4.3.3. Этапы развития вирусологии

История достижений вирусологии напрямую связана с успехами развития методической базы исследований.

Конец XIX — начало XX-го века. Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры (свечи Шамберлана), которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. С использованием фильтруемости через бактериологические фильтры были открыты следующие вирусы: 1892 г. — вирус табачной мозаики; 1898 г. — вирус ящура; 1899 г. — вирус чумы рогатого скота; 1900 г. — вирус желтой лихорадки; 1902 г. — вирус оспы птиц и овец; 1903 г. — вирус бешенства и вирус чумы свиней; 1904 г. — вирус оспы человека; 1905 г. — вирус чумы собак и вирус вакцины; 1907 г. — вирус денге; 1908 г. — вирус оспы и трахомы; 1909 г. — вирус полиомиелита; 1911 г. — вирус саркомы Рауса; 1915 г. — бактериофаги; 1916 г. — вирус кори; 1917 г. — вирус герпеса; 1926 г. — вирус везикулярного стоматита.

30-е годы — основным вирусологическим методом, используемым для выделения вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные (белые мыши — для вирусов гриппа, новорожденные мыши — для вирусов Коксаки, шимпанзе — для вируса гепатита B, куры, голуби — для онкогенных вирусов, поросята-гнотобионты — для кишечных вирусов и т. д.). Первым, кто начал систематически использовать лабораторных животных при изучении вирусов, был Пастер, который еще в 1881 г. проводил исследования по инокуляции материала от больных бешенством в мозг кролика. Другая веха — работы по изучению желтой лихорадки, следствием которых явилось использование в вирусологической практике новорожденных мышей. Кульминацией этого цикла работ стало выделение Сайклзом в 1948 г. на мышах-сосунках группы вирусов эпидемической миалгии.

1931 г. — в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза, саркомы кур и некоторым другим вирусам. И в настоящее время куриные эмбрионы широко используются для выделения вирусов гриппа.

1932 г. — английский химик Элфорд создает искусственные мелкопористые коллоидные мембраны — основу для метода ультрафильтрации, с помощью которого стало возможным проводить определение размера вирусных частиц и дифференцировать вирусы по этому признаку.

1935 г. — применение метода центрифугирования дало возможность кристаллизации вируса табачной мозаики. В настоящее время методы центрифугирования и ультрацентрифугирования (ускорение на дне пробирки превышает 200000 g) широко используются для выделения и очистки вирусов.

В 1939 г. для изучения вирусов впервые был применен электронный микроскоп, обладающий разрешающей способностью 0,2-0,3 нм. Использование ультратонких срезов тканей и метода негативного контрастирования водных суспензий позволило проводить изучение взаимодействия вирусов с клеткой и исследовать структуру (архитектуру) вирионов. Сведения, полученные с помощью электронного микроскопа, были значительно расширены с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов и псевдокристаллов вирусов. Совершенствование электронных микроскопов завершилось созданием сканирующих микроскопов, позволяющих получать объемные изображения. С использованием метода электронной микроскопии изучена архитектура вирионов, особенности их проникновения в клетку хозяина.

В этот период была открыта основная масса вирусов. В качестве примера могут быть приведены следующие: 1931 г. — вирус гриппа свиней и вирус западного энцефаломиелита лошадей; 1933 г. — вирус гриппа человека и вирус восточного энцефаломиелита лошадей; 1934 г. — вирус паротита; 1936 г. — вирус рака молочной железы мышей; 1937 г. — вирус клещевого энцефалита.

40-е годы. В 1940 г. Хогланд с коллегами установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК.

1941 г. — американский ученый Херст на модели вируса гриппа открыл феномен гемагглютинации (склеивания эритроцитов). Это открытие легло в основу разработки методов выявления и идентификации вирусов и способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой. Принцип гемагглютинации положен в основу ряда методов:

РГА — реакция гемагглютинации — применяется для обнаружения и титрования вирусов;

РТГА — реакция торможения гемагглютинации — применяется для идентификации и титрования вирусов.

1942 г. — Херст устанавливает наличие у вируса гриппа фермента, который позднее идентифицирован как нейраминидаза.

1949 г. — открытие возможности культивирования клеток животных тканей в искусственных условиях. В 1952 г. Эндерс, Уэллер и Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием, давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита, паротита, кори и краснухи.

Открыты вирусы: 1945 г. — вирус Крымской геморрагической лихорадки; 1948 г. — вирусы Коксаки.

50-е годы. В 1952 г. Дульбекко разрабатывает метод титрования бляшек в монослое клеток эмбриона цыпленка, что позволило ввести в вирусологию количественный аспект. 1956-62 гг. Уотсон, Каспар (США) и Клуг (Великобритания) разрабатывают общую теорию симметрии вирусных частиц. Структура вирусной частицы стала одним из критериев в системе классификации вирусов.

Этот период характеризовался значительными достижениями в области бактериофагов:

а) установлена индукция профага лизогенизирующих фагов (Львов и др., 1950 г.);

б) доказано, что инфекционность присуща фаговой ДНК, а не белковой оболочке (Херши, Чейз, 1952 г.);

в) открыто явление общей трансдукции (Циндер, Ледерберг, 1952 г.).

Кроме того, реконструирован инфекционный вирус табачной мозаики (Френкель-Конрад, Вильяме, Сингер, 1955-57 гг.), в 1955 г. получен в кристаллическом виде вирус полиомиелита (Шаффер, Шверд, 1955 г.); открыты вирусы: 1951 г. — вирусы лейкоза мышей и ECHO; 1953 г. — аденовирусы; 1954 г. — вирус краснухи; 1956 г. — вирусы парагриппа, цитомегаловирус, респираторно-синцитиальный вирус; 1957 г. — вирус полиомы; 1959 г. — вирус аргентинской геморрагической лихорадки.

60-е и последующие годы характеризуются расцветом молекулярно-биологических методов исследования. Достижения в области химии, физики, молекулярной биологии и генетики легли в основу методической базы научных исследований, которые стали применяться не только на уровне методик, но и целых технологий, где вирусы выступают не только как объект исследований, но и как инструмент. Ни одно открытие молекулярной биологии не обходится без вирусной модели.

1967 г. — Катес и МакАуслан демонстрируют присутствие в вирионе осповакцины ДНК-зависимой РНК-полимеразы. В следующем году обнаруживается РНК-зависимая РНК-полимераза у реовирусов, а затем у парамиксо- и рабдовирусов. В 1968 г. Якобсон и Балтимор устанавливают наличие у полиовирусов геномного белка, соединенного с РНК, Балтимор и Бостон устанавливают, что геномная РНК полиовируса транслируется в полипротеин.

Открыты вирусы: 1960 г. — риновирусы; 1963 г. — австралийский антиген (HBsAg).

70-е годы. Балтимор одновременно с Темином и Мизутани сообщают об открытии в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Становится реальным изучение генома РНК содержащих вирусов.

Изучение экспрессии генов у вирусов эукариот дало фундаментальную информацию о молекулярной биологии самих эукариот — существование кэп-структуры мРНК и ее роль в трансляции РНК, наличие полиадениловой последовательности на 3'-конце мРНК, сплайсинг и роль энхансеров в транскрипции впервые выявлены при изучении вирусов животных.

1972 г. — Берг публикует сообщение о создании рекомбинантной молекулы ДНК. Возникает новый раздел молекулярной биологии — генная инженерия. Применение технологии рекомбинантных ДНК позволяет получать белки, имеющие важное значение в медицине (инсулин, интерферон, вакцины). 1975 г. — Келер и Мильштейн получают первые линии гибридов, продуцирующих моноклональные антитела (МКА). На основе МКА разрабатываются самые специфичные тест-системы для диагностики вирусных инфекций. 1976 г. — Бламберг за открытие HBsAg получает Нобелевскую премию. Установлено, что гепатит A и гепатит B вызываются разными вирусами.

Открыты вирусы: 1970 г. — вирус гепатита B; 1973 г. — ротавирусы, вирус гепатита A; 1977 г. — вирус гепатита дельта.

80-е годы. Развитие заложенных отечественным ученым Л.А. Зильбером представлений о том, что возникновение опухолей может быть связано с вирусами. Компоненты вирусов, ответственные за развитие опухолей, назвали онкогенами. Вирусные онкогены оказались в числе лучших модельных систем, помогающих изучению механизмов онкогенетической трансформации клеток млекопитающих.

1985 г. — Мюллис получает Нобелевскую премию за открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это — молекулярно-генетический метод диагностики, позволивший, кроме того, усовершенствовать технологию получения рекомбинантных ДНК и открыть новые вирусы. Открыты вирусы: 1983 г. — вирус иммунодефицита человека; 1989 г. — вирус гепатита C; 1995 г. — с использованием ПЦР открыт вирус гепатита G.