Питательные среды и их характеристика
Бактерии (за исключением облигатных внутриклеточньхх паразитов -риккетсий и хламидий) культивируются, как правило, на искусственных питательных средах.
Питательной средой называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, применяемые для размножения микробов в бактериологических лабораториях. Для получения хорошего и быстрого роста они должны отвечать следующим требованиям;
1. Содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества.
2. Иметь оптимальную рН среды для роста данного вида бактерий. Большинство патогенных для человека микроорганизмов растут при нейтральной рН среды (7,2 -7,8).
3. Должны быть изотоничными, для этого к ним добавляют 0,9% по концентрации хлорида натрия (Nad).
4. Иметь достаточную влажность, т.к. при усыхании повышается концентрация солей, тормозящих рост бактерий.
5. Быть стерильными, не содержать посторонней микрофлоры.
Питательные среды различают по консистенции, происхождению и назначению.
По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие и твердые. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких-либо веществ, как правило, мясной воды. Для получения плотных сред к жидким добавляют уплотнители, чаще всего агар-агар. Он представляет собой полисахарид сложного состава, имеющий волокнистую структуру, получаемый из морских водорослей. Агар-агар плавится при температуре около 90 °С и затвердевает при температуре около 40 °С. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агар-агара (0,3-0,7%). В плотных средах концентрация агар-агара составляет 1,5-3.0%.
По происхождению питательные среды делят на естественные и искусственные. Естественные среды готовят из молока, мяса. яиц, картофеля, сыворотки крови человека, животных и др продуктов. В практической бактериологии чаще используют искусственные питательные среды, представляющие собой сбалансированные смеси питательных веществ в концентрациях и сочетаниях, необходимых для роста и размножения микроорганизмов. В них в качестве универсального источника азота и углерода используют пептоны - продукты неполного расщепления белков с помощью пепсина или различные гидролизаты (рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.).
По назначению питательные среды делятся на следующие основные категории.
Основные (универсальные) - среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий. К ним относятся мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА). МПБ готовят на основе мясной воды с добавлением 1% пептона и 0,5% NaCl. Для получения МПА к мясо-пептонному бульону добавляют 2-3% агар-агара.
Специальные среды, используют для получения роста прихотливых бактерий, не растущих или очень плохо растущих на основных питательных средах. Специальные питательные среды (кровяные, сывороточные, асцитические, сахарные и т.д.) приготавливают путем добавления к МПБ или МПА: крови (5-10%), сыворотки (10-20%). асцитической жидкости (25-30%), углеводов (0,5-1%), глицерина (2-5%).
Кровяной агар используют для выделения стрептококков, сывороточный - для получения роста менингококков и гонококков. На среде КУА (казеиново-угольный агар) выделяют бордетеллы, а на среде Левенштейна-Иенсена - микобактерии.
К специальным тканевым средам относят среды Китта-Тароцци и среду Аристовского-Гельтцера. Первая - содержит мясо-пептонный бульон 0,5% глюкозы и кусочки печени или мясного фарша. Вторая - кроличью сыворотку и кусочки мозга кролика. Эти среды применяются для культивирования анаэробных бактерий. Перед посевом среды прогревают в водяной бане в течение 10-15 мин для удаления воздуха. После посева среды заливают слоем вазелинового масла или парафином с целью изоляции от атмосферного воздуха.
Элективные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микробов определенного вида из материалов, содержащих разнообразную микрофлору. Принципы действия элективных сред основываются на:
1. Опережении роста определенного вида микроба по сравнению с сопутствующей флорой. Например: на среде Ру (свернутая лошадиная сыворотка) и среде Леффлера (1 часть лошадиной сыворотки и 3 части сахарного бульона) возбудитель дифтерии образует видимый рост через 4-6 часов, остальные бактерии через 18-24 часа.
2. Добавлении веществ, ингибирующих рост сопутствующей микрофлоры. Например: на среде ЖСА (желточно-солевой агар), содержащей до 9% NaCl. культивируют стафилококки, рост же других бактерий столь высокое содержание соли подавляет. Пептонная вода (рН 8.4) используется для выращивания холерного вибриона, т.к сдвиг рН среды в щелочную сторону не влияет на рост данного вида микроба. Добавление желчи в среду Рапопорт ингибирует рост большинства бактерий, но не влияет на выделение сальмонелл.
Дифференциально-диагностические - среды, позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям. В состав данных сред входит:
1. Основная питательная среда (МПБ или МПА).
2. Определенный химический субстрат (например, углевод), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба.
3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции.
К дифференциально-диагностическим средам относятся среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса и многие другие.
Среда Эндо состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и индикатора (основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия). Свежеприготовленная среда имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий (эшерихий) их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском. Лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные колонии.
Среда Плоскирева (содержащая МПА. лактозу и индикатор -нейтральный красный) является не только дифференциально-диагностической, но и селективной, так как подавляет рост сопутствующих микробов за счет содержания бриллиантовой зелени, солей желчных кислот и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (сальмонелл, шигелл).
Среды Гисса состоят из 1% пептонной воды. 0,5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н. растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Свежеприготовленная среда имеет слегка желтьй оттенок. При разложении углеводов она приобретает красный цвет.
Синтетические - среды строго определенного состава, представляющие собой растворы неорганических и органических соединений, обеспечивающих азотистое, углеродное и минеральное питание микроорганизмов. Например: среда Сотона для культивирования туберкулезных микобактерий. Среда 199, среда Игл для культур клеток.
В настоящее время в бактериологических лабораториях широко используют сухие питательные среды, выпускаемые промышленностью. Они представляют собой гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде. Данные среды имеют постоянный состав, их просто готовить и удобно транспортировать.
Культуральные свойства бактерий
Культуральные свойства бактерий характеризуют их питательные потребности, условия и характер роста на твердых и жидких питательных средах В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида микроба питательные среды должны содержать соответствующие питательные вещества (об этом было подробно сказано выше). Для роста и размножения микроорганизмов важную роль также играют температурные условия. По отношению к температурному оптимуму все бактерии делят на 3 группы: психофилы, мезофилы и термофилы. Подавляющее большинство патогенных микроорганизмов относится к мезофилам, их температурный оптимум составляет 34-37 °С.
Для выращивания микробов используют специальный прибор -термостат. Это железный шкаф с двойными стенками, в котором поддерживается постоянная температура при помощи терморегулятора.
Посевы в большинстве случаев помещают в термостат на 18-24 часа. Некоторые микроорганизмы растут 4-6-8 часов (холерный вибрион, коринебактерии дифтерии на соответствующих элективных питательных средах), другие вырастают через несколько дней (бордетеллы, лептоспиры и др.) и даже через 1-3 месяца (микобактерий туберкулеза).
Появление видимого роста на питательных средах определяется временем генерации, т.е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, состава питательной среды, рН, температуры, аэрации и других факторов. В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется в довольно широких пределах: от 20 минут у кишечной палочки до 14 часов у микобактерий туберкулеза, в связи с чем видимый рост образуется через 18-20 часов, либо через 3-5 недель соответственно.
На жидких питательных средах бактерии могут образовывать следующие формы роста:
1) равномерное помутнение и осадок на дне - большинство патогенных бактерий:
2) пленку на поверхности среды - холерный вибрион, коринебактерии дифтерии, микобактерий туберкулеза и др.:
3) пленку с отходящими в глубь среды нитями (сталактиты) - возбудитель чумы:
4) «придонно-пристеночный» рост - стрептококки:
5) рост в виде «комочка ваты» - сибиреязвенная палочка.
На плотных средах бактериальные клетки, фиксированные на поверхности среды, образуют макроскопические скопления (колонии) бактерий одного вида. выросших в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток.
Колонии разных видов бактерий отличаются по размерам, форме, поверхности, консистенции, окраске и др. Все эти признаки, как правило, видоспецифичны. поэтому они имеют важное диагностическое значение, т.е. их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.
Размеры колоний варьируют от десятых долей - до 5-6 мм. Различают точечные (колонии с диаметром не более 1 мм), средние (размером 2-4 мм). крупные (более 5 мм). Форма колоний может быть круглая, розетковидная, звездчатая, древовидная и др. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными. Края у колоний могут быть ровными. волнистыми, фестончатыми, расплывчатыми, изрезанными и др. Поверхность колоний может быть гладкая или шероховатая, влажная или сухая. По консистенции различают однородные или зернистые колонии, по прозрачности матовые, непрозрачные или прозрачные.
Колонии могут быть бесцветными или окрашенными (пигментированными). Белые, золотистые, лимонно-желтые колонии у стафилококков, рубиново-красные - у серраций, сине-зеленые - у синегнойной палочки, кремовые - у микобактерий туберкулеза.
Различают колонии S и R типа. S-типа колонии - круглые, гладкие. блестящие, выпуклые, с ровными краями, влажные. R-типа колонии более крупные, плоские, шероховатые, матовые, неправильной формы, с исчерченными краями.
Подавляющее большинство патогенных бактерий образует колонии S-типа. R-типа колонии образуют:
1. Возбудитель сибирской язвы - матовые, плоские с локонообразной периферией колонии (колонии в виде «львиной гривы»).
2. Возбудитель чумы - периферийная кружевная зона, вокруг приподнятой центральной части колонии (колонии в виде «кружевного платочка»).
3. Возбудитель туберкулеза - морщинистые колонии светло-кремового цвета (колонии в виде «тутовой ягоды»).
4. Возбудитель дифтерии - плоские колонии с радиальной исчерченностью (колонии в виде «цветка маргаритки»).
5. Микоплазмы - колонии состоят из центра врастающего в глубь среды и периферийной ажурной части (колонии в виде «яичницы-глазуньи»).
Однако форма колоний подвержена изменчивости. R-формы колоний могут переходить в S-формы и наоборот.