2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Mikrobiologia_

Проточная цитометрия

Изотермальная микрокалориметрия

Экспресс-метод лазерной флуоресцентный спектроскопии

Молекулярно-генетические методы (секвенирование генома и ПЦР)

РУТИННЫЕ МЕТОДЫ:

Диско-диффузионный метод

Метод серийных разведений в жидких и плотных питательных средах

Е-тест

ДИСКО-ДИФУЗИОННЫЙ МЕТОД.

При данном методе градиент концентрации АБ в питательной среде создается в результате его диффузии из носителя, которым является бумажный диск, пропитанный раствором АБ. Образование зоны подавления роста вокруг диска происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратимо пропорциональна МПК.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста МО измеряют с помощью линейки. Отсутствие этой зоны указывает на устойчивость исследуемой культуры к данному АБ.

Качественный (полукачественный) – результатом является отношение МО к одной из категорий чувствительности:

▪Чувствительный

▪Промежуточный

▪Резистентный

МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ

Основан на определении минимальной концентрации АБ, подавляющей рост исследуемого МО (МПК – минимальная подавляющая концентрация)

С этой целью готовят серию разведений АБ в жидкой или плотной питательной среде, которые затем засевают культурой исследуемого МО. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста

Е-ТЕСТ

Представляет собой узкую полоску полимера, на которой нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). При подавлении роста МО вокруг полоски Е-теста образуется каплевидная зона. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю.

Определение результатов рутинных тестов проводят визуально или с использованием автоматизированных систем определения АБ-чувствительности:

Прибор для автоматического измерения зон задержки роста бактерий

Vitek 2 compact – автоматизированный бактериологический анализатор для идентификации и определения АБ-чувствительности широкого спектра МО.

MALDI-TOF MS

В основе метода лежит ионизация исследуемого материала, позволяющая в присутствии особого вещества матрицы под воздействием лазера ионизировать биологические молекулы: белки, пептиды, ДНК, сахара, аминонуклеотиды и др.

Матрица обеспечивает передачу энергии лазером молекулам исследуемого объекта, переводя их в газовую форму, после чего ионизированные молекулы ускоряются в электрическом поле и достигают детектора.

Время прохождения расстояния (пролета) от точки ионизации до детектора обратно пропорциональна массе ионов => на основании скорости движения ионов можно рассчитывать массу частиц присутствующих в исследуемом материале.

Применение:

Идентификация МО по масс-спектру рибосомальных белков

Белковое профилирование сывороточных и тканевых биомаркеров

Генотипирование единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP)

Антибиотикорезистентность

Генетический риск развития заболеваний человека

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ

Это метод регистрации оптических параметров клеток или частиц по сигналам светорассеяния и флуоресценции в режиме поштучного анализа, при этом можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце, получить представление о размерах и структуре клетки.

ИЗОТЕРМАЛЬНАЯ МИКРОКАЛОРИМЕТРИЯ

Количественное определение бактерий методом микрокалориметрии основано на установленной зависимости между количеством выделяемого тепла и количеством биомассы.

Метод позволяет быстро оценить численность клеток – чем меньше бактерий определяется, тем эффект действия антибиотиков выше.

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ЛАЗЕРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

Это спектроскопический метод, в котором атом или молекула возбуждаются лазерным лучом с последующим спонтанным излучением – флуоресценцией

Показателем мощности флуоресценции, ее амплитуда и спектр являются индикатором качественного и количественного состава микрофлоры, т.е. позволяют оценить наличие и активность МО в исследуемом биологическом объекте.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Методы основаны на прямой детекции генов, кодирующих детерминанты устойчивости к антибактериальным препаратам. Эти методы являются крайне перспективными.

25. β-лактамные антибиотики. Классы, механизмы действия. Защищенные β- лактамы

β-лактамные антибиотики.

Основу их молекулы составляет β-лактамное кольцо.

Препараты этой группы характеризуются самой высокой избирательностью действия: они убивают бактерии и не оказывают влияния на клетки микроорганизма, так как последние не имеют главного компонента клеточной стенки бактерий — пептидогликана. В связи с этим β -лактамные антибиотики являются наименее токсичными для макроорганизма;

К ним относятся пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы.

Входящее в состав их молекул бета-лактамное кольцо и обеспечивает выраженный бактерицидный эффект, который проявляется блокированием синтеза элементов клеточной стенки возбудителя.

Однако многие бактерии умеют вырабатывать специальный фермент, который нарушает строение кольца, тем самым лишая антибиотик его главного оружия. Именно поэтому использование в лечении препаратов, не имеющих защиты от бета-лактамаз, неэффективно.

Сейчас все большее распространение получают антибиотики бета-лактамной группы, защищенные от действия бактериального фермента. В их состав включают вещества,

блокирующие синтез бета-лактамаз, например, клавулоновую кислоту. Именно так создаются защищенные бета-лактамные антибиотики (такие как "Амоксиклав"). К другим ингибиторам бактериального фермента относятся "Сульбактам" и "Тазобактам".

ПЕНИЦИЛЛИНЫ

Пенициллины содержат β-лактамное кольцо, соединённое с пятичленным циклом.

Различают природные и полусинтетические пенициллины:

Природные пенициллины выделены из соответствующих источников. Различают: бензилпенициллин (в виде натриевой или калиевой соли), новокаиновая соль бензилпенициллина + бензатина бензилпенициллин (так называемое депо препарата), феноксиметилпенициллин (является кислотоустойчивым).

Полусинтетические пенициллины делятся на несколько групп:

-антистафилококковые (оксациллин) – эффективны в отношении S. руоgenes;

-расширенного спектра (ампициллин, амоксициллин);

-антисинегнойные, которые делятся на 2 группы:

-ингибиторозащищённые пенициллины – комбинация какого-либо пенициллина с ингибитором β-лактамаз.

Классическим примером является комбинация амоксициллина и клавулановой кислоты

Механизм действия: пенициллины, как и все β-лактамные антибиотики, нарушают синтез клеточной стенки:

В синтезе КС участвует фермент, состоящий из 2-х доменов, соединённых линкером: транспептидаза, которая строит пептидные фрагменты пептидогликана, и гликозилтрансфераза, которая соединяет N- ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовую кислоту. Именно данный фермент ингибируют пенициллины. Таким образом, пенициллины оказывают бактерицидное действие.

Спектр действия: по спектру действия распределим все пенициллины на 3 группы (спектр действия увеличивается сверху вниз):

I.Узкого спектра действия:

-антистафилококковые пенициллины – устойчивы к действию стафилококковых β-лактамаз;

-антисинегнойные – активны в отношении Pseudomonas aeruginosa;

II. Природные пенициллины активны в отношении следующих микроорганизмов: грамположительные кокки (стрептококки, стафилококки), грамотрицательные кокки (нейссерии), палочки (дифтерийная, сибирская язва), спорообразующие анаэробы (клостридии), неспорообразующие анаэробы (пептострептококки) и спирохеты (бледная трепонема, боррелии);

III. Пенициллины расширенного спектра. Активны в отношении гемофильной палочки, представителей сем.

Enterobacteriaceae (E. coli, Ptoteus spp., Shigella spp., Salmonella spp.) + те микроорганизмы, которые были перечислены для природных пенициллинов. Кроме того, амоксициллин активен в отношении Helicobacter pylori и используется для её эрадикации.

ЦЕФАЛОСПОРИНЫ

Это β-лактамные антибиотики, которые очень похожи по структуре на пенициллины, но само β- лактамное кольцо соединено с 6-членным циклом.

Механизм действия цефалоспоринов ничем не отличается от действия пенициллинов.

Касательно спектра действует очень простое правило: чем больше поколение, тем шире спектр:

-1-е поколение – антибиотики активны в основном в отношении грамположительных кокков;

-2-е поколение – антибиотики практически похожи на цефалоспорины первого поколения, однако активны также в отношении представителей семейства Enterobacteriaceae (клебсиеллы, кишечная палочки, протеи, шигеллы, сальмонеллы и т.д.);

-3-е поколение – к спектру действия добавляется гемофильная палочка, а также два препарата – цефтазидим и цефоперазон – активны в отношении синегной палочки. Устойчивы к действию β-лактамаз;

-4-е поколение – эти антибиотики прекрасно проходят через ГЭБ (гемато-энцефалический барьер), легко проникают через клеточную стенку грамотрицательных бактерий (активны в отношении синегнойной палочки), выше активность в отношении кокков. Очень устойчивы к действию β-лактамаз, поэтому часто используются при лечении внутрибольничных инфекций;

-5-е поколение – антибиотики показали хорошее действие против MRSA-штаммов (метициллиноустойчивых золотистых стафилококков) и VRSA-штаммов (ванкомицинустойчивых золотистых стафилококков).

КАРБАПЕНЕМЫ

Наиболее важные препараты этой группы – имипенем, меропенем

Из всех β-лактамов имеют самый широкий спектр:

активны в отношении большинства грамположительных бактерий (кроме MRSA и MRSE);

анаэробы (кроме Clostridium difficile);

большинство грамотрицательный бактерий

Очень устойчивы к действию β-лактамаз

МОНОБАКТАМЫ

Наиболее важным препаратом является АЗТРЕОНАМ.

Узкий спектр действия (активность в отношении грамотрицательных бактерий)

Устойчивы к действию β-лактамаз

26.Антибиотики – ингибиторы синтеза белка, классы.

Подавляющие белковый синтез.

Нарушение синтеза белка может происходить за счет блокирования связывания транспортной т-РНК с

различными субъединицами рибосом (30S - аминогликозиды, 50S - макролиды) или с и-РНК (на 30S

субъединице рибосом на всех уровнях, начиная с процесса считывания информации с ДНК и кончая взаимодействием с рибосомами. Поэтому эта группа антибиотиков самая многочисленная.

Это и аминогликозиды, и макролиды, и тетрациклины, и хлорамфеникол (левомицетин), нарушающий синтез белка микробной клеткой на стадии переноса аминокислот на рибосомы. При этом интересно отметить, что аминогликозид гентамицин, угнетая белковый синтез в бактериальной клетке, способен нарушать синтез белковой оболочки вирусов, и поэтому может иметь противовирусное действие.

Прежде всего ещё раз отметим, что к антибиотикам, нарушающим синтез бактериального белка, относятся:

-макролиды;

-тетрациклины;

-аминогликозиды;

-линкозамиды;

-левомицетины

МАКРОЛИДЫ

Механизм действия макролидов связан с тем, что они связываются с 50S субъединицей рибосом, таким образом нарушается прохождение мРНК вдоль рибосомы.

У макролидов преимущественно бактериостатический тип действия.

Макролиды могут применяться в отношении следующих микроорганизмов:

Гр (+) кокки;

Haemophilus influenze;

Bordetella pertussis;

Corynebacterium diphtheriae;

Campylobacter spp.;

Helicobacter pylori;

M. avium (однако макролиды не используются для лечения туберкулёза. Данный возбудитель в принципе не вызывает туберкулёз у человека, и ситуация контаминации им возможна лишь в очень ослабленном организме, при этом часто возникает ВИЧ-инфекция, когда и приемлемо использовать данный антибиотик);

Toxoplasma gondii (используется спирамицин);

спирохеты (терапия сифилиса).

ЛИНКОЗАМИДЫ

Наиболее важным препаратором является природное вещество линкомицин и хлорированный полусинтетический дериват – клиндамицин.

Механизм действия аналогичен макролидам.

Спектр действия макролидов достаточно узок:

грамположительные кокки;

неспорообразующие анаэробы

ЛЕВОМИЦЕТИНЫ

Наиболее важным антибиотиком здесь является хлорамфеникол, который, подобно макролидам и линкозамидам, блокирует 50S субъединицу рибосом

Тип действия – статический, достаточно широкий спектр:

Гр (+) кокки;

Гр (-) кокки;

палочки (гемофильная, кишечная, сальмонеллы, шигеллы, дифтерийная палочка);

спирохеты;

риккетсии;

актиномицеты;

споро- и неспорообразующие анаэробы

ТЕТРАЦИКЛИНЫ

Это крупномолекулярные антибиотики, в молекуле которых присутствуют 4 цикла, что и лежит в основе названия

Тип действия антибиотиков – статический

Механизм действия антибиотиков связывают с их способностью связываться с 30S-субъединицей рибосом, при этом нарушается синтез белковой молекулы

Фармакокинетика. Важным аспектном применения тетрациклинов является изучение их фармакокинетики:

При пероральном приёме данные антибиотики хорошо абсорбируются в кишечнике, их биодоступность 85-90%. На всасывание очень сильно влияет параллельный приём пищи: молоко за счёт кальция, препараты железа, препараты цинка, антациды (за счёт магния, алюминия) существенно снижают целевую концентрацию тетрациклинов в плазме

Поскольку тетрациклины являются высоколипофильными веществами, они распределяются во многие ткани и органы, особенно хорошо кровоснабжаемые: печень, почки, селезёнка, костный мозг

Легко проникают через ГЭБ, плацентарный барьер, при этом попадают в грудное молоко

Выводятся в основном почками, некоторая часть выводится с желчью

27. Микоплазмы. Строение, биологические особенности

28. Хламидии. Строение, биологические особенности; классификация. Взаимодействие с клеткой-мишенью