, когда они, естественно, ещё контролируются организмом. Речь, прежде всего, идёт об ангиогенезе, в реализации которого участвуют процессы, сходные с происходящими при экспансии инвазивных опухолей.

Некоторые примеры на этот счет такие. Индукция цитокинами экспрессии факторов транскрипции семейства Ets обнаружена в двух типах клеток: в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и только в период неоваскуляри-зации; в фиброцитах из стромы, окружающей опухоли, и только, если эти опухоли несут признаки инвазивности. Полагают, что инактивация факторов Ets существенно затормозит неоваскуляризацию и экспансию опухолей (Stehelin, 1998). Изменение фенотипа эндотелиальных клеток при ангиогенезе связано с переходом их из состояния покоя в ангиогенно-инвазивное состояние, контролируемое специальным геном HoxD3. Последний регулирует экспрессию генов эндотелиальной клетки, ассоциированную только с инвазивной стадией ангиогенеза (Boudreau et al., 1997).

Различные ростовые (PDGF, EGF, FGF) и трансформирующие (TGF-α, TGF-β) факторы, вызывающие в норме ангиогенную реакцию эндотелия, одновременно являются мотогенами, т. е. стимуляторами движения клеток. Способность же к локомоции, присущая и опухолевым клеткам, вносит существен-ный вклад в механизмы инвазивного роста (Lu et al., 1997; Ровенский, 1998). Определённые матриксные металлопротеазы (MMPs) и интегриновые рецепто-ры (см. о них ниже) ко-локализованы в кровеносных сосудах в состоянии ангиогенеза и в клетках неоплазмы. Экспрессия интегрина на поверхности клеток обеспечивает их связывание с активной формой MMP, деградацию внеклеточного матрикса (Brooks et al., 1996), что позволяет раковым клеткам внедряться в окружающую ткань, метастазировать и способствовать неоангиогенезу. Ингибиторы же MMPs могут предотвращать ангиогенез, опухолевый рост, инвазию и метастазирование (Papathoma et al., 2001; Rudek et al., 2002). Интересно также наблюдение о том, что заживление ран зависит от миграции клеток и перестройки внеклеточного матрикса – процессов, в которых участвуют различные «инвазивные» протеазы. Уровень экспрессии их генов при заживлении ран повышен (Okada et al., 1997).

Вообще же, к настоящему времени охарактеризовано более 20 различных MMPs человека, которые разделены на 4 основных подсемейства: коллагеназы, желатиназы, стромелизины и мембраносвязанные MMPs. Часть же MMPs не могла быть отнесена к этим подсемействам и выделена в отдельную группу (Хасигов и др., 2001). Продолжающиеся исследования привели к идентификации ещё 3 новых MMPs человека – ММР-21, ММР-26 и ММР-28. При этом в отношении, в частности, ММР-26 получены данные о роли её в прогрессии опухоли и ангиогенезе, причём в структуре ММР-26 обнаружен необычный мотив «цистеинового переключателя», отличающий ММР-26 от большинства других MMPs (Marchenko et al., 2001).

В поисках фундаментального внутриклеточного проинвазивного признака, контролируемого в норме и неконтролируемого при раке, было естественным вновь обратиться к основному нашему положению о необходимости умеренной гипероксии для окислительного митогенеза нормальных клеток и повышенной гипероксии для их малигнизации и функционирования в качестве неопластических. В обоих случаях окислительный стресс как-то влияет на упрощение поверхностных структур клетки, снижение её адгезивности, что необходимо хотя бы для беспрепятственного протекания процесса пролиферации клетки. Известно ведь, что при стимуляции деления нормальных клеток, вызванной различными митогенными агентами, происходит снижение межклеточных контактов, а, предположительно, «на стадии самоподдерживающего, нерегулируемого роста опухолевых клеток вступает в действие механизм, подобный тому, который уменьшает уровень межклеточных контактов при про-лиферации нормальных клеток» (Кобляков, 1998).

В связи с указанным естественно отметить, что заметное ослабление межклеточных связей происходит уже в предопухолевом периоде. Существенная роль такого феномена показана, в частности, в генезе рака желудка (Okhusa et al., 1995). В гастробиоптатах при язвенной болезни количество щелевых кон-тактов в области язвы значительно уменьшается, особенно в участках кишечной метаплазии. В раковой же опухоли они вовсе не выявляются, хотя в непора-жённых опухолью зонах слизистой число их остаётся прежним. В обзоре на эту тему (Крутовских, 2000) подтверждено, что при раке опухолевые клетки обычно не контактируют между собой и всегда изолированы от окружающей их нормальной ткани. Подавление щелевых контактов при раке может происходить различными путями, но, в основном, эпигенетически.

О том, что нарушение межклеточных связей в принципе может быть следствием установления в клетках состояния повышенной пероксигенации сви-детельствуют, например, следующие данные. Мышиные гепатоциты в течение 2-8 ч обрабатывали прооксидантами – Н₂О₂ (0,5-2,0 мМ), глюкозооксидазой (0,1 ед. активности/мл), ксантиноксидазой или паракватом (0,5-5,0 мМ). Последний стимулирует NADPH-зависимое накопление в микросомах гепатоцитов О . Указанные прооксиданты ослабляли межклеточные связи, о чём судили по уменьшению перетекания введённого микроинъекцией красителя (люциферового желтого). Различные антиоксиданты противодействовали нарушению меж-клеточных связей паракватом, а добавление в среду ингибитора каталазы (3-амино-1,2,4-триазола), наоборот, усиливало действие того же параквата (Puch, Klaunig, 1988).

4-гидрокси-2-ноненаль, образующийся в результате ПОЛ клеточных мемб-ран, оказывал при окислительном стрессе in vivo цитопатологическое действие. Он же резко ингибировал в эндотелиальных клетках аорты человека экспрессию адгезивных молекул, индуцированных вызывающим воспаление раздра-жителем (Minekura et al., 2001). Клетки гепатомы АН109А, предварительно культивируемые с гипоксантином и ксантиноксидазой, показывали высокую потенцированную АФК инвазивную способность. Инвазивное движение этих же клеток дозозависимо подавлялось куркумином – пигментом куркумы, пищевой добавкой с антиоксидантной активностью (до 5-20 мкМ) или сывороткой от крыс, потреблявших куркумин (Kozuki et al., 2001).

Различные митогены и опухолевые промоторы, включая 12-0-тетраде-каноилфорбол-13-ацетат (TPA) и форболмиристатацетат (PMA) из класса форболовых эфиров, а также эндогенный аналог TPA диацилглицерин, прямо или косвенно активируют PKC, запуская полифосфоинозитидную систему и сопряжённые с ней ферментные процессы ПОЛ в плазматической мембране, дестабилизируют элементы цитоскелета (микрофиламенты) в примембранной области (подробнее об этом см. в главе 3). TPA обратимо угнетает образование взаимных связей у клеток BALB/c в экспоненциальной фазе роста, причём от-мечена корреляция между способностью TPA угнетать межклеточные связи и стимулировать трансформацию клеток, вызванную 20-метилхолантреном (Eno-moto, Yamasaki, 1985). Дезорганизация микрофиламентов нарушает, по-види-мому, их связь с фибронектином – компонентом внеклеточного матрикса, что служит одной из причин снижения количества поверхностно-клеточного фибронектина в обработанных TPA и стимулированных к размножению клетках. В опытах на промотируемом и непромотируемом клонах мышиных эпидермальных клеток показано, что выход фибронектина из них связан именно с промоцией и может быть необходимым патогенетическим звеном при переходе промоции в трансформацию (Zerlauth, Wolf, 1985). Таким образом, опухолевые промоторы ослабляют in vitro межклеточные связи в различных клеточных системах, уменьшая число контактных зон (Rahilly, Eleming, 1992).

Как постановочный может рассматриваться и вопрос о том, что к процессу инвазии, его окислительной составляющей косвенное отношение имеет гипергомоцистеинемия, признаваемая ныне независимым фактором развития атеро-тромботических осложнений (см. п. 1.7.1.4). Как оказалось, гомоцистеин, обладающий прооксидантным действием (Сидоренко и др., 2001), при инкубации с ним эндотелиоцитов из пупочной вены человека угнетал вызванную TNF-α экспрессию на них молекулы межклеточной адгезии (ICAM-1), молекулы адгезии сосудистых клеток (VCAM-1) и адгезию клеток U-937 к эндотелиальному монослою (Stangl et al., 2001). Данные эффекты прооксиданта гомоцистеина ослабляют, очевидно, контактные свойства различных клеток, включая, пред-положительно, и неопластические.

К обсуждаемому вопросу имеет отношение и открытие «Явление усиления механистического взаимодействия эпителиальных тканей в раннем постнатальном онтогенезе, приводящее к повышению их устойчивости к развитию хронических патологий, в том числе бластомогенезу» (см. Маленков, 1988). Авторы его установили, что между силой сцепления клеток в раннем периоде жизни и вероятностью возникновения опухолей во второй половине жизни сущест-вует количественное соответствие, которое имеет обратно пропорциональную зависимость. Возникновению опухоли предшествует длительный процесс нарушения устойчивости ткани, проявляющийся в виде различных хронических воспалений, причём опухолевые промоторы различных химических классов способствуют такому нарушению, эффективно снижая силу сцепления клеток ниже пороговой величины. В частности, на примере клеток печени, легких и щитовидной железы крыс и мышей установлено, что «способность веществ снижать силу сцепления клеток в ткани ниже порога устойчивости коррелирует с их промоторной активностью, и органные специфичности этих двух эффектов совпадают» (Колотыгина и др., 1990).

Обнаруженное явление естественно использовать для профилактики рака, но в плане понимания механизма канцерогенеза ослабление клеточных контактов, как мы полагаем, всё же вторично по отношению к каким-то иным тонким внутриклеточным процессам, в том числе вышеназванным, «подготавливающим» указанное и, вероятно, другие изменения в направлении трансформации клеток в последующий период жизни. Промоторы же наряду с изменением клеточной поверхности и межклеточных контактов вызывают и многие другие эффекты, которые вместе детерминируют присущие им стимуляторно-промо-торные свойства, а при продолжительном воздействии – и сам канцерогенез (см. главу 3; Лю, Шайхутдинов, 1991).

2.4.2. Полагают, что РКС связана с цитоскелетом, как, например, в нормальных эмбриональных фибробластах крыс, концентрируясь в основном в фокальных контактах (Hyatt et al., 1990), одними из характерных компонентов которых являются белки винкулин, талин, паксиллин, тензин (см. Ровенский, 1998). Сам акт дезорганизации актиновых микрофиламентов в местах прикрепления их к плазматической мембране в норме имеет, по-видимому, регуляторный смысл, представляя один из необходимых для осуществления пролиферации и локомоции «элементарных» процессов. Помимо белков кортикального слоя фосфорилированию РКС подвергаются и некоторые белки щелевых контактов. Это показано, в частности, для белка массой 27 кД щелевых контактов крысиных гепатоцитов in vivo и in vitro. TPA и ряд других форболовых эфиров стимулировали данный процесс (Takeda et al., 1989).

Отметим и такие факты. Быстрое преходящее нарушение межклеточных контактов в культуре эндотелиальных клеток линии Т518 печени крыс под влиянием PDGF сопровождается гиперфосфорилированием белка щелевого контакта коннексина-43, и в этом процессе, как полагают (Hossain et al., 1998), участвуют РКС и другие протеинкиназы. В эпителиальных клетках лёгкого мышей, трансформированных онкогеном ras, последний нарушает межкле-точные щелевые контакты. Это происходит через PKC-зависимые механизмы, которые, однако, не изменяли содержание и фосфорилирование белка коннексина-43 (Cesen-Cummings et al., 1998). В делящихся культивируемых клетках эмбриона крысы, трансформированных вирусом SV-40, компоненты фокальных контактов FAK, паксиллин и p130^GAS фосфорилируются по серину/треонину и дефосфорилируются по тирозину. Резко ослабляются связи между компо-нентами FAK, p130^GAS и c-src, между FAK и цитоплазматическим доменом β-интегрина. Эти изменения разрывают пути передачи внутриклеточных сиг-налов, генерируемых интегринами (Yamakita et al., 1999).

Не исключено, что определенные нефагоцитирующие типы клеток способны генерировать небольшие количества О для регуляции процессов на их внешней поверхности путем воздействия на её структуры и внеклеточный матрикс. На существование такого механизма косвенно указывают пока ещё немногие данные о наличии у В-лимфоцитов, фибробластов, эндотелиальных клеток и др. NADPH-оксидазоподобного ферментативного комплекса (Jones et al., 1993; Клюбин, Гамалей, 1997), который в эффекторных клетках активиру-ется обычно РКС. Этот комплекс, как известно (Babior, 1999; Shiose, Sumimoto, 2000), осуществляет перенос электронов от NADPH с внутренней стороны плаз-матической мембраны к О₂ на наружной её стороне, при этом NADPH окисля-ется до NADP⁺, одновременно происходит одноэлектронное восстановление О₂ до О по реакции:

2 NADPH + 4 O₂ → 2 NADP⁺ + 4 О + 2 H⁺.

Целенаправленная генерация здесь активных метаболитов О₂ связана, по-види-мому, с регуляцией в норме контактных процессов на определенных стадиях клеточного цикла.

Не следует удивляться, если в указанной ситуации пероксидация, развивающаяся в плазматической мембране ростстимулированной клетки, затрагивает и липиды поверхностных образований, в частности щелевых контактов, где они играют важную структурно-функциональную роль (Malewicz et al., 1990). Вызванные таким путем дефекты в контактах ослабляют, очевидно, межклеточный транспорт и интегративные межклеточные взаимодействия. Каротино-иды кантаксантин, α- и β-каротины, ликопен, лютеин и различные ретиноиды как антиоксиданты ингибировали ПОЛ в фибробластах С3Н/10Т1/2 и улучшали межклеточное сообщение через щелевые контакты. Эффективность кароти-ноидов и ретиноидов по этому показателю коррелировала с их способнос-тью препятствовать метилхолантрен-индуцированному злокачественному росту (Hossain et al., 1989; Zhang et al., 1991).

Здесь уместно сослаться на обзор, посвящённый прикреплению ферментов, рецепторов и некоторых других белков к внешней поверхности клеточной мем-браны с помощью гликозилфосфатидилинозитной структуры (Hooper, 1997). По-видимому, в норме регуляцию (расщепление) этой связи осуществляет в определённые моменты клеточного цикла соответствующая фосфолипаза. В условиях же повышенного уровня пероксидации следует ожидать неконтролируемого нарушения заякоривания поверхностных структур, в том числе причастных к межклеточной адгезии. Сбрасывание или невозможность прикрепления таких структур к поверхности опухолевых клеток именно по указанной при-чине представляется естественным.

Сказанное особенно касается Т-кадгерина – «атипического» члена кадгеринового семейства молекул межклеточной адгезии. В отличие от других типов кадгеринов, в структуре Т-кадгерина нет трансмембранного и цитоплазматического доменов, и он связан с клеточной мембраной через гликозилфосфати-дилинозитный якорь и опосредует кальций-зависимое гомофильное взаимодействие клеток (Кудряшова и др., 2002). Однако применительно к пролиферативным и инвазивным процессам роста опухолей адгезивная функция Т-кадгери-нов (Lee S. W. et al., 1998; Takeuchi et al., 2000) должна быть хотя бы отчасти ограниченной. В указанном аспекте интересен еще один факт. Оказывается, связывание талина с β1-интегрином зависит от ассоциации талина с фосфоинозитидами, в частности, с фосфатидилинозит-4,5-дифосфатом (PIP₂). Эти данные говорят в пользу участия фосфоинозитидов в последующей сборке фокальных контактов (Martel et al., 2001), которые, следовательно, могут нарушаться в случае расщепления липидной их составляющей.

В связи с указанным обратим внимание на следующее исследование. В фос-фолипидных везикулах цитозольная PLA₂ с высокой аффинностью и специфи-чностью связывалась с PIP₂, причем увеличение аффинности связывания PIP₂ сопровождалась пропорциональным повышением активности PLA₂. Эффект PIP₂ был специфичен и значительно сильнее, чем для других фосфатидилино-зитполифосфатов. Кроме того, характер взаимодействия PIP₂ с PLA₂ сходен с взаимодействием PIP₂ с одним из доменов PLC-δ₁ (Mosior et al., 1998). Приведённые факты позволяют думать, что в норме действует ферментативный механизм нарушения фокальных контактов путём разрушения фосфатидилинозитного якоря, В патологических же условиях пероксигеназного стресса это может происходить и неферементативно, без участия фосфолипаз.

В гипероксических клетках опухоли многие из указанных выше эффектов действительно проявляются как неконтролируемые. Небезынтересны, в частно-сти, факты проинвазивного поведения форболовых эфиров и РКС в опухолевых клетках, о чем частично уже говорилось выше. Так, РКС способствует инвазивному росту клеток рака желудка и поэтому может быть объектом терапевтического воздействия, причем основную роль в инвазивности этого рака играет РКС-β, обнаруженная только в инвазивных линиях клеток рака желудка, тогда как изоформы РКС-α и РКС-γ найдены и в неинвазивных линиях. Различные специфические и неспецифические ингибиторы РКС тормозят инвазию (Schwartz et al., 1993). Например, ингибитор РКС тамоксифен при воздействии в дозах 80 нг÷2 мкг/мл в течение 3-7 сут. оказывал антипролиферативное и антиинвазивное действие на глиобластомы человека (Iwasaki et al., 1994).

На мышиных и человеческих линиях опухолевых клеток (кожа, бронхи, лёгкие) показано, что инвазивная и метастатическая способность их может возрастать, если эти клетки обрабатывали форболовым эфиром или соединени-ями, образующими свободные радикалы. Данное усиливающее действие блокировалось антиоксидантами и ингибиторами РКС. В реагрегируемых после предварительной диссоциации клетках гепатомы Новикова PMA в дозе 25 нМ противодействовал образованию щелевых контактов. Это выражалось в том, что переход красителя в течение 60 мин начала агрегации наблюдался только в 0,6 % соседних клеток, в необработанных же указанным форболом – в 72 % соседних клеток. И действительно, электронная микроскопия с заморажива-нием-скалыванием не обнаружила щелевые контакты в клетках первой группы, зато более 600 агрегированных внутримембранных компонентов щелевых контактов выявлено в клетках второй группы (Lampe, 1994).

О важной роли свободных радикалов в прогрессии неоплазм, поддержании их роста, инвазивности и метастаического потенциала, а также о значении про-моторов и РКС как регулятора инвазии опухолевых клеток в торможении опухолевой прогрессии и диссеминации в случае инактивации PKC сообщили и другие исследователи (Malins et al., 1996; Szaniawska et al., 1998). Особенно выраженные результаты получены при исследовании влияния TPA на инвазивный потенциал низко инвазивной неметастазирующей линии клеток рака молочной железы MCF-7. TPA здесь в 20 раз увеличивал подвижность и в 18 раз усиливал инвазивность этих клеток; в 100 раз повышал экспрессию и секрецию MMP-9, а также в 8 и 7 раз – индукцию урокиназного активатора плазминогена и его рецептора соответственно. Ингибитор же РКС, бриостатин-1, блокировал все эти процессы (Johnson M. D. et al., 1999). Привлекают внимание и данные о том, что высвобождение клетками AR рака молочной железы адгезионных молекул типа L1 опосредуется протеиназами из семейства дисинтегриновых металлопротеиназ ADAM. А позитивное регулирование сбрасывания L1 форбо-ловым эфиром и перванадатом, осуществляемое ими по разным механизмам, блокируется ингибиторами соответственно PKC и src-киназ. Полагают, что регуляция сбрасывания молекул L1 сцеплена с морфологией и адгезией клеток, само же высвобождение этих молекул связано со стимуляцией миграции клеток (Gutwein et al., 2000).

Судя по единичным пока публикациям, некоторые изоформы РКС, наоборот, способствуют реализации адгезивных взаимодействий клеток. Пример тому – адгезия и распластывание гладкомышечных клеток крыс при взаимодействии их с фибронектином (Haller et al., 1998). Последний быстро повышал содержание диацилглицерина, вызывал перемещение РКС-α и РКС-ε (но не других изоформ РКС) к месту адгезии, а подавление их активности ингибировало распластывание указанных клеток. По другим данным (Prekeris et al., 1998), в клетках NIH 3T3 в присутствии форболового эфира РКС-ε полной длины связывалась с F-актином в зоне клеточной адгезии. Предположительно, РКС-ε содержит гексапептидный актин-связывающий мотив, присущий только этому члену семейства протеинкиназ. При таком взаимодействии F-актин способен стимулировать фосфотрансферазную активность РКС-ε.

Весьма любопытным представляется сообщение о снижении инвазивности клеток MCF-7 рака молочной железы физиологическими дозами мелатонина (Cox et al., 1998). Данное соединение, на первый взгляд, далекое от участия в каких-либо процессах, связанных с обсуждаемой темой, действительно может быть антиинвазивным, если признать важную роль в прогрессии неоплазм кис-лородно-перекисного механизма. В этом случае указанный позитивный эффект мелатонина можно объяснить тем, что он – один из наиболее мощных эндогенных антиоксидантов. К тому же, в отличие от других внутриклеточных антиоксидантов, мелатонин присутствует во всех клеточных структурах, и его защитные действия от различных дестабилизирующих процессов пероксигенации фактически универсальны (см. Малиновская, 1998). Не менее привлекательны результаты о предотвращении инвазии другим антиоксидантом – N-ацетилцис-теином. Это соединение ингибирует активность MMPs и хемотаксис опухолевых клеток, уменьшает массу первичных опухолей и число метастазов лёгких у мышей, а также инвазивную активность клеток эндотелия в ответ на ангиогенные стимулы (Morini et al., 1999). В числе соединений, способных ингибировать инвазию и ангиогенез опухолей, указывается эпигаллокатехингаллат – главный компонент чаев, особенно зелёного (Jung, Ellis, 2001), который, по некоторым сообщениям (Zhang G. et al., 2001), оказывает антиокислительное действие.

2.4.3. Интересны, безусловно, давние сведения о том, что межклеточные связи усиливает cAMP, он же защищает клетки от дестабилизации этих контактов опухолевыми промоторами (Kanno, 1985). Выявлена также обратная корреляция между чувствительностью клеточных линий к трансформирующему действию канцерогенов и интенсивностью межклеточных связей в стадии насыщения культур. К тому же, синтез молекул адгезии и белков, формирующих щелевые контакты, оказался cAMP-зависимым. На основе этих и некоторых других фактов Канно высказал предположение о том, что интенсивность межклеточных контактов регулируется системой, состоящей из диацилглицерина и cAMP и активируемых ими соответственно PKC и PKA. Возможно, указанное свойство cAMP присуще и 8-бром-cAMP, под действием которого проницаемость межклеточных щелевых контактов (её исследовали на культуре клеток ММТ-22 опухоли молочной железы мыши с помощью красителя) возрастала вчетверо к 24 ч после начала экспозиции. В клетках увеличивалось количество щелевых контактов, при этом экспрессия мРНК белка контактов коннексина-43 и его уровень в клетках не изменялись (Atkinson et al., 1995). Привлекатеьны также данные о том, что экзогенный PGE₂, cAMP и его миметики полностью подавляют синтез MMP-9, индуцированный IL-17. Такой же эффект оказывают и противовоспалительные цитокины (Jovanovic et al., 2001)

Если исходить из указанных фактов, то сниженный уровень cAMP в стиму-лированных клетках должен затормозить cAMP-зависимый синтез молекул адгезии и образующих щелевые контакты белков. При отсутствии же митогенных стимулов и/или при воздействиях, повышающих уровень cAMP в клетке и определяющих дифференцировку, липидная пероксидация должна снижаться, а цитоскелет и поверхностные структуры клетки – восстанавливаться. При этом роль cAMP сводится не только к усилению митохондриального дыхания (снижению внутриклеточного рО₂), синтеза ATP и ATP-зависимой полимеризации элементов цитоскелета, но и к cAMP-стимулируемому синтезу молекул адгезии и белков щелевых контактов. В качестве примера можно привести здесь следующий факт. Иммуноцитохимическими исследованиями клеток I-407 (куль-тура клеток кишечника) показано увеличение экспрессии Е-кадгерина и коннексина-43 после воздействия на них форсколином, повышающим, как известно, уровень cAMP. Синтез этих «контактных» белков начинался через 2-8 ч после стимуляции и продолжался в течение 24 ч (Yuge et al., 1998).

В свете изложенных фактов и представлений логично полагать, что устойчиво повышенный уровень ПОЛ, дефицит ATP и cAMP в клетках неоплазмы создают, с одной стороны, условия для неконтролируемой их пролиферации, но, с другой, одновременно приводят к нарушению системы регуляции интегративных межклеточных взаимодействий и связей с внеклеточным матриксом. Врéменное снижение этих контактов и адгезивности у стимулированных к размножению нормальных клеток, приуроченное к определённому этапу их митотического цикла, становится характерным постоянным признаком злокачественных клеток. Данное обстоятельство могло бы играть важную роль в способности этих клеток относительно свободно мигрировать в прилежащие к ним нормальные ткани и размножаться там, проникать в кровеносные и лимфатические пути, т.е. реально определять инвазивный рост и метастазирование неоплазм. Кстати, на связь этих негативных процессов с недостаточностью дыхания и синтеза ATP в трансформированных и опухолевых клетках указывает, похоже, следующее обстоятельство. Согласно данным некоторых исследова-телей (Hotehin, Hall, 1996), малые ATPазы как члены семейства белков Rho участвуют в регуляции сборки актинового цитоскелета и мультибелковых комплексов, содержащих интегрины и опосредующих межклеточную адгезию. При дефиците ATP эта функция ATPаз, скорее всего, окажется невостребованной, а сборка цитоскелета и межклеточных контактных структур соответственно, частично или полностью, не реализованной.

С участием cAMP в рассмотренных выше внутриклеточных процессах согласуются периодически появляющиеся в литературе материалы об антиинвазивном эффекте cAMP и его аналогов. Показано, в частности, подавление инвазии клеток фибросаркомы человека аналогами cAMP. По данным этого и ряда других исследований сделан общий вывод о возможности применения веществ, увеличивающих внутриклеточную концентрацию cAMP, для умень-шения инвазивной способности и метастазирования опухолевых клеток (Okuyama et al., 1994). В дополнение к уже названным еще одним механизмом антиинвазивного действия cAMP может быть опосредуемая PKA транскрипционная репрессия, например, гена, кодирующего активатор плазминогена урокиназ-ного типа (uPA). Такой вывод сделан на основании опытов на клетках линии RC-K8, происходящих из пре-В-клеточной лимфомы человека и постоянно секретирующих в среду uPA. Добавление cAMP и PGE₁ к клеткам дозозависимо снижало накопление uPA в среде роста (Shinbo et al., 1995). Сходная ситуация может возникнуть и в связи с тем, что cAMP повышает транскрипцию ткане-вого ингибитора металлопротеиназы-2 (TIMP-2). В регуляции этого процесса участвуют транскрипционные факторы NF-Y и Sp1, связывающиеся с определёнными участками промотора TIMP-2. Поскольку cAMP не вызывает активацию MMP-2, его эффект сдвигает баланс MMP-2 – TIMP-2 в пользу TIMP-2 (Zhong et al., 2000), т. е. в сторону противодействия разрушению контактных структур клетки.

Как сенсационное видится сообщение о быстром и избирательном переме-щении мРНК и рибосом к фокальным контактам и, следовательно, возможности синтеза белков вблизи сайта восприятия сигнала и мест непосредственного их действия. Факт указанного перемещения обнаружен при изучении связывания эндотелиоцитов с внеклеточным матриксом на образование цитоскелетного компартмента, специализирующегося на транслокационном контроле, в сайте связывания интегрина. По данным авторов (Chicurel et al., 1998), «перемещение компонентов белкового синтеза в комплексы фокальных контактов зависит от способности интегринов механически сопрягать внеклеточный матрикс и сократимый цитоскелет, а также от ассоциированного натяжения и рефор-мирования актиновых структур». В случае подтверждения этого факта в не-зависимых исследованиях можно считать открытым новый тип регуляции трансляции ряда мРНК в белки интегринами и механическим натяжением. Не исключено, что таким путем, т.е. вблизи мест своей локализации, синтези-руются также белки адгезии и межклеточных контактов.

Важная роль кислородно-перекисной составляющей в механизмах инвазии и метастазирования просматривается и в следующем интересном факте. Клетки, взятые из гипоксических участков экспериментальных солидных опухолей фиб-росаркомы, карциномы и меланомы после реоксигенации, метастазировали в 1,5-3,5 раза эффективнее, чем клетки, находившиеся в аэробных условиях, причём в первом случае в клетках активировался синтез ДНК (Brown, 1990). Основным наиболее вероятным сдвигом, предопределяющим указанный феномен, является, на наш взгляд, деградация «лишних» митохондрий опухолевых клеток, как известный приспособительный акт к условиям кислородного голодания. Исходно гипероксические опухолевые клетки с ослабленным митохондриальным дыханием, оказавшись по мере роста неоплазмы в гипоксической зоне и даже лишившись еще какого-то количества митохондрий для сохранения своей жизнедеятельности, должны стать менее агрессивными. Однако после реоксигенации в указанных клетках в связи с существенно ограниченным потреблением О₂ возникает состояние относительно высокой гипероксии, причем по уровню избыточного О₂ клетки будут, очевидно, гетерогенными.

В создавшейся ситуации часть таких клеток, вероятно, подвергается окислительной деструкции и погибает, а в других реоксигенированных клетках более выражено проявляются указанные выше последствия повышенного уровня ПОЛ, дефицита ATP и cAMP, в том числе и касающиеся возрастания их инвазивной и метастазирующей активности. В принципе с этих же позиций могут быть интерпретированы и данные о снижении экспрессии гена белка щелевых контактов коннексина-32 в печени крысы в ответ на временную ишемию и последующую реперфузию отдельных участков печени (Gingalewski, De Maio, 1997), поскольку фактов изменения экспрессии различных генов при окислительном стрессе более чем достаточно (см. п. 1.1.1, 2.3.7-2.3.9).

По всей видимости, в метастазирующих опухолях уровень пероксигеназного стресса несколько выше, чем в неметастазирующих, что должно проявляться в возрастании количественно-качественных АФК-зависимых изменений многих структур опухолевых клеток. В наибольшей степени это относится к гипероксическим клеткам активного периферийного слоя неоплазмы. Частным случаем такого поведения можно считать достоверное увеличение в 2 раза частоты ОН˙-индуцированных повреждений яДНК в метастазирующих опухолях моло-чной железы женщин (по сравнению с неметастазирующими). Авторы данного исследования (Malins et al., 1996) связывают переход рака молочной железы человека в метастазирующую форму лишь с нарушениями в ДНК, вызванными радикалами ОН˙.

Указанные нарушения, конечно, могут быть причастными к формированию, например, неполноценных цитоскелетных и контактных структур, прекращая или ограничивая синтез белков клеточной адгезии и (или) активируя синтез ферментов протеолиза внеклеточного матрикса. Однако, как видно из предыдущего изложения, за расстройство интегративных межклеточных связей может быть ответственна и непосредственно сама избыточная пероксидация, развивающаяся в клеточной мембране, прямо влияя на липидные и иные компоненты поверхностных образований опухолевых клеток и на близлежащие к ним внеклеточные структуры. В этой связи любопытно, что редокс-реакции, продуцирующие АФК, являются одной из причин активации связанного и растворимого плазминогена ядерной, митохондриальной и другими субклеточными фракциями гомогенатов головного мозга и печени мышей СВА (Пыжова, Никандров, 1998). Плазминоген, активированный АФК, может быть источником плазмина – сериновой протеазы, разрушающей внеклеточный матрикс.

Таким образом, все указанные изменения так или иначе связаны с проявлением в злокачественной клетке повышенной локальной или глобальной пероксигенации. Косвенно такой вывод подтверждают данные об активировании межклеточных связей ловушками кислородных радикалов диметилсульфок-сидом и диметилтиомочевиной, которые, к тому же, в культуре гепатоцитов индуцировали и синтез коннексинов (Kojima et al., 1996). Известный антиокси-дант мелатонин (10 мкМ и 1 нМ) повышал межклеточную соединительную коммуникацию в раковых клетках линии MCF-7, в частности, усиливал транспорт родамин-дестрана между прилегающими клетками через щелевые стыки. Эти эффекты мелатонина коррелируют с его противоопухолевым действием (Cos, Fernandez, 2000).

В общем случае, возможны нарушения контактных структур, в том числе и связанных с АФК-зависимым перепрограммированием экспрессии некоторых генов (см. ниже), которые могут изменить внешнюю архитектонику опухолевой клетки в направлении, придающим ей определённое сходство с таковой у нормальных свободно перемещающихся форменных элементов крови, в частности, лейкоцитов. Поэтому неудивительно, что высказываются гипотезы об использовании негематологическими солидными опухолями для своего метастазирования механизма нормальных гранулоцитов. Речь идет о вероятной эктопической экспрессии лейкоцитарных генов в эпителиальных опухолях как о самом простом способе приобретения последними механизма своего распространения путем метастазирования. Этот же механизм может быть причиной потери противоопухолевого иммунитета у носителей неоплазм (Butler, Potter, 2001).

В связи с изложенным выше кажется неожиданным сообщение о том, что повышенная экспрессия протоонкогена bcl-2, кодирующего, как известно, антиоксидантный белок с антиапоптозной функцией (см. п. 7.1.9), усиливает метастатический потенциал опухолевых клеток (линии MCF-7, ADR), придает им бóльшую способность к миграции и инвазии и что высоко экспрессирующие bcl-2 опухоли имеют меньший латентный период появления (Del Bufalo et al., 1997). Действительно, какие-либо факты и гипотезы о возможной связи указанных событий нам не встречались, и здесь может оказаться полезной другая «неожиданная» связь, которая упоминается в п. 7.1.8. Речь идет о способности онкобелка bcl-2 ингибировать образование пор во внутренней мембране митохондрий и разобщение окислительного фосфорилирования, следствием чего должны быть снижение скорости митохондриального дыхания (потреб-ления О₂) и соответственно возрастание уровня внутриклеточного рО₂. Эти изменения, индуцированные повышенной экспрессией bcl-2, могут содейство-вать трансформации нормальных клеток и опухолевому росту (Sheets, Yeh, 1997). Вероятно, для опухолевых клеток они более чувствительны, поскольку усугубляют пероксигеназный стресс, в состоянии которого, по кислородно-перекисной концепции, эти клетки уже пребывают. По-видимому, в данной ситуации усиливаются названные выше проинвазивные и прометастатические процессы, в том числе и дестабилизирующие поверхностные структуры.

2.4.4. Нарушение межклеточной адгезии, связей с внеклеточным матрик-сом и активацию инвазивной способности клеток кислородным стрессом (Hu, Cotgreave, 1995) связывают с тем, что АФК активируют тирозинкиназу c-src (Lee et al., 1996; Griendling et al., 2000). Действительно, в опухолевых клетках этот онкобелок сверхэкспрессирован и активирован как, например, в клеточных линиях рака поджелудочной железы (Lutz et al., 1998) и ряда других типов неоплазм (см. п. 3.4), и эти проявления, скорее всего, связаны с пребыванием указанных клеток в «кислородно-перекисном» состоянии. Белок c-src снижает уровень связей между клетками и внеклеточным матриксом путём фосфорили-рования тирозина в разных белках кадгериновых и интегриновых фокальных и щелевых контактов.

По одним данным, объектом гиперфосфорилирования является белок щеле-вых контактов коннексин-43 (Rong Sing, 1994; Yamasaki, Naus, 1996), но чаще исследователи указывают на молекулы, участвующие в формировании кадгерин-опосредованных адгезивных межклеточных контактов и, в частности, на β-катенин. Последний входит в состав Е-кадгерин-катенинового комплекса, и в случае фосфорилирования катенина активированной тирозинкиназой c-src про-исходят снижение функции указанного комплекса и ослабление межклеточной адгезии (см. Ровенский, 1998). Приведенные факты подтверждаются и «обратными» экспериментами с линиями клеток мышей с измененной экспрессией киназ семейства src. В клетках, лишённых pp60^c-src, уровень фосфотирозина в фокальных контактах снижен; в тех же клетках наблюдали более быструю сбор-ку адгезивных соединений клетка - матрикс и бóльшую потребность в тирозиновой киназе фокальных контактов. Обработка клеток дикого типа агентом, ингибирующим активности указанной киназы и pp60^c-src, вызывала аккумуля-цию белка фокальных контактов тензина на периферийных участках фокаль-ной адгезии (Volberg et al., 2001).

Интересны также результаты исследования, предпринятого в связи с тем, что сверхэкспрессия c-src повышает инвазивность клеток толстой кишки, а в клетках инвазивного рака этой кишки увеличены активность src и содержание белка рецептора урокиназы. Трансфекция клеток SW480 рака толстой кишки соответствующей «src-компетентной» плазмидой привела к повышению в них активности src и экспрессии гена рецептора урокиназы, причём ингибитор src снижал содержание белка этого рецептора. Из сказанного следовало, что экс-прессия гена рецептора урокиназы регулируется src (Allgaye et al., 1999). Наконец, на причастность онкобелка src к нарушению контактного ингибирования роста, к активации пролиферации, онкогенезу и прогрессии неоплазм косвенно свидетельствуют и такие данные. Мультимерный РНК-связывающий ядерный белок Sam68, взаимодействующий с src во время митоза, в случае своего дефицита ведёт ко всем указанным эффектам src. Это согласуется с тем фактом, что, например, у вступающих в митоз фибробластов мыши уровень белка Sam68 значительно снижается (Liu K. et al., 2000). Вероятно, при недо-статочности белка Sam68 его «репрессорные» функции в отношении src становятся недейственными.

Важная роль онкобелка c-src в обсуждаемых здесь процессах нацеливает исследователей на поиск реальных стимуляторов его активности. Сомнительно, что в списке таковых присутствует только АФК (см. выше), особенно в случае обычных изменений контактных свойств в ходе митогенеза нормальной клетки. Наиболее реальными кандидатами на выполнение этой функции представляются какие-то изоформы PKC. Речь, в частности, может идти о PKC-δ. Например, в линии RBL-2H3 тучных клеток сверхэкспрессируемая PKC-δ ассоциируется с src-киназой, что приводит к стимуляции ею активности src-белка и ускорению клеточной пролиферации (Song et al., 1998). Взаимодействие такого рода определяется, вероятно, уникальным доменом src, где имеются участки связывания РКС – Ser-12 и Ser-48, которые фосфорилируются в клетках при активации РКС (Татосян, Мизенина, 2000). Пример с тучными клетками особенно интересен тем, что они, наряду с рядом других типов клеток, входят в состав рыхлой сое-динительной ткани, создающей так называемую внутреннюю среду. Для этой ткани характерно относительно большое число и разнообразие свободных клеток (см. Биол. энциклопед. словарь, 1989). Возможно, указанный выше комплекс PKC-δ – киназа src как раз и необходим для снижения уровня контактов с другими клетками, межклеточными структурами и создания условий для пребывания и функционирования во внутренней среде свободных клеток. С той же цепью событий, может быть, связано повышение проницаемости плотных контактов эпителиальных клеток линии LLC-PK₁, избыточно экспрессирующих PKC-δ (Mullin et al., 1998).

Существенную роль в приобретении опухолевыми клетками инвазивного фенотипа могут играть изменения в фосфорилировании не только катенинов, но и других цитоплазматических белков. В качестве таковых часто называют винкулин, талин и α-актинин (Glukhova et al., 1995), через которые внутриклеточный домен интегринового рецептора связывается с актиновыми филаментами цитоскелета. Дестабилизация кадгерин-опосредованных контактов может быть обусловлена действием также других тирозиновых онкобелков, например, erb-B и met (D′souza, Taylor-Papadimitriou, 1994; Vermeulen et al., 1996), и если, кроме того, задействованы трансмембранные рецепторы для иных факторов роста. Факт ослабления межклеточных связей установлен в ras-трансформированных эпителиях молочной железы человека (Kinch et al., 1995). При данном эффекте в результате повышенного фосфорилирования ряда белков (β-катенина и др.) взаимодействие их с Е-кадгерином и актиновым цитоскелетом ослабляется. Ингибиторы же тирозиновых протеинкиназ подавляют фосфорилирующее их действие и возвращают клеткам эпителиоидную морфологию.

В аспекте рассматриваемых здесь вопросов любопытны материалы о вза-аимодействии связанного со старением белка Hic-5 и киназы FAK фокального контакта (Fujita et al., 1998). Hic-5 индуцируется в ходе старения фибробластов человека, он же индуцируется Н₂О₂. Структурно Hic-5 гомологичен цитоскелетному белку паксиллину. Связываясь своим N-концевым доменом с киназой FAK, Nic-5 локализуется C-концевыми доменами в фокальных контактах. Его сверхэкспрессия ведет к ослаблению фосфорилирования паксиллина по тирози-ну, что можно рассматривать как составную часть общего механизма расстрой-ства контактных структур и передачи сигнала при старении и канцерогенезе.

Инвазии может способствовать такой прооксидант как пероксинитрит, сти-мулируя некоторые MMPs и, кроме того, инактивируя тканевый ингибитор этих MMPs (Okamoto et al., 1997). Как было установлено позднее (Okamoto et al., 2001), активация разных типов MMPs и деструкция матрикса при окислительном стрессе, индуцируемом пероксинитритом, происходит с участием GSH. В присутствии последнего активируются, в частности, проMMP-1, -8 и -9, причём из потенциальных продуктов реакции пероксинитрита с GSH только S-нитро-глутатион вызывает активацию указанных проMMPs. Данный механизм окислительной активации MMPs рассматривается авторами работы лишь в аспекте окислительного повреждения ткани при воспалении. Можно предполагать, однако, что указанные эффекты пероксинитрита реализуется опосредованно через увеличение концентрации АФК, например, путём инактивации им цитохромоксидазы (Sharpe, Cooper, 1998; Halliwell, Gutteridge, 1999) и митохондриальной Mn-SOD (McMillan-Grow et al., 1998; Quijano, Radi, 1998; Murphy, 1999).

К генной экспрессии MMPs причастны медиаторы воспаления IL-1 и TNF-α (Esteve et al., 1998), причем этот процесс опосредуется NO, генерируемым индуцибельной синтетазой NO. Такой факт установлен на примере суставных хондроцитов кролика, которые под действием IL-1 увеличивали выход жела-тиназы 32 кД и казеиназы 57 кД, а ингибитор NO подавлял экспрессию мРНК MMPs (Sasaki et al., 1998). Сходные данные получены при стимуляции хондроцитов крупного рогатого скота IL-1β, приводившей к образованию АФК и продукции NO. Кроме того, здесь наблюдали значительное уменьшение антиок-сидантами индуцированной IL-1 экспрессии гена коллагеназы и протоонкогена c-fos, а также частичное подавление ингибитором синтетазы NO экспрессии коллагеназы. Эти факты, к тому же, определили принципиальный вывод, сог-ласно которому освобождающиеся под влиянием IL-1β АФК могут играть роль вторичных мессенджеров, передающих внеклеточные стимулы в ядро и, таким образом, причастных к экспрессии генов (Lo et al., 1998).

Подтверждением сказанному служат и такие данные. УФ-облучение фибробластов кожи приводит к активации экспрессии в них MMP-1 и MMP-3 – уровень мРНК их возрастал в 6 и 3,8 раза соответственно. Эта активация связана с образованием при облучении АФК, в том числе гидроксильных радикалов, индуцирующих экспрессию транскрипционных факторов (c-jun и др.), которые контролируют экспрессию генов MMP-1 и MMP-3 (Brenneisen et al., 1998). На причастность к экспрессии различных MMP цитокинов, факторов роста, АФК и некоторых воздействий, перепрограммирующих геном, указывают и ряд других исследователей (Galis, 1999; Wenk et al., 1999). К примеру, введение в клетки HepG2 соответствующего антисмыслового олигонуклеотида не только подав-ляло экспрессию коннексина-26 и зависимую от него экспрессию Е-кадгерина, но и увеличивало активность ММР-9 и инвазию клеток в опытах in vitro (Yano, Yamasaki, 2001).

Небезынтересен и следующий факт. Антитела к интегрину α₅β₁ вызывают разрушение структуры актинового цитоскелета, индукцию экспрессии коллагеназы-1 и реорганизацию формы клеток (показано на примере синовиальных фибробластов кролика). Данный эффект опосредуется через GTP-связывающий белок Rac1 – нижеследующую мишень интегрина и воспроизводится при активации Rac радикалами О₂, также приводящей к экспрессии коллагеназы через ряд промежуточных процессов (Kheradmand et al., 1998). Таким образом, в сложном механизме деградации внеклеточного матрикса назван ещё один возможный путь расстройства этой структуры с участием АФК. Следует, однако, признать, что результаты отдельных исследований не согласуются с АФК-зависимым механизмом нарушения межклеточных связей. Об этом свидетельствует, например, последовательность процессов: цитокин TNF-α → генерация АФК в эндотелиальных клетках легочной артерии человека → активация фактора транскрипции NF-kB → экспрессия генов Е-селектина (Rahmaan et al., 1998). Последний, как известно, является трансмембранной молекулой межклеточной адгезии и его синтез в данном случае приводил бы не к расстройству межклеточных связей, а, наоборот, к их установлению. Возможно, это как-то связано с влиянием на указанные процессы онкобелка р53, отсутствием в его поведении «логики». Сообщается, что р53 может контролировать экспрессию генов прямо противоположного действия, например, активирующих и блокирующих процесс метастазирования (Sun et al., 1999).

В общем случае реакции клеток, подобные указанным, могут, по-видимому, означать, что уже в норме протекание пролиферативных и деструктивных процессов связано с окислительной дестабилизацией соответствующей ткани, включая устранение межклеточных контактных структур с помощью MMP и протеаз других классов. Эти действия направлены, очевидно, к тому, чтобы на определённых этапах облегчить протекание процессов окислительного митогенеза и/или поклеточного разрушения. Ряд фактов действительно говорит о том, что изначально MMPs появились для выполнения определённых позитивных функций. Например, заживление ран, которое зависит от миграции клеток и перестройки внеклеточного матрикса, ассоциировано с повышением уровня экспрессии 6 генов MMPs, в том числе генов коллагеназы-3, желатиназ А и В, MMP-1 (Okada et al., 1997). С другой стороны, известно, что нормальная клетка может размножаться только после распластывания (Васильев, 1986). С этих позиций понятно, почему, например, пролиферативная активность и способность к деградации внеклеточного матрикса в нейрональных клеточных линиях находятся в обратной корреляции. Такой вывод сделан по итогам наблюдения: глиальные и нейрональные клетки с высокой экспрессией MMPs отличались низким временем удвоения своей популяции, и наоборот (Thier et al., 1997).

Изложенные выше соображения о причинах ослабления межклеточного сцепления при окислительном митогенезе в норме и пероксигеназном стрессе в случае канцерогенеза отчасти представлены нами в виде упрощенных функциональных схем (рис. 14 и 15). Первая из них отражает ферментативно управляемый преходящий процесс изменения контактных свойств нормальной пролиферирующей клетки, а вторая – дефектность того же процесса, с чем и связывается способность опухолевой клетки к инвазивному росту и метастазированию. Указанные схемы пока предварительны. На них не показаны, например, сигнальные пути «АФК → активация онкогена src → фосфорилирование белков контактных структур» и «АФК → активация факторов транскрип-ции → экспрессия проинвазивных протеаз» и некоторые другие.

В целом важное значение недефектных молекулярных механизмов клеточной адгезии для нормального функционирования клетки бесспорно. Устойчивое же их нарушение не только приводит к определённым локальным сдвигам и негативным частным проявлениям, о которых говорилось выше, но и само входит составной частью в более серьёзные, глобальные механизмы патологии, например, в «программу» генетической предрасположенности соответствующих клеток к спонтанной опухолевой трансформации. Можно сослаться здесь на интересные факты Тумановой и Ямсковой (1995) о принципиальном различии в биологическом действии на адгезию гепатоцитов макромолекулярных адгезионных факторов из печени мышей СВА с генетической предрасположенностью к спонтанному гепатобластомогенезу и мышей С57В1, устойчивых по этому признаку. Различное действие указанных факторов, представляющих со-бой комплекс фосфогликопептидов с мол. м. 20-40 кД и гликозаминогликанов,

Опухолевые промоторы и другие стимуляторы роста

Активация полифосфоинозитидной сигнальной системы, ПКС и ферментативного ПОЛ в плазматической мембране

Падение активности фосфолипидозависимой аденилатциклазы и концентрации сАМР

Временное расстройство внеклеточного матрикса и межклеточных контактов – условия для нормального беспрепятственно циклически протекающего митогенеза

Фосфорилирование PKC

белков кортикального

слоя

Снижение интенсивности cAMP-зависимого митохондриального дыхания

Дестабилизация цитоскелета в примембранной области

Уменьшение концентрации АТР и АТР-зависимой полимеризации микрофиламентов

Ослабление трансмембранной связи поверхностных структур (фибронектина и др.) с цитоскелетом

Снижение сАМР-зависимого синтеза «адгезивных» молекул и белков щелевых контактов

Рис.14. Возможный механизм участия в норме полифосфоинозитидной и аденилатциклазной систем в регуляции межклеточного сцепления

Ослабление интегративных межклеточных контактов, снижение силы сцепления клеток – изменения, способствующие возникновению, инвазивному росту и метастазированию неоплазм

Пониженные интенсивность митохондриального дыхания и скорость утилизации О₂ в предопухолевой и неопластической клетках

Внутриклеточная гипероксия, повышенный уровень ПОЛ в мембранах митохондрий, плазматической мембране и других мембранных структурах

Дефицит AТP

Снижение ATP-зависимой полимеризации микрофиламентов

Инактивация фосфолипидозависимой аденилатциклазы

Дестабилизация цитоскелета в примембранной области

Уменьшение концентрации cAMP

Падение зависимого от cAMP синтеза «адгезивных» молекул и белков щелевых контактов

ПОЛ поверхностных образований (щелевых контактов и др.)

Нарушение трансмембранной связи поверхностных структур (фибронектина и др.) с цитоскелетом

Рис.15. Предполагаемая связь способности опухолевой клетки к инвазии и метастазированию с переходом ее в состояние стойкой повышенной пероксигенации

Канцерогенные воздействия

Возрастание напряжения О₂ в межклеточном и околокаппилярном пространстве

связано с тем, что у мышей СВА нарушены процессы их гликозилирования, что является, как считают авторы, «причиной изменения пространственно-функци-ональной организации адгезионного сайта гепатоцитов». Этими же исследователями сформулировано положение о том, что нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии при генетической предрасположенности ткани к спонтанной малигнизации происходит задолго до образования неоплазм и является ключевым моментом в процессах бластомогенеза (Туманова и др., 1996).

2.4.5. Эффективность метастазирования зависит от характеристик как са-мих циркулирующих опухолевых клеток, так и их микроокружения в органах, в которые они внедрились. Механизмы, детерминирующие оседание одиночной опухолевой клетки и развитие из неё метастазов, во многом остаются ещё неясными. В то же время очевидно, что возможность свершения этих процессов будет определяться результатами взаимодействия метастазирующих клеток с микроокружением по месту их новой дислокации. По нашему мнению, обсуждение данного вопроса с учётом некоторых положений кислородно-перекисной концепции канцерогенеза должно быть достаточно плодотворным.

Напомним, что активно растущие участки неоплазмы гипероксичны и могут секретировать, в частности, АФК, продукты ПОЛ, ингибиторы дыхания и другие вещества. Выход их в общий кровоток и распространение по всему организму, с одной стороны, и транспорт различных антиоксидантов, глюкозы, азотистых соединений в неоплазму из отдалённых тканей, с другой, изменяют метаболизм в этих тканях по типу опухолевого (см. главу 6). Подобный обмен веществ отражается прежде всего на кровеносной системе, которая в качестве посредника первой воспринимает действие переносимых соединений. Растущая опухоль как «генератор» агрессивных окисляющих веществ влияет на форменные элементы крови и лимфы и обеспечиваемые ими гомеостатические системы организма. В аспекте же рассматриваемого в данном параграфе вопроса об условиях зарождения метастазов наиболее существенными представляются негативные изменения в стенках сосудов и повышение тромбогенного потенциала крови, обусловленные интенсификацией в них пероксидативных процессов и, несомненно, влияющие на результативность метастазирования.

Указанные выше опухолевая интоксикация и обмен веществ между нео-плазмой той или иной локализации и нормальными тканями организма при-водят к снижению в последних интенсивности митохондриального дыхания, содержания ATP и повышению уровня свободнорадикального ПОЛ (Мороз-кина, 1989). В сосудистой стенке, являющейся одним из регуляторов системы гемостаза данное обстоятельство коррелирует с нарушением в ней синтеза и секреции этих регуляторов. В частности, известно, что перекиси липидов инактивируют простациклинсинтетазу и синтез эндотелием кровеносных сосудов простациклина – эндогенного ингибитора агрегации тромбоцитов (см. п. 1.7.1.4 и рис. 8). Подтверждая другие данные на этот счёт, Балуда с соавт. (1992) показали, что у онкологических больных угнетены синтез и освобождение в кровь простациклина, антитромбина III (основного антикоагулянта крови) и актива-тора плазминогена. Снижение антитромбогенной (антиагрегационной и антикоагулянтной) активности стенки сосудов в равной степени наблюдалось при различной локализации опухолей. Аналогичные эффекты были зафиксированы у животных при росте перевитой им опухоли РА-2. Отмечено также повыше-ние чувствительности тромбоцитов животных-опухоленосителей к индукторам агрегации. Авторы данного исследования правомерно считают указанные изменения звеном патогенеза метастазирования злокачественного роста.

Действительно, взаимодействие опухолевых клеток с трансформирован-ными в сторону снижения антитромбогенной активности сосудистой стенкой и компонентами системы гемостаза должно быть важным моментом в формировании очагов будущих метастазов, а по некоторым данным (Warren, 1981) – вообще играет центральную роль в метастазировании. Наиболее очевидна роль пристеночного тромбообразования для фиксации метастазирующих клеток в кровеносном русле (Петик и др., 1999). Естественно поэтому, что восстановле-ние антиагрегационной активности стенки сосудов приводит к снижению частоты метастазирования у животных-опухоленосителей, поскольку блокирует взаимодействие онкогенно-тромбогенного эмбола с эндотелием сосудов и соответственно уменьшает риск возникновения вторичного очага опухолевого роста (Любина и др., 1996). В аспекте вышеизложенного неудивительна обобщённая ранее информация о том, что «тромбоциты оказывают влияние на все этапы развития гематогенных метастазов – от первоначального оседания и адгезии опухолевых клеток к стенке сосудов до их взаимодействия с эндотелием и субэндотелиальным матриксом» (Редченко и др., 1994).

По кислородно-перекисной концепции, для успешного локального приживления опухолевой клетки и начала роста метастаза необходимо наличие дисбаланса ∆_К (ПО – АО) на уровне, соответствующем неравенству (см. п. 1.1.2)

∆_П (ПО – АО) < ∆_К (ПО – АО) < ∆_Ц (ПО – АО),

а точнее, с учётом условий для апоптозов, – неравенству (см. п. 7.1.1)

∆_А1 (ПО – АО) < ∆_К (ПО – АО) < ∆_А2 (ПО – АО)

Мы полагаем, что данное условие в прикрепляющейся к стенке сосуда опухолевой клетке может поддерживаться за счёт свойственной её внутриклеточной гипероксии, а также внешними по отношению к ней прооксидантами в стенке и русле сосуда, уровень которых, как отмечалось уже, повышен в организме опу-холеносителя. Необходимость соответствующего пероксигеназного состояния для образования метастазов подтверждается, например, результатами работы Шмалько и Смирнова (1991). В опытах на мышах линии C57BL/6 с карциномой Льюис и кроликах с карциномой Брауна-Пирс здесь исследовали влияние синтетических антиоксидантов на состав фосфолипидов и уровень ПОЛ в паренхиме и кровеносных сосудах лёгких. Было установлено, что антиоксиданты при использовании их в оптимальных дозах на этапе, предшествующем возникновению метастазов, проявляют выраженный антиметастатический эффект, препятствуя активации ПОЛ и нарушениям фосфолипидного спектра.

Следует, однако, иметь в виду, что из немалого числа гематогенно цир-кулирующих в организме опухолевых клеток, лишь единичные дают начало метастазам. Связано это, очевидно, с присутствием в организме различных противометастатических факторов. Одной из причин указанного феномена мо-жет быть то обстоятельство, что из-за неравномерности протекания процессов достаточные пероксигеназные и тромбогенные условия для «пленения» опухолевых клеток и последующего их размножения создаются, по-видимому, лишь в немногих участках органных капилляров. При этом приживляемость метастатических клеток зависит также от каких-то признаков их тканевой специфичности, определяющих органотропность этих клеток. Например, причастными к избирательной адгезии метастатических клеток могут быть специфичные эндогенные лектины (углеводсвязывающие белки-рецепторы) их плазматической мембраны, которые как и лектины нормальных клеток выполняют функции узнавания, взаимодействия с клетками и внеклеточными структурами микроокружения, клетками других систем организма (Глузман и др., 1992).

Описан также 2-стадийных процесс прикрепления циркулирующих опухолевых клеток к поверхности сосудистого эндотелия. Так, Ровенский (1998) со ссылкой на известные работы (Honn, Tang, 1992; Bevilacqua, 1993) отмечает: начальная стадия избирательной адгезии путём взаимного «распознавания» углеводных цепей на поверхности опухолевых клеток и эндотелия сосудов органа-мишени обеспечивает лишь слабое сцепление, но оно вскоре несколько усиливается вследствие активации эндотелия тромбином и различными цитокинами, которые индуцируют экспрессию молекул селектинов Е и Р межклеточной адгезии; на 2-й стадии контакт между опухолевыми клетками и эндотелием упрочняется за счёт экспрессии последним других молекул адгезии – ICAM-1 и VCAM-1 из семейства иммуноглобулинов. В том случае, когда из отдельных прикрепившихся опухолевых клеток всё же образуются метастатические узлы, дальнейший рост их может остановиться, если они будут лишены неоваскуляризации. Реально же такого ограничения, по-видимому, нет, так как в крови онкобольных, например, раком лёгкого (Takigawa et al., 1998) повышен уровень VEGF – одного из самых сильных индукторов роста клеток эндотелия. Избыточное содержание VEGF в циркулирующей по всему организму крови должно, очевидно, способствовать росту метастазов путём их васкуляризации.

Значительное противодействие возникновению очагов метастаза оказывают факторы, вызывающие окислительный цитолиз циркулирующих одиночных опухолевых клеток. Таковыми являются прежде всего иммунные факторы, в частности макрофаги и естественные клетки-киллеры (NK-клетки). В этой связи представляется интересным исследование, в котором изучали механизм пов-реждения опухолевых клеток в капиллярах альвеол лёгких (Weiss et al., 1988). Здесь обнаружено, что большинство опухолевых клеток погибает в системе лёгочной микроциркуляции. Причиной их гибели названы изменение давления в капиллярах в процессе дыхания, сдавливание стенками капилляра клеток опухоли и разрушение их поверхностной мембраны. Не менее реальным нам кажется другое объяснение: опухолевые клетки повреждаются не в результате действия неадекватных механических усилий, а вследствие кислородной интоксикации (окислительного цитолиза). Факторами, инициирующими лизис, являются высокое рО₂ в альвеолах и секретируемые лёгочными макрофагами АФК. Определённые типы опухолевых клеток, будучи адаптированы к этим пероксидантным условиям путём длительного селективного отбора, в принципе могут успешно противостоять кислородной интоксикации.

В целом «макрофагальный» путь предотвращения метастазов в опухолевом организме не является достаточно надёжным, так как и он подвержен негативным изменениям. В процессе метастазирования в макрофагах и NK-клетках нарушается метаболизм аденозина, снижается продукция АФК по механизмам, рассмотренным нами в п. 2.3.10. Считают, что изменение функциональной ак-тивности макрофагов предшествует появлению метастатических узлов, а одно из условий успешного развития процесса метастазирования наряду с другими факторами – раннее нарушение функционирования в организме системы макрофагов (Балицкий и др., 1991).

В заключение отметим весьма любопытную интригующую гипотезу о молчащих метастазах, возникшую в связи с фактами спонтанного ревертирования клеток некоторых опухолей (карцином JB6, PDV и ранее описанных сарком) к неопухолеродному фенотипу (Лавровский, Субханкулова, 1998). Через 1-5 мес. непрерывного пассирования in vitro ревертанты вновь становились трансформированными, что подтверждалось и в экспериментах in vivo, когда развитие опухолей из ревертантных клеток сарком, привитых сингенным животным, соответствовало по времени вторичной трансформации ревертантов in vitro. По этим фактам исследователи высказали предположение о том, что «во многих опухолях соединительнотканного и эпителиального происхождения, по-види-мому, присутствуют молчащие ревертантные клетки, которые могут быть причиной молчащих метастазов и поздних рецидивов опухоли у человека и животных. Высокая частота реверсий и нестабильность фенотипа ревертантов говорят об эпигенетическом характере этих процессов».

Понимание причин рассмотренных в данной и ряде других работ (Noda, 1993; Sun et al., 1996) прямых и обратных реверсий на молекулярном уровне сейчас затруднительно. Но можно догадываться, например, о том, что в гетерогенных клетках неоплазмы в ходе постепенной адаптации к пероксигеназным условиям отдельные элементы их антиоксидантной системы повышают свою эффективность, и некоторые из таких клеток «нормализуются». При возникновении же новых условий, приводящих опять к возрастанию АФК и дисбаланса ∆ (ПО – АО) и зависимым от них изменениям экспрессии генов, в том числе протоонкогенов (см. п. 1.1.1, 2.3.7-2.3.9), эти клетки могут ревертировать обратно в прежнее трансформированное состояние. Не исключено, что рассматриваемые реверсии связаны, прежде всего, с адаптивной вариацией количества и качества митохондрий и места их локализации в клетке как наиболее значимой составляющей её антиоксидантной системы. Рост числа функционально полноценных митохондрий и преимущественное расположение их в периферийной зоне клетки – признак высокой активности антикислородной ступени защиты, важное условие для снижения внутриклеточных рО₂ и ПОЛ и, следовательно, для антиканцерогенеза. Уменьшение же числа митохондрий и/или скопление их в околоядерной зоне, где эти органеллы считаются относительно примитивными, слабодифференцированными (см. п. 3.6.1), должно приводить к обратному эффекту.

В целом рассмотренная в настоящем параграфе роль пероксигеназных процессов в инвазивном росте и метастазировании неоплазм представляется достаточно обоснованной. С этих же позиций данный проблемный вопрос вкратце изложен и в нашей недавней статье (Лю и др., 2002).