2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая медицинская микробиология

Функции жгутиков:

1.Обеспечивают адгезию — начальную стадию инфекционного процесса.

2.Обеспечивают подвижность бактерий.

3.Определяют антигенную специфичность, это Н-антиген.

Выявление жгутиков:

1.ФКМ нативных препаратов («раздавленной» и «висячей» капли). Микроскопически подвижность определяют у клеток суточной культуры. Для того чтобы отличить подвижность от пассивного броуновского движения, к капле исследуемой культуры добавляют каплю 5%-ного водного раствора фенола, активное движение в этом случае прекращается.

2.ТПМ нативных препаратов.

3.Световая микроскопия окрашенных красителями или металлами препаратов. Из-за того что жгутики очень легко повреждаются при приготовлении препарата, в повседневной практике эти методы используется редко.

Для окраски жгутиков используют клетки, выращенные на скошенном агаре. Бактериальной петлей отбирают клетки, находящиеся у конденсационной воды и осторожно переносят в стерильную дистиллированную воду такой же температуры, что и температура инкубирования бактерий на скошенном агаре, а бактерии с петли не стряхивают, а осторожно погружают в воду. Пробирку с бактериями оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Используют химически чистое (вымытое в хромовой смеси) стекло, на которое наносят 2–3 капли суспензии. Суспензию распределяют по поверхности стекла, осторожно его наклоняя. Высушивают препарат на воздухе.

Жгутики очень тонкие, поэтому их можно обнаружить только при специальной обработке. Вначале при помощи протравки достигается разбухание и увеличение их размера, а затем производится окраска препарата, благодаря чему они становятся видимыми при световой микроскопии.

Чаще используют метод серебрения по Морозову (рис. 10):

– препарат фиксируют раствором ледяной уксусной кислоты 1 мин, промывают водой;

– наносят раствор танина (дубящий, делающий жгутики более плотными) на

1мин, промывают водой;

–подогревая, обрабатывают препарат импрегнирующим раствором азотнокислого серебра 1–2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

При микроскопии видны темно-коричневые клетки и более светлые жгутики.

4. Электронная микроскопия препаратов, напыленных тяжелыми металлами (рис. 11).

30

Рис. 10. Выявление жгутиков	Рис. 11. Выявление жгутиков
методом серебрения	методом электронной микроскопии

5. Косвенно — по характеру роста бактерий при посеве в полужидкий 0,3%-ный агар. После инкубирования посевов в термостате в течение 1–2 сут отмечают характер роста бактерий:

–у неподвижных бактерий (например, S. saprophyticus) наблюдается рост по ходу укола — «гвоздь», а среда прозрачна;

–у подвижных бактерий (например, Е. со1i) наблюдается рост в стороны от укола, по всему столбику агара — «елочка», и диффузное помутнение среды.

ФИМБРИИ (ПИЛИ)

Строение. К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также фимбрии (син.: пили, реснички, ворсинки) — жесткие прямые нити из белка пилина, локализованые на КС. Фимбрии короче и тоньше жгутиков: их диаметр 3–20 нм, длина 0,2–10,0 мкм.

Фимбрии — необязательная клеточная структура, т. к. и без них бактерии хорошо растут и размножаются. В отличие от жгутиков, фимбрии не выполняют двигательную функцию и обнаружены у подвижных и неподвижных форм. По своему функциональному назначению фимбрии подразделяются на 2 типа. Термин «фимбрии» чаще используется для обозначения общих пили, а термин «пили» — для обозначения секс-пили.

Фимбрии 1-го (общего) типа имеются у большинства бактерий. Они покрывают всю поверхность клетки, располагаются перитрихиально или полярно. Количество фимбрий велико — от нескольких сотен до нескольких тысяч на одну бактериальную клетку. Синтез фимбрий контролируется бактериальной хромосомой, утрата фимбрий приводит к их новому синтезу.

Покрывая всю клетку, фимбрии создают ворсистую поверхность (рис. 12, 13). Иногда фимбрии сливаются в комки, придавая неопрятный вид клетке; в других случаях поверхность клеток покрыта войлокообразным чехлом, состоящим из сплетений тонких нитей.

Рис. 12. Палочковидная бактерия с фим-	Рис. 13. Кокки с фимбриями (увел.
бриями (увел. × 15 000)	× 12 000)

Пили 2-го типа (син.: конъюгативные, половые, секс-пили) образуются только мужскими клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды

31

(F, R, Col), в ограниченном количестве (1–4 на клетку), имеют терминальные вздутия.

Функции фимбрий:

1. Фимбрии обоих типов:

–обладают антигенной активностью;

–на них адсорбируются бактериофаги (специфические вирусы бактерий). 2. Фимбрии 1-го типа:

–выполняют адгезивную функцию: обеспечивают прикрепление бактерий

кклеткам слизистых оболочек организма хозяина и к другим субстратам (клеткам растений, грибов, неорганическим частицам и органическим остаткам);

–осуществляют механическую защиту бактериальной клетки. Придают бактериям свойство гидрофобности и способствуют объединению клеток в группы;

–увеличивают всасывательную поверхность клетки бактерий, участвуют в процессах питания, водно-солевого обмена и в транспорте метаболитов.

3. Половые пили: обеспечивают конъюгацию — передачу части генетического материала от донорской клетки к реципиентной.

Выявление фимбрий: электронная микроскопия.

КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА

Строение. КС — важный и обязательный структурный элемент подавляющего большинства бактериальных клеток (кроме микоплазм). КС покрывает всю поверхность бактериальной клетки. Она располагается под капсулой или слизистым чехлом, у бескапсульных клеток — непосредственно контактирует с окружающей средой (рис. 14).

Рис. 14. Схема взаиморасположения внешних слоев клетки бактерий:

1 — ЦПМ; 2 — КС; 3 — микрокапсула; 4 — капсула; 5 — слизистый слой

На долю КС приходится 5–50 % сухого вещества клетки, количество материала КС увеличивается с возрастом.

Пептидогликан (муреин, мукопептид) образует опорный скелет бактериальной клетки, составляет основу КС и специфичен только для бактерий. ПГ

32

имеет структуру молекулярной сети, благодаря двум типам связей — гликозидным и пептидным.

Цепочки ПГ расположены параллельно. Каждая цепочка образована чередующимися остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенными между собой β-1,4-гликозидными связями (рис. 15).

В молекуле ПГ есть два набора пептидных цепочек — боковые и поперечные (рис. 16).

К N-ацетилмурамовой кислоте присоединен короткий пептидный хвост из четырех аминокислот (тетрапептид). Тетрапептид состоит из чередующихся L- и D-аминокислот (рис. 17). Аминокислоты, участвующие в образовании пептидных связей, варьируют у разных видов бактерий.

Рис. 15. Гликозидные связи соединяют N-аце-	Рис. 16. Два набора пептидных цепочек в
тилглюкозамин (G) и N-ацетилмурамовую ки-	молекуле ПГ
слоту (M) в молекуле ПГ

Рис. 17. Структура повторяющейся единицы ПГ КС:

1, 2 — места полимеризации гликанового остова молекулы; 3 — место присоединения с помощью фосфодиэфирной связи молекулы ТК в КС Гр+ бактерий; 4, 5 — места связывания гликановых цепей с помощью межпептидных связей; 6 — место ковалентного связывания с липопротеином наружной мембраны у Гр– бактерий; 7 — место действия лизоцима

Принципиальное значение для пространственной организации ПГ имеет высокое содержание аминокислот с двумя аминогруппами. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей, причем вторые аминогруппы — в формировании межпептидных связей между гетерополимерными цепочками.

В большинстве случаев в образовании межпептидной связи участвует карбоксильная группа D-аланина одного тетрапептида и свободная аминогруппа диаминокислоты другого (рис. 18, а). Иногда связь между тетрапептидами разных гликановых цепей осуществляется с помощью других аминокислот (например, глицина у S. aureus) (рис. 18, б).

а

б

Рис. 18. Межпептидные мостики между гетерополимерными цепочками:

а — у E. coli; б — у S. aureus: Г — N–ацетилглюкозамин; М — N-ацетилмурамовая кислота; ала — аланин; глу — глутаминовая кислота; лиз — лизин; мезо-ДАП-мезодиаминопимелино- вая кислота; гли — глицин. Стрелками обозначено место действия пенициллина

Частота «сшивок» гетерополимерных цепей различна, поскольку не все пептидные хвосты участвуют в формировании межцепочечных связей. Часть пептидных хвостов находится в свободном состоянии.

В КС бактерий содержатся структуры и вещества, которых нет у человека, животных и растений:

–N-ацетилглюкозамин;

–N-ацетилмурамовая кислота;

–мезо-диаминопимиелиновая кислота;

–D-аланин;

–D-глутаминовая кислота.

Это мишени, используемые врачами в борьбе с инфекцией, т. к. некоторые лекарственные препараты действуют только на КС бактерий, и не затрагивают эукариотических клеток высших организмов.

На ПГ откладываются и его инкрустируют различные вещества. По строению ПГ и по содержанию других веществ в КС грамположительных бактерии отличаются от грамотрицательных. Химический состав и строение КС постоян-

34

ны для определенного вида и являются важным признаком. В зависимости от строения КС бактерии делятся на две большие группы: грамположительные (Грам+) и грамотрицательные (Грам–) (рис. 19).

Рис. 19. Схема строения КС у Грам+ и Грам– бактерий

Особенности КС Грам+ бактерий:

1.Мощная и толстая, в зависимости от вида бактерий толщиной 20–60 нм (в 2–3 раза толще, чем у Грам– бактерий).

2.Основную часть массы КС составляет ПГ (40–90 %).

3.ПГ многослойный (10 слоев).

4.У Грам+ бактерий обнаружено более 100 различных химических типов ПГ. Большинство различий относится к структуре тетрапептида. В образовании боковых пептидных связей у Грам+ бактерий участвует L-лизин, а межпептидной связи — другие аминокислоты.

5.ПГ ковалентно связан с тейхоевыми кислотами (ТК) (от греч. teichos — стенка). ТК — полимерные цепи, состоящие из 8–50 остатков рибита (пятиатомного спирта) или глицерина (трехатомного спирта), остатки соединены между собой фосфодиэфирными связями. Длинные линейные молекулы ТК могут пронизывать весь ПГ-слой, достигая внешней поверхности КС. В этом случае они являются основными антигенами Грам+ бактерий. Свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают ТК свойства полианиона и определяют поверхностный заряд клетки. Углеводные компоненты ТК входят в состав клеточных рецепторов для бактериофагов. Липотейхоевые кислоты фиксированы в мембране липофильными концами.

6.Нет липополисахаридов (ЛПС), содержится небольшое количество по-

лисахаридов, липидов и белков; полисахариды и липиды ковалентно связываются

смакромолекулами КС; белки формируют на внешней поверхности КС отдельный слой.

35

7.КС плотно прилегает к ЦПМ, нет периплазматического пространства.

8.Грам+ бактерии чувствительны к пенициллину и лизоциму. Пенициллин разрушает межпепдидные связи, а лизоцим — гликозидные связи.

Таким образом, основными компонентами КС Грам+ бактерий являются три типа макромолекул: пептидогликаны, тейхоевые кислоты и полисахариды, которые с помощью ковалентных связей образуют сложную структуру с упорядоченной пространственной организацией (рис. 20, а).

	а	б

Рис. 20. Строение КС:

а — у Грам+ бактерий; б — у Грам– бактерий

Особенности КС Грам– бактерий:

1.Значительно (в 2–3 раза) тоньше, чем у Грам+, ее толщина 10–20 нм.

2.Содержание ПГ значительно меньше, чем у Грам+ бактерий, и состав-

ляет в зависимости от вида бактерий 5–10 % сухой массы КС.

3.ПГ однослойный или двуслойный, толщиной 2–3 нм.

4.У всех Грам– бактерий строение ПГ одинаково. В образовании боковых пептидных связей у Грам– бактерий участвует мезо-диаминопимиелиновая кислота. В образовании межпептидной связи участвуют мезо-диаминопимиелино- вая кислота и D-аланин.

5.ПГ не содержит ТК.

6.ПГ неплотно прилегает к ЦПМ. Только у Грам– бактерий между ЦПМ

иПГ КС есть периплазматическое пространство. Тонкий ПГ соединен белками с наружной мембраной.

7.КС многослойная, сверху ПГ только у Грам– бактерий находится наружная мембрана (НМ) толщиной 8–10 нм. Она оставляет до 80 % сухой массы КС. НМ по строению сходна с внутренней ЦПМ и состоит из липопротеина (ЛП), ЛПС, фосфолипидов и белков.

Основной компонент НМ — билипидный слой: внутренний слой образован ЛП, а наружный — ЛПС. ЛП, ЛПС и другие липиды связаны ковалентно, ЛП ориентированы липофильными концами наружу.

ЛПС занимает 30–40 % поверхности НМ и состоит из трех компонентов:

– липида А, который «заякоривает» ЛПС в НМ, содержит глюкозамин и жирные кислоты, придает токсичность ЛПС и является одним из основных фак-

36

торов патогенности. Токсические свойства проявляются преимущественно при разрушении бактериальных клеток;

–кор-слоя (лат. core — ядро), одинакового для всех Грам– бактерий, наиболее постоянной частью которого является кетодезоксиоктоновая кислота;

–О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями. Она определяет антигенную специфичность, т. е. серовар определенного штамма бактерий, является О-антигеном. Например, в серологических реакцих было идентифицировано более 1000 сероваров сальмонелл. Определение сероваров бактерий имеет большое значение в бактериологической диагностике и в расшифровке эпидемий (позволяет установить источник инфекции). Полисахаридные цепи дают бактериям преимущества в процессе отбора. Огромное разнообразие полисахаридных цепей объясняется отбором новых мутантных типов О-антигенов, которые дают преимущество, т. к. хозяин не может обладать антителами против всех антигенов одновременно.

Много различных белков локализовано в НМ Грам– бактерий. Белки НМ делят на основные и минорные. Основные белки (почти 80 % всех белков НМ) представлены небольшим числом различных видов. Это трансмембранные бел- ки-порины, формирующие в мембране гидрофильные поры диаметром примерно 1 нм, через которые проходят вода и гидрофильные низкомолекулярные вещества до 7 кД (сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды). Минорные белки НМ представлены гораздо большим числом видов. Их основные функции — транспортная (специфический транспорт в клетку железосодержащих соединений) и рецепторная.

8. Грам– бактерии менее чувствительны к пенициллину и лизоциму, чем Грам+.

Таким образом, у Грам– бактерий строение КС намного сложнее, чем у Грам+ (рис. 20, б). В ее состав входит большее число разных химических макромолекул (табл. 3, 4).

		Таблица 3
	Различия между Грам+ и Грам– бактериями
Признак	Грам+	Грам–
Толщина КС, нм	20–60	10–20
% содержание ПГ	40–90	5–10
Структура ПГ	Многослойный (10 слоев).	Однослойный или двуслойный.
	Аминосахара (N-ацетилглю-	Аминосахара (N-ацетилглюкозамин
	козамин и N-ацетилмурамовая	и N-ацетилмурамовая кислота) свя-
	кислота) связаны гликозидными	заны гликозидными связями в гете-
	связями в гетерополимерную	рополимерную цепочку.
	цепочку.	Ацетилмурамовые кислоты глика-
	Ацетилмурамовые кислоты гли-	новых цепей связаны между собой
	кановых цепей связаны между	единичными связями через два од-
	собой множественными связями	нотипных тетрапептида
	через тетрапептиды разного
	строения
Наличие ТК	Присутствует	Отсутствует
Наличие периплазма-	Отсутствует	Присутствует
тического простран-

37

ства между ЦПМ и ПГ

							Окончание табл. 3
Признак		Грам+					Грам–
Наличие НМ	Отсутствует				Присутствует
Выделение ферментов	В окружающую среду				В периплазматическое пространство
Окраска по Граму	Темно-фиолетовые				Розово-красные
Представители	Патогенные кокки, кроме гоно-				Энтеробактерии, вибрионы, трепо-
	кокка и менингококка, бациллы,				немы
	клостридии
Спорообразование	Присутствует у бацилл и кло-				Отсутствует
	стридий
							Таблица 4
Химический состав КС Грам+ и Грам– бактерий
Компоненты КС		Грам+ бактерии			Грам– бактерии
				внутренний слой (ПГ)			внешний слой (НМ)
Пептидогликан		+			+		–
Тейхоевые кислоты		+			–		–
Полисахариды		+			–		+
Белки		±			–		+
Липиды		±			–		+
Липополисахариды		–			–		+
Липопротеины		–			±		+

Примечание: (–) — отсутствуют, (+) — присутствуют, (±) — присутствуют не у всех видов.

Функции клеточной стенки:

1. Обеспечивает механическую защиту от воздействий окружающей среды. Концентрация осмотически активных веществ (сахаров и солей) в клетке

намного выше, чем в окружающей среде. Поэтому в клетке существует высокое осмотическое давление (у некоторых бактерий оно достигает 30 атмосфер). КС сдерживает это давление, предохраняет клетку от осмотического лизиса и дает возможность существовать ей в гипотонических растворах. Если повысить осмотическое давление внешней среды (например, путем добавления сахаров), вода будет оттягиваться из клетки.

2.Формообразующая. КС у бактерий не жесткая, как стальной панцирь, а эластичная, как кожаная покрышка футбольного мяча. Ригидность (упругость) и эластичность КС обеспечивает внутренний ПГ-слой.

3.Транспортная: обеспечивает проникновение питательных веществ в клетку и удаление из нее продуктов метаболизма. КС проницаема для солей и других низкомолекулярных соединений благодаря наличию в НМ каналов (пор) для пассивного транспорта веществ и ионов, необходимых клетке. НМ также препятствует проникновению в клетку токсических веществ, поэтому Грам– бактерии (по сравнению с Грам+ бактериями) более устойчивы к действию некоторых ядов, химических веществ, ферментов и антибиотиков.

4.Содержит родо- и видоспецифические антигены (ЛПС Грам– бакте-

рий, ТК Грам+ бактерий).

38

5.У патогенных бактерий оказывает повреждающее действие на организм и индуцирует иммунный ответ.

6.Несет на поверхности разнообразные рецепторы, в т. ч. к фагам и бактериоцинам.

7.Участвует в процессе деления.

8.Обеспечивает межклеточные взаимодействия между бактериями при конъюгации, а также между патогенными бактериями и тканями высших организмов.

Выявление клеточной стенки:

1.Окраска по Граму (предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом). Результат окраски бактерий методом Грама зависит от структуры и химического состава КС. Вид окраски по Граму — важный таксономический признак, с которым коррелируют другие свойства бактерий.

Техника окраски по Граму:

– на фиксированный мазок через фильтровальную бумагу наливают основной краситель — карболово-спиртовой раствор кристаллического фиолетового (генцианвиолет) на 1–2 мин, бумажку снимают, препарат промывают водой (тонкие препараты можно не промывать);

– обрабатывают мазок раствором Люголя 1 мин до почернения;

– клетки дифференцируют, обрабатывая 96° этиловым спиртом в течение 30–60 с (препарат погружают несколько раз в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек с мазка либо спирт наливают на препарат и слегка покачивают препарат). Обработка спиртом вызывает сужение пор в ПГ и тем самым задерживает краску в КС;

– промывают водой;

– окрашивают контрастным красителем водным фуксином (либо нейтральным красным, сафранином) 1–2 мин;

– промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсионной системой.

Грам+ бактерии в своем составе имеют рибонуклеат магния, который после взаимодействия с йодом образует прочный комплекс с генцианвиолетом. Этот комплекс нерастворим в воде, плохо растворим в спирте, поэтому после обработки спиртом Грам+ бактерии остаются темно-фиолетовыми.

У Грам– бактерий рибонуклеата магния мало, после взаимодействия с йодом комплекс не образуется и генцианвиолет вымывается спиртом из микробной клетки. Последняя затем окрашивается дополнительным красителем фуксином в розово-красный цвет (рис. 21).

39