4.1. Характеристика мутагенних факторів

Процес утворення мутацій називається мутагенезом, а фактори, що викликають мутації − мутагенами. Мутагени спочатку впливають на генетичний матеріал особини, внаслідок чого може змінитися фенотип.

Мутагенні фактори підрозділяють на:

• фізичні;

• хімічні;

• біологічні.

До фізичних мутагенних факторів відносяться різні види випромінювань, температура, вологість і ін . Основні механізми їхньої дії: 1) порушення структури генів і хромосом; 2) утворення вільних радикалів, що вступають у хімічну взаємодію з ДНК; 3) розриви ниток ахроматинового веретена поділу; 4) утворення димерів.

До хімічних мутагенів відносяться: а) природні органічні і неорганічні речовини (нітрити, нітрати, алкалоїди, гормони, ферменти й ін.); б) продукти

промислової переробки природних сполук − вугілля, нафти; в) синтетичні речовини, що раніше не зустрічалися в природі (пестициди, інсектициди, харчові консерванти, лікарські речовини); г) деякі метаболіти організму людини. Хімічні мутагени володіють великою проникаючою здатністю, викликають переважно генні мутації і діють у період реплікації ДНК. Механізми їхньої дії: 1) дезамінування; 2) алкілування; 3) заміни азотистих основ їхніми аналогами; 4) інгибування синтезу попередників нуклеїнових кислот.

До біологічних мутагенів відносяться: а ) віруси (краснухи, кору, грипу), б) невірусні паразитарні агенти (мікоплазми, бактерії, рікетсії, найпростіші, гельмінти). Механізми їхньої дії: 1) віруси вбудовують свою ДНК у ДНК клітин

хазяїна; 2) продукти життєдіяльності паразитів − збудників хвороб діють як хімічні мутагени.

45

4.2. Класифікація мутацій

З причин, що визвали мутації їх підрозділяють на:

• спонтанні;

• індуковані.

Спонтанні (мимовільні) мутації відбуваються під дією природних мутагенних факторів зовнішнього середовища без втручання людини. Індуковані

мутації − результат спрямованого впливу певних мутагенних факторів. Так, вперше у 1925 році Г. А. Надсон і Г. С. Філіппов одержали мутації в дріжджів під дією іонізуючої радіації.

За клітинами, які змінилися, мутації підрозділяються на:

• генеративні;

• соматичні.

Генеративні мутацій відбуваються у статевих клітинах, передаються у спадок при статевому розмноженні. Соматичні мутації відбуваються у соматичних клітинах, виявляються в самій особині і передаються у спадок тільки при вегетативному розмноженні.

За результатами для організму мутації бувають:

• негативні − летальні (несумісні з життям);

• напівлетальні (знижують життєздатність організму);

• нейтральні (не впливають на процеси життєдіяльності);

• позитивні (підвищують життєздатність); виникають рідко, але мають велике значення для прогресивної еволюції.

За змінами генетичного матеріалу мутації підрозділяють на:

• геномні;

• хромосомні;

• генні.

4.1. Спонтанний та індукований мутагенез

Мутації, які виникають у клітинах без будь-якого експериментального втручання, називаються спонтанними. Клітини , в яких виникли спонтанні мутації, називаються спонтанними мутантами. Численна частка спонтанних мутантів у клітинній популяції становить 10^-4 – 10^-11. Частота виникнення мутантів – це кількість мутацій у перерахунку на одну клітину чи на одну генерацію.

«Мовчазні» мутації. Якщо мутація – це зміна генотипу, яка проявляється у фенотипі, то на молекулярному рівні будь-яку стабільну спадкову зміну ДНК можна розглядати як мутацію. Проте завдяки виродженості генетичного коду не всяка мутація такого роду буде проявлятись у фенотипі. У багатьох триплетах зміна третьої основи залишається без наслідків («мовчазні» мутації). Навіть заміна другої чи першої основи у триплеті не завжди супроводжується

серйозними наслідками. Наприклад , мутація AУЦ→ГУЦ веде до заміни ізолейцину валіном, тобто до заміни однієї ліпофільної амінокислоти на іншу. Проте мутація ЦУУ→ЦЦУ призведе до заміни лейцину проліном, і наслідком такої заміни буде відхилення від нормальної просторової конфігурації

46

поліпептидного ланцюга, що в свою чергу може сильно змінити структуру вищого порядку.

Зворотні мутації та реверсії. У мутанта може відбутися і зворотна мутація, в результаті якої відновляться властивості дикого типу. Істинною зворотною мутацією називають тільки таку мутацію, в результаті якої точно відновлюється початковий генотип, тобто коли змінений у результаті першої мутації триплет буде знову кодувати ту саму амінокислоту, що й раніше. Якщо ж відновлюється початковий фенотип, то мова йде про реверсію, або супресорну мутацію. Відповідно клітини, в яких виникли реверсії, називаються

ревертантами.

Обробляючи клітини мутагенними речовинами, можна підвищити частоту виникнення мутацій. У цьому разі йдеться про індуковані мутації, а клітини, в яких вони виникли, називають індукованими мутантами.

Розглянемо деякі механізми індукованого мутагенезу.

Включення аналогів основ. Аналоги основ – це антиметаболіти . Вони дуже подібні до нормальних пуринових і піримідинових основ, тому поглинаються клітинами і включаються в ДНК. Такими антиметаболітами є бромурацил та 2-амінопурин.

Бромурацил за структурою аналогічний тиміну, тому може включатись у ДНК замість тиміну як партнер аденіну. Бромурацил таутомеризується в енольну форму частіше, ніж тимін. В енольній формі він спарюється як цитозин, тобто викликає включення гуаніну замість аденіну.

2-Амінопурин включається в ДНК замість аденіну і діє так само.

Хімічна зміна основ. Азотиста кислота дезамінує аденін, гуанін або цитозин. У результаті заміщення аміногрупи на гідроксильну аденін перетворюється на гіпоксантин і спарюється з цитозином замість тиміну. Цитозин дезамінується в урацил і спарюється з аденіном замість гуаніну.

Алкілувальні агенти. Такими агентами є етил- та метил-метансульфонат, диметил- та диетилсульфат, іприт і N-метил-N-нітро-N-нітрозогуанідин. Це найефективніші мутагени. Наприклад, етилметансульфонат етилює атом азоту у молекулі гуаніну. Утворюється 7-алкілгуанін, який відщеплюється від ланцюга, в результаті чого утворюється «пропуск». За наступної реплікації на цьому місці часто виникає «помилкова» основа.

Включення чи втрата окремих пар основ. Профлавін та інші акридинові барвники діють інакше. Молекула акридину вбудовується між сусідніми основами ланцюга ДНК і збільшує відстань між ними (явище інтеркаляції). При цьому виникають помилки двох типів: втрата нуклеотиду або включення додаткової пари нуклеотидів.

Ультрафіолетові промені та іонізуюче випромінювання.

Ультрафіолетові та рентгенівські промені, а також інші види іонізуючого випромінювання спричиняють як летальну, так і мутагенну дію. УФ-промені діють на нуклеїнові кислоти, спричиняючи утворення димерів тиміну.

Під впливом УФ-променів у клітинах мікроорганізмів відбувається димеризація двох сусідніх піримідинових основ у молекулі ДНК. Якщо такі димери не видаляються в процесі пострадіаційної репарації, вони викликають або

47

загибель опроміненої клітини (летальність), або появу мутацій типу заміни пара основ. У зв'язку із цим в експерименті важливе значення має фактор доза-клітина. Для оцінки дії мутагенного агента суворо враховують кількісні показники. Їх використовують для графічного зображення залежностей. Графіки будують найчастіше в напівлогарифмічному масштабі. Інтенсивність опромінення вимірюють у ергах на квадратний міліметр (ерг/мм²).

У процесі обліку летальної й мутагенної дій будь-якого фактора звичайно обробляють моноклітинну суспензію досліджуваного штаму, концентрація клітин якої має бути попередньо визначена. Оптимальна кількість колоній на чашці має бути в межах 50 – 300.

У результаті вивчення дії мутагенів може бути виявлена частота індукованих мутацій аденинзалежності в локусах ade1 і ade2. Мутантні клони набувають червоного забарвлення. Облік мутацій такого типу проводять при згущеному в 10 разів висіві на чашки з повним середовищем. При цьому кількість колоній на чашці може досягати 5000, однак забарвлені червоні клони добре помітні без збільшення.

Завдання на виконання

I. Фізичні фактори отримання мутантів. Для проведення роботи використовують прототрофний гаплоїдний штам дріжджів S. cerevisiae 15В-П4 (рис . 4.1). Опромінення УФ-променями проводять бактерицидною лампою БУВ-30П при інтенсивності випромінювання 20 ерг/ мм²∙с. Тривалість експозиції становить 60, 90 і 120 с (загальна доза дорівнює відповідно 1200, 1800, 2400 ерг/мм²). Відстань між джерелом УФ-променів і поверхнею чашки – не більше 35 см. Опроміненню піддають моноклітинну культуру з концентрацією 5·10⁶ клітин/мл. Опромінення проводять у чашках діаметром 40 – 50 мм (під час опромінення кришку знімають). Оброблення опроміненої суспензії, розсів її на чашки, загортання чашок у папір слід проводити при червоному світлі, яке перешкоджає фотореактивації опромінених клітин.

1. Із приготовленої суспензії концентрацією 5∙10⁶ клітин/мл (методику приготування див. у лабораторній роботі 1) відбирають 0,1 мл для контрольного висіву на чашки. При цьому розводять суспензію до концентрації 1∙10⁴ клітин/мл внесенням 0,1 мл суспензії в 4,9 мл води (розведення І). Із розведення І 0,1 мл суспензії додають до 0,9 мл води (розведення ІІ).

2. На чашку з попередньо залитим середовищем повного складу вносять по 0,05 мл суспензії з кожного розведення, після чого суспензію розтирають шпателем. Потім чашки вміщують у термостат з температурою 30 °С. Контрольний висів дає можливість визначити густину висіву вихідної суспензії, частоту появи спонтанних аденинзалежних мутантів і служить контролем для порівняння з результатами опромінення клітин.

3. П е р ши й в а р і а н т . Під час опромінення суспензії клітин перенесена в чашки культура постійно перемішується легким погойдуванням (без розбризкування!). Після закінчення експозиції чашку закривають, виводять із опромінення й відбирають із суспензії пробу в кількості 0,1 мл. Переносять її у пробірку з 2,4 мл води для одержання розведення І. З розведення І відбирають

48

Вихідна

культура дріжджів,

5·10⁶

кл./мл

3 мл

3 мл

3 мл

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл

УФ

4,9 мл води

0,1 мл

0,9 мл води

0,1 мл

0,1 мл

2,4 мл 0,1 мл

УФ

води

0,4 мл

0,9 мл води

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл

1,6 мл

води

УФ

0,9 мл води

0,2 мл

0,1 мл

0,1 мл

0,8 мл

води

Рис. 4.1. Схема оброблення клітинної суспензії дріжджів УФ-променями

49

0,1 мл суспензії й переносять в 0,1 мл води (розведення ІІ). У такий спосіб аналізують кожну дозу опромінення. Д р уг и й в а р і а н т . Після відбору проби із суспензії, опроміненої мінімальною дозою, чашку знову поміщають під випромінювач, і експозиція щораз подовжується відповідно на 600 ерг/мм²∙с). Сумарно клітини отримають дозу 2400 ерг/ мм². Відбір проб для аналізу на ефективність дії УФ-променів здійснюють за послідовністю наведеною в табл.

4.1.

Всі засіяні чашки загортають у папір і вміщують у термостат з температурою 30 °С на 6 – 7 діб, після чого обліковують результати, які після статистичного опрацювання заносять у табл. 4.2.

II. Хімічні фактори, що викликають мутагенез. Для виявлення ефекту дії хімічних мутагенів використовують азотисту кислота або натрієву сіль азотистої кислоти (рис. 4.2).

1. Суспензію клітин з концентрацією 1∙10⁷ клітин/мл дістають змивом культури з поверхні агару 8 мл ацетатного буфера рН 4,4 (титр визначають у камері Горяєва й доводять об'єм до необхідного рівня ацетатним буфером). У пробірку відбирають 3,4 мл суспензії. Із цього об'єму відбирають ще 0,5 мл суспензії. Проводять розведення І і ІІ як зазначено вище, використовуючи замість води фосфатний буфер.

2. Суспензія, що висівається на контрольні чашки, має бути концентрацєю близько 1∙10⁴ клітин/мл. На чашки висівають по 0,05 мл суспензії з кожного розведення на повне середовище. Чашки вміщують у термостат з температурою

30 °С.

3. Для оброблення нітритом натрію до залишеної в пробірці 2,9 мл суспензії додають 0,1 мл свіжоприготовленого 0,5 М розчину нітриту натрію; при цьому кінцева концентрація мутагену становитиме 0,017 М.

З метою досягнення ефекту мутагенної дії суспензію клітин витримують 15, 30 і 45 хв, що дає приблизно 50, 10 і 1 % виживаності. Дію мутагену знімають зміною рН суспензії до 7,0 десятикратним розведенням суспензії фосфатним буфером. Після закінчення першої експозиції відбирають піпеткою 0,1 мл суспензії й переносять у пробірку з 0,9 мл фосфатного буфера. Через 15 хв, а потім ще раз через 15 хв відбирають у такий же спосіб дві проби, дози для яких дорівнюватимуть відповідно 30 і 45 хв. Концентрація клітин у кожній з відібраних проб без урахування летального ефекту становитиме 10⁶ клітин/мл.

4. Розрахунок розведень отриманих суспензій для висіву на чашки з повним середовищем проводять аналогічно рекомендаціям для дослідів з УФ-опроміненням. Під час обліку ауксотрофності або при морфологічних мутаціях необхідний висів великої кількості чашок. Кількість суспензії, що її відбирають під час останній експозиції, має бути збільшена до 0,3 мл, об’єм фосфатного буфера для розведення – до 2,7 мл. Кінцевий об'єм суспензії – 3 мл – висівають безпосередньо на чашки. Засіяні чашки вміщують у термостат з температурою 30 °С. Результати підраховують через 6 – 7 діб вирощування.