- •Оглавление
- •РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ
- •Задание 1.1.1. Выделение плазмидной ДНК
- •Задание 1.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией
- •Задание 1.5.1. Приготовление смесей дНТФ/Cy5 ддНТФ
- •Задание 1.5.2. Постановка реакции
- •Задание 1.5.3. Осаждение и нанесение образцов на гель
- •Задание 1.5.4. Заливка геля и постановка электрофореза
- •Задание 1.5.5. Анализ сиквенсов
- •Задание 1.6.1. Выделение ДНК из биомассы водорослей
- •Задание 1.6.3. Проведение секвенирования
- •Задание 1.6.4. Анализ полученных данных
- •РАЗДЕЛ 2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
- •Задание 2.2.1. Проведение электрофореза выделенной ДНК в агарозном геле
- •Задание 2.2.4. Определение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра
- •Задание 2.3.2. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза
- •Порядок выполнения работы
- •РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
- •Задание 3.5.1 Приготовление питательной среды
- •Задание 3.6.3. Посев клеток на материалах
- •Задание 3.6.5. Подсчет клеток
- •Задание 3.6.6. Процесс трипсинизации клеток
- •Задание 3.8.1. Освоение техники субкультивирования клеток
- •Задание 3.8.2. Замораживание прикрепленных клеток
- •РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Технология микроклонального размножения растений
- •Задание 4.3.1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля
- •РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
- •Задание 5.6.1. Определение показателей роста и спорообразования грибных культур поверхностным и глубинным способом
- •Задание 5.8.1. Освоить методы культивирования микроводорослей
- •РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ
- •Задание 6.10.1. Снятие ИК-спектра полигидроксибутирата
- •РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
- •Задание 7.1.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.2.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.2.3. Проверка светорассеяния в исследуемых образцах
- •Составление отчета
- •4. Составление отчета.
- •Задание 7.4.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.4.2. Исследование спектров люминесценции.
- •Задание 7.5.1. Оценить численность микроорганизмов в водных образцах
- •РАЗДЕЛ 8. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ФОТОСИТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ
- •РАЗДЕЛ 9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
- •Задание 9.1.3. Определение константы Михаэлиса. Специфичность
- •Задание 9.2.2. Определение типов взаимодействия эффекторов с ферментом по отношению к субстрату
- •РАЗДЕЛ 10. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
- •Задание 10.3.1. Выделение ДНК из биопроб
- •Задание 10.5.1. Построение абсолютного калибровочного графика зависимости концентрации глюкозы в пробе от изменений оптической плотности
- •Задание 10.7.1. Исследование образца крови на анализаторе МЕК-6400J/К
- •РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ
- •Задание 11.4.1. Ознакомление с метордом автоматической фотоколориметрии
- •РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
- •РАЗДЕЛ 1
- •РАЗДЕЛ 2
- •РАЗДЕЛ 3
- •РАЗДЕЛ 4
- •РАЗДЕЛ 5
- •РАЗДЕЛ 6
- •РАЗДЕЛ 7
- •РАЗДЕЛ 8
- •РАЗДЕЛ 9
- •РАЗДЕЛ 10
- •РАЗДЕЛ 11
- •Приложение. Перечень научного оборудования, использованного в лабораторном практикуме
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ
Материалы и оборудование
1.Растворители: буферные растворы и раствор NaOH (0,1 М), белки, триптофан, тирозин, денатурирующие агенты (концентрированные растворы кислот и щелочей или другие)
2.Спектрофотометр, лабораторные весы «Adventurer»™ OH–
AR2140
3.автоматические микропипетки.
4.Спектрофотометр Genesis 10UV (ThermoSpecronic, США).
Задания на выполнение лабораторной работы
Задание 7.2.1. Приготовление образцов для исследования.
Порядок выполнения работы
1.Получить порошок белка. Рассчитать, навеску какой массы необходимо сделать, чтобы получить 2 мл раствора концентрации 1·10-5 М.
2.Проверьте свои расчеты у преподавателя.
3.Приготовить навеску белка и растворите ее в 2 мл фосфатного буфера (рН 7).
4.Дать раствору постоять не менее 20 мин в темном прохладном
месте.
5.Растворы тирозина и триптофана в двух средах получить у препода-
вателя.
Задание 7.2.2. Измерение спектровпоглощения белка и аминокислот
Порядок выполнения работы
1. Измерить спектры поглощения раствора белка (концентрация 1·10-5 М) в буфере, а триптофана (5·10-5 М) и тирозина (5·10-4 М) в двух средах – растворе NaOH и фосфатном буфере.
Условия измерения: диапазон 260-400 нм, шаг 2 нм ( medium), объем жидкости в кювете – не менее 2 мл.
2. Измерить спектр поглощения денатурированного белка. Для этого доливать маленькими дозами в измерительную кювету с белком и в кювету
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
357 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ
сравнения денатурирующий агент, указанный преподавателем. После каждой добавки агента регистрировать спектр поглощения до тех пор, пока спектр не перестанет изменяться.
Задание 7.2.3. Проверка светорассеяния в исследуемых образцах
Порядок выполнения работы
1. Проверить наличие светорассеяния в снятых спектрах, для этого проанализировать, для каких образцов поглощение в диапазоне 320-400 нм не равно нулю.
Составление отчета
1.Спектры поглощения тирозина и триптофана в NaOH. Диапазон длин волн: 260–320 нм. В каждом случае должны быть указана концентрация, отмечены максимумы.
2.Аналогично – спектры поглощения 3-х веществ в фосфатном буфере: белка, тирозина и триптофана.
3.Анализ спектров в виде табл. 7.3.
Таблица 7.3
№ |
Образец |
Кювета |
Максимум спектра поглощения |
|||
эксперимента |
сравнения |
|
|
|
|
|
|
λ, нм |
D |
-1 |
-1 |
||
|
|
|
ε, M |
см |
||
1 |
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
… |
|
|
|
|
|
|
4. При написании выводов следует обратить внимание на следующие вопросы:
•Схожи ли абсорбционные свойства белка с характеристиками аминокислот (по λmax и/или εmax)?
•Какие из исследованных образцов проявляют рН-зависимость спектров поглощения? Почему?
•Как изменяется спектр поглощения белка при денатурации? Чем это объясняется? Становится ли он более похож на спектры аминокислот?
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
358 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ
Контрольные вопросы
1.Что такое первичная, вторична, третичная и четвертичная структуры белков? Какими связями эти структуры удерживаются?
2.Что такое оптическая плотность, пропускание, спектр поглощения? Как спектрофотометр получает эти характеристики?
3.Какие эффекты влияют на спектры поглощения макромолекул?
4.Зависимость между какими характеристиками образца отражена в законе Бугера-Ламберта-Бера? При каких условиях этот закон нарушается?
5.Какие задачи решают с помощью абсорбционной спектроскопии
белков?
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
359 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА7.3. АБСОРБЦИОННЫЙАНАЛИЗДНК
Цель лабораторной работы
•освоение спектрофотометрического метода измерения концентрации ДНК и оценки гиперхромного эффекта.
Краткие теоретические сведения
Представление об основах метода абсорбционной спектроскопии в целом следует получить, изучив теоретические сведения к работам 7.1 и 7.2.
Спектры поглощения мономерных нуклеотидов, обусловленные поглощением пуриновых и пиримидиновых оснований, расположены в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Основные полосы поглощения всех нуклеотидов кроме цитидина сосредоточены около 260 нм, у цитидина – при 270 нм. Спектры мономерных нуклеотидов заметно отличаются по форме. Коэффициенты молярной экстинкции мономерных нуклеотидов зависят от природы растворителя, рН, длины волны.
Спектры поглощения ДНК и РНК обусловлены наложением спектров мономерных нуклеотидов; их основная полоса поглощения расположены при 260 нм. Однако поглощение нативной ДНК при 260 нм заметно меньше, чем общее поглощение всех оснований, входящих в ее состав. При переходе от нативной ДНК (полинуклеотида) к мононуклеотидам происходит прирост поглощения – гиперхромный эффект. Гиперхромизм проявляется уже в динуклеотидах (от 2 до 11 %). Эффект возрастает с увеличением дины цепи и достигает максимального значения у олигонуклеотидов из 5-6 остатков. Гиперхромизм проявляется при переходе от двухспиральных структур к односпиральным (однако в меньшей степени, чем при переходе от полинуклеотида к мононуклеотиду). Он обусловлен тем, что в двойной спирали ДНК и в двуспиральных участках РНК плоскости оснований параллельны (и в виде стопок): такая конфигурация приводит к сильному взаимодействию оснований и снижению поглощения. Гиперхромный эффект широко используется как критерий денатурации ДНК. При денатурации значительно (от 20 до 60 % в зависимости от препарата) возрастает оптическая плотность при 260 нм.
Материалы и оборудование
1. Буферный раствор, концентрированный раствор ДНК.
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие |
360 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.3. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ДНК
2. Спектрофотометр, Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–
AR2140
3.Водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan», автоматические микропипетки.
4.Спектрофотометр Genesis 10UV (ThermoSpecronic, США).
Задание на выполнение лабораторной работы
Задание 7.3.1. Изучение спектров поглощения нативной, денатурированной иренатурированнойДНК
Порядок выполнения работы
1.Приготовить 4 мл раствора ДНК концентрации 0,2-0,25 мкг/мл в 0,15
МNaCl.
Измерить спектр поглощения этого раствора в диапазоне 200-500 нм. Проверьте наличие светорассеяния, сделайте поправку (если оно есть). Определите коэффициент поглощения данного вида ДНК при длине волны 260 нм.
2. Разлить раствор пополам в две пробирки с плотно притертыми пробками, закрепите пробки резинками и опустите пробирки в горячую водяную баню (около 95 °С).
Выдержав пробирки при такой температуре 10–15 мин, одну из них быстро опустить в лед, а вторую оставить в постепенно остывающей бане.
Дать растворам охладиться до комнатной температуры, измерить спектр поглощения в диапазоне 200–500 нм растворов:
а) денатурированной ДНК (быстро охлажденной), б) ренатурированной (медленно остывшей).
3. По измеренным значениям оптической плотности рассчитать величину гиперхромного эффекта для нативной и ренатурированной ДНК:
ГЭ(%) = D1 − D2 100,
D1
где D1 и D2 – оптические плотности при 260 нм для денатурированной и нативной (ренатурированной) ДНК соответственно.
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
361 |