2 курс / Нормальная физиология / Основы_физиологии_гемостаза_Струкова_С_М_

Схема активации рецепторов, активируемых протеиназами

(PAR).

Тромбин расщепляет одну пептидную связь во внеклеточном домене рецепторовPAR1, PAR3 и PAR4 и освобождает новый N-концевой участок рецептора, так называемый «привязанный лиганд», который служит агонистом рецептора. В структурах PAR1 и PAR3 – гирудиноподобный домен,

связывающий ABE1 тромбина.

Тромбин активирует три представителя семейства рецепторов PARPAR1, PAR3 и PAR4, которые широко экспрессируются клетками,

участвующими во всех функциях тромбина, в том числе регуляции процессов свертывания крови, воспаления, репарации тканей,

нейродегенерации/нейрорепарации и др. Чувствительность рецепторов к тромбину различается: PAR1 и PAR3 активируются низкими концентрациями тромбина, а PAR4 – высокими, что обусловлено существованием только в структурах молекул PAR1 и PAR3 отрицательно заряженных сайтов, подобных существующим в гирудине, комплементарных АВЕ1 тромбина( рис. 2-26). Это позволяет клетке избирательно отвечать на разные концентрации тромбина, а

тромбину взаимодействовать с разными типами клеток. Фактор Xa,

активированный протеин С (APC) и ряд других протеиназ также активируют

PAR1, но в концентрациях существенно превышающих эффективные концентрации тромбина. PAR3 служит так же кофактором PAR4, поскольку привязанный лиганд PAR3, освобождаемый тромбином, может активировать

PAR4, взаимодействуя с доменом второй внеклеточной петли не специфического рецептора.

Факторы VIIa-TF (тканевой фактор), и Xa свертывания крови, также как трипсин, триптаза тучных клеток и ряд других не специфических протеиназ активируют PAR2 (табл. 2- 5).

Синтетические пептиды, гомологичные по структуре привязанному лиганду, так же служат агонистами PAR. С помощью синтетических пептидов получен ряд доказательств участия PAR рецепторов в реализации действия протеиназ на клетки.

101

Рецепторы PAR идентифицированы на клетках эндотелия, тромбоцитах,

лейкоцитах, фибробластах, гладкомышечных клетках, моноцитах, остеобластах,

нейронах, глиальных, тучных клетках, дендритах и многих других.

Таблица 2- 5.

Характеристика рецепторов, активируемых протеиназами

(PAR)

102

Рецепторы	PAR-1	PAR-2	PAR-3	PAR-4
Хромосомы человека	5q13	5q13	5q13	19p12
	Тромбин
	АРС	Трипсин		Тромбин
Агонисты	Гранзим А	Триптаза	Тромбин	Трипсин
	фXa	фVIIa/TF/Xa		Катепсин G
Пептиды - агонисты
человека	SFLLRN	SLIGKV	TFRGAP	GYPGQV
мыши	SFFLRN	SLIGRL	SFNGGP	GYPGKF
	Катепсин G
Инактивирующие
	Плазмин	Химаза	Катепсин G
протеазы
	Протеиназа 3
Экспрессия клетками –
продуцентами:
эндотелиальными	+	+	+	+
тромбоцитами	+	+	+	+
фибробластами	+	+	+	+
гладкомышечными	+	+	+	+
моноцитами	+	+	+	+
остеобластами	+	+	+	-
эпителиальными	+	+	+	+
Т-лимфоцитами	+	+	+	+
тучными	+	+	+	+
нейронами	+	+	+	+
астроцитами	+	+	+	+

103

Известно несколько механизмов передачи сигнала в клетку через PAR

рецепторы, в частности активации PAR-1 клеток тромбином.

В клетках эндотелия, фибробластах, кератиноцитах, тромбоцитах и др.

активация PAR-1 тромбином стимулирует передачу сигнала внутрь клетки и ее активацию через семейство регуляторных, связывающих гуаниннуклеотиды G-

белков – гетеротримеров, состоящих из α-субъединицы и βγ-субъединицы.

Активация PAR1 приводит к его взаимодействию с α-субъединицей, обмену связанного GDP на GTP, диссоциации гетеротримера и взаимодействию α-

субъединицы (либо βγ) с белком-мишенью. PAR-1 взаимодействует с α-

субъединицами G12/13-, Gq- и Gi-белков. Связывание PAR1 с G12/13 ведет к активации малого G-белка Rho и отвечает за изменение формы тромбоцитов,

проницаемость и миграцию клеток эндотелия. Сигналы, опосредованные белком Gq ведут к активации фосфолипазы Сβ, запуску гидролиза фосфоинозитидов, мобилизации кальция, активации протеинкиназы С и, в

конечном счете, к фосфорилированию митогеном активируемых протеинкиназ

(MAPK), активации рецепторных тирозинкиназ и других белков, образованию протеинкиназ, регулируемых внеклеточным сигналом и активации транскрипционного фактора NFkB. Эти процессы отвечают за множество реакций клеток, включая секрецию гранул, активацию интегринов, агрегацию тромбоцитов, транскрипционные ответы (включая стимуляцию пролиферации)

в эндотелиальных и мезенхимальных клетках. Ассоциация PAR-1 с белком Gi,

чувствительным к коклюшному токсину, сопряжена с ингибированием аденилатциклазы и промотированием ответов тромбоцитов. Взаимодействие

PAR1 с Gβγ активирует фосфоинозитидкиназу, которая модифицирует белки плазматической мембраны для привлечения сигнальных комплексов

(серин/треонин киназ, нерецепторных тирозинкиназ и др.), участвующих в транскрипционных ответах. Множественные ответы при активации PAR1, а

также существование нескольких рецепторов семейства PAR и кофакторов этих рецепторов, обеспечивают полифункциональность действия тромбина и других протеиназ гемостаза, в том числе их провоспалительные функции.

104

NFkBсемейство белков, которые находятся в цитозоле клетки в комплексе с ингибиторами ( IkB и др), стабилизирующим комплекс. Фосфорилирование IkB

с помощью IkB киназы приводит к его деградации протеосомами.

Освободившийся из комплекса субъединицы NFkB транслоцируются в ядро. В

ядре они связываются с регуляторными участками промоторов ряда генов и регулируют экспрессию адгезивных белков- Р и Е селектинов,

ICAM(внутриклеточной адгезивной молекулы), VCAM-1 (адгезивная молекулы сосудистых клеток), MCP-1(хемоаттрактантного белка 1 моноцитов),

а также экспрессию тканевого фактора, факторов роста и и цитокинов.

Активируя NFkB тромбин стимулирует процессы воспаления, свертывания крови и репарации ткани. Факторы свертывания крови, которые активируют

PAR2, также могут стимулировать эти процессы, но тонкие механизмы активации клеток , участвующих в процессах воспаления, свертывания крови и репарации тканей не выяснены.

ВАЖНО

1. Особенности процесса свертывания:

1)ограниченный протеолиз факторов свертывания;

2)локализация процесса на поверхности поврежденного эндотелия и активированных клеток крови;

3)	необходимость		кофакторов	свертывания,	рецепторов,
ингибиторов			и активация механизмов отрицательной и
положительной		обратной связи,		регулирующий	образование
тромбина.

2. Cтруктурные особенности факторов свертывания крови

определяют их функции в системе гемостаза и сопряженных реакциях.

105

3.Синтез проферментов протромбинового комплекса

происходит в печени и зависит от витамина К, который служит коферментом фермента - γ-глутамилкарбоксилазы.

4. Контактная активация свертывания крови инициируется in vivo при воспалении, in vitro при контакте плазмы с отрицательно заряженной поверхностью.

5. Внешний путь свертывания крови, индуцируемый тканевым

фактором, -	основной механизм образования	тромбина	в
кровеносном	русле при нормальном гемостазе. Тканевой фактор		-

кофактор и рецептор факторов VIIa и VII.

6.Две фазы свертывания крови: инициация свертывания и распространение свертывания . Структурные особенности комплексов –тенназы и протромбиназы.

7.Полифункциональность тромбина и высокая специфичность

в отношении субстратов и рецепторов клеток обеспечивается несколькими участками в структуре молекулы фермента:

анионсвязывающим экзосайтами 1 и 2 (АВЕ1 и АВЕ 2) и участками связывания ионов натрия.

8. Структура фибриногена и основные этапы превращения фибриногена в фибрин.Роль тромбина и фактора XIIIa.

9.Структура, механизмы активации рецепторов PAR (

рецепторы, актвируемые протеиназами) и передачи сигнала в

клетку через PAR. Реакции гемостаза и сопряженных систем ,

регулируемые при участии PAR.

106

Глава 3. Механизмы регуляции гемостаза

3.1. Основные механизмы обеспечения гемостатического баланса

Регуляция гемостаза осуществляется на нескольких уровнях:

1)первичный гемостаз: механизмы дезагрегации (ПГ12, NO) и ингибиторы агонистов агрегации тромбоцитов (АДФаза CD39),

2)вторичный гемостаз: инактивация тромбина (серпины), связывание тромбина (тромбомодулин (ТМ)), блокирование образования тромбина (система протеина С), ингибирование протеиназ системы свертывания, предшествующих появлению тромбина, в первую очередь, активных форм факторов X (Xa) и VII (VIIa), (кунины-TFPI, и др.);

3)фибринолиз, лизис сгустка фибрина, ингибиторы фибринолиза.

Механизмы регуляции вторичного гемостаза направлены на ограничение образования тромбина. Теоретически из протромбина, концентрация которого в циркуляции достаточно высока (0,1г/л), при свертывании крови может образоваться 150 ед. тромбина на мл крови. Но практически образуется не более

10-15 ед./мл, поскольку в норме эффективно работают механизмы регуляции концентрации тромбина в кровотоке.

Тромбин в небольших (нM) концентрациях, которые могут генерироваться в микрососудах при физиологических состояниях, связывается рецепторами эндотелия, в первую очередь – тромбомодулином. Тромбомодулин (ТМ)

эффективно конкурирует с фибриногеном и рецепторами семейства PARPAR1

107

и PAR4, за участок связывания тромбина – анионсвязывающий экзосайт 1

(ABE1) молекулы фермента. Именно этим свойством тромбомодулина объясняется его функция как ингибитора свертывающей активности тромбина и блокатора способности тромбина вызывать активацию тромбоцитов и других клеток, экспонирующих рецепторы PAR. Более того, в комплексе с тромбомодулином тромбин активирует систему протеина С. Активированный протеин С ингибирует дальнейшее образование тромбина, блокируя кофакторы свертывания (факторы Vа и VIIIа), и активирует фибринолиз, освобождая тканевой активатор плазминогена (который превращает плазминоген в плазмин,

лизирующий фибрин) из его комплекса с ингибитором.

При появлении тромбина в концентрациях выше нМ работает следующий уровень регуляции – инактивация его антитромбином III, связанным с гликозаминогликанами эндотелия. Свободный антитромбин не является эффективным ингибитором/субстратом тромбина, поскольку имеет конформацию молекулы не комплементарную связывающим участкам молекулы тромбина. Изменение конформации антитромбина в форму, эффективно взаимодействующую с тромбином, происходит при связывании с гликозаминогликанами (ГАГ) эндотелия, например, с гепаран сульфатом или с хондоитин сульфатной цепью молекулы тромбомодулина. К ГАГ относится также гепарин, синтезируемый и освобождаемый тучными клетками,

локализованными в адвентиции сосуда, или введенный внутривенно.

3.2. Механизмы инактивации тромбина и других

протеиназ гемостаза.

3.2.1. Инактивация протеиназ серпинами.

Ингибиторы сериновых протеиназ называют серпинами. К серпинам относятся: антитромбин III (АТIII, син. АТ), α1-ингибитор протеиназ (α1-ИП,

син. α1-антитрипсин), кофактор II гепарина (HIIC) и ингибитор ФXa, зависимый от протеина Z, (ZPI) (табл. 2-4).

Серпины происходят от общего предшественника. Их функции дивергировали в эволюции, которая происходила параллельно эволюции сериновых протеиназ. Эти протеиназы прошли путь от трипсиноподобных

108

протеиназ широкого спектра протеолиза до высокоспецифичных, регуляторных протеиназ, узкого спектра действия, способных быстро и точно реагировать на нарушение гемостаза.

3.2.1.1. Инактивация тромбина антитромбином III

Несмотря на высокую степень гомологии аминокислотной последовательности АТIII и α1-ИП, их специфичность различна. Это обусловлено существованием в реактивном участке АТIII пептидной связи Арг393-Сер394, расщепляемой преимущественно тромбином и фактором Xa,

тогда как в реактивном участке α1-ИП находится связь Мет358-Сер359,

гидролизуемая эластазой нейтрофилов. Замена реактивного метионина в положении Р1 расщепляемой связи (по номенклатуре Шехтера и Бергера) на аргинин в мутантной молекуле α1-ИП Питтсбург (названной по имени города, в

котором обнаружен больной с этим дефектом) привела к изменению специфичности от протеазы химотрипсинового типа, как эластаза, к

трипсиноподобным протеазам, таким как тромбин. Результатом гетерозиготного повреждения молекулы α1-ИП была смерть мальчика в очень молодом возрасте вследствие массивных и продолжительных кровотечений, поскольку дефектный ингибитор (α1-ИП), содержащийся в плазме в высокой концентрации (1,3г/л),

имел свойства АТIII (0,15 г/л), и блокировал даже низкие концентрации свертывающего фибриноген фермента тромбина.

АТIII ингибирует протеиназы системы свертывания крови

(преимущественно тромбин, фактор Xa, а также IXa) путем образования эквимолярного комплекса. Механизм инактивации АТIII подобен мышеловке

(suicidesubstrate механизм), где ловушка (серпин АТIII) привлекает мышей

(протеазы) куском сыра (реактивная петля ингибитора RCL).

Изучение кристаллографических структур комплексов серпин-протеиназа позволило представить последовательность событий, ведущих к инактивации протеиназы (рис. 3-30).

109

Рис. 3- 30

Этапы инактивации тромбина антитромбином III на основании исследования кристаллографических структур комплексов серпин-протеиназа.

1.Узнавание активным центром тромбина и связывание петли реактивного центра (RCL) серпина АТIII. 2.Расщепление петли серпина по связи Арг393-

Сер394, включение петли RCL в середину складчатой структуры молекулы АТIII и конформационные изменения серпина в стабильное состояние. 3.

Передвижение молекулы тромбина, привязанной к петле RCL, вдоль молекулы АТIII к противоположному концу ингибитора, потеря упорядоченной структуры и активности.

Первый этап – узнавание ингибитора активным центром протеиназы, а

затем и связывание петли реактивного центра (RCL) серпина (АТIII). На следующем этапе происходит расщепление петли ингибитора протеиназой,

110