- •Оглавление
- •РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ
- •Задание 1.1.1. Выделение плазмидной ДНК
- •Задание 1.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией
- •Задание 1.5.1. Приготовление смесей дНТФ/Cy5 ддНТФ
- •Задание 1.5.2. Постановка реакции
- •Задание 1.5.3. Осаждение и нанесение образцов на гель
- •Задание 1.5.4. Заливка геля и постановка электрофореза
- •Задание 1.5.5. Анализ сиквенсов
- •Задание 1.6.1. Выделение ДНК из биомассы водорослей
- •Задание 1.6.3. Проведение секвенирования
- •Задание 1.6.4. Анализ полученных данных
- •РАЗДЕЛ 2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
- •Задание 2.2.1. Проведение электрофореза выделенной ДНК в агарозном геле
- •Задание 2.2.4. Определение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра
- •Задание 2.3.2. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза
- •Порядок выполнения работы
- •РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
- •Задание 3.5.1 Приготовление питательной среды
- •Задание 3.6.3. Посев клеток на материалах
- •Задание 3.6.5. Подсчет клеток
- •Задание 3.6.6. Процесс трипсинизации клеток
- •Задание 3.8.1. Освоение техники субкультивирования клеток
- •Задание 3.8.2. Замораживание прикрепленных клеток
- •РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Технология микроклонального размножения растений
- •Задание 4.3.1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля
- •РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
- •Задание 5.6.1. Определение показателей роста и спорообразования грибных культур поверхностным и глубинным способом
- •Задание 5.8.1. Освоить методы культивирования микроводорослей
- •РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ
- •Задание 6.10.1. Снятие ИК-спектра полигидроксибутирата
- •РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
- •Задание 7.1.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.2.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.2.3. Проверка светорассеяния в исследуемых образцах
- •Составление отчета
- •4. Составление отчета.
- •Задание 7.4.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.4.2. Исследование спектров люминесценции.
- •Задание 7.5.1. Оценить численность микроорганизмов в водных образцах
- •РАЗДЕЛ 8. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ФОТОСИТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ
- •РАЗДЕЛ 9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
- •Задание 9.1.3. Определение константы Михаэлиса. Специфичность
- •Задание 9.2.2. Определение типов взаимодействия эффекторов с ферментом по отношению к субстрату
- •РАЗДЕЛ 10. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
- •Задание 10.3.1. Выделение ДНК из биопроб
- •Задание 10.5.1. Построение абсолютного калибровочного графика зависимости концентрации глюкозы в пробе от изменений оптической плотности
- •Задание 10.7.1. Исследование образца крови на анализаторе МЕК-6400J/К
- •РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ
- •Задание 11.4.1. Ознакомление с метордом автоматической фотоколориметрии
- •РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
- •РАЗДЕЛ 1
- •РАЗДЕЛ 2
- •РАЗДЕЛ 3
- •РАЗДЕЛ 4
- •РАЗДЕЛ 5
- •РАЗДЕЛ 6
- •РАЗДЕЛ 7
- •РАЗДЕЛ 8
- •РАЗДЕЛ 9
- •РАЗДЕЛ 10
- •РАЗДЕЛ 11
- •Приложение. Перечень научного оборудования, использованного в лабораторном практикуме
РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ
РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ
3.Перемешать содержимое с помощью вортекса, сбросить его на дно пробирок кратковременным центрифугированием.
4.Ввести в память амплификатора программу амплификации для данной смеси:
1)95 °С – 3 мин,
2)94 °С – 1 мин,
3)55 °С – 1 мин,
4)72 °С – 1 мин 30 с.
5.Повторить шаги 2–4 в течение 30 циклов.
5)72 °С – 10 мин
6)4 °С – 5 мин
6.Поставить пробирки в нагретый до 95 °С блок амплификатора, закрыть термоблок крышкой. Запустить программу амплификации.
7.По окончании амплификации проанализировать размер и количество полученных ампликонов электрофорезом в 1 %-м геле агарозы (наносить 1/10 часть реакции). В одну из лунок обязательно нанести отрицательный контроль амплификации! Если в нем обнаружена амплифицированная ДНК, это свидетельствует о контаминации ПЦР-смеси в процессе сборки либо о наличии ДНК-контаминации компонентов набора для ПЦР. Контаминированные ампликоны анализируемых образцов не могут быть использованы для секвенирования.
8.Если в отрицательном контроле нет следов контаминации, ПЦРпродукты исследуемого образца перед секвенированием необходимо очистить от примеси ДНК-полимеразы экстрагированием смесью фенола и хлороформа 1:1, а затем осадить ДНК из раствора этанолом.
9.Для секвенирования используют те же праймеры, что и для ПЦР, и ПЦР-продукты в количестве 250–500 нг на каждые 1000 пар нуклеотидов.
Задание 1.6.3. Проведение секвенирования
Процедура секвенирования подробно описана в работе 1.5 «Определение нуклеотидной последовательности на секвенаторе ALFexpress II DNA».
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
68 |
РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ
РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ
Задание 1.6.4. Анализ полученных данных
Порядок выполнения работы
1.По окончании процедуры секвенирования полученные данные обрабатываются в программе ALFwin Sequence Analyzer 2.11. (поставляется в комплекте программ автоматического секвенатора).
2.Нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК сравниваются с последовательностями баз данных Интернета GenBank
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/] или EMBL [http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html] в режиме on-line с помощью программы BLAST или FASTA. Результатом работы программ является список нуклеотидных последовательностей, близкородственных анализируемой.
3.Для дальнейшего сравнительного анализа изучаемая нуклеотидная последовательность должна быть выровнена (английский термин «aligned»)
снесколькими гомологичными последовательностями генов 16S рРНК из баз данных с помощью программы ClustalW [on-line-версия http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html]. Построение филогенетических де-
ревьев, основанных на сравнении генов 16S рРНК, производится с помощью neighbor-joining-метода, реализованного в пакете программ TREECON [бесплатная версия на официальном сайте http://biocwww.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html].
Контрольные вопросы
1.Какие из молекул, содержащихся клетке, могут повлиять на выделение ДНК?
2.На каких принципах основан метод ПЦР?
3.Зачем нужны праймеры и как выбрать их последовательность?
4.Какие экспериментальные условия необходимо соблюдать при постановке ПЦР? С чем это связано?
5.Что такое Tаg-полимераза? Что должно находиться в реакционной смеси для ее эффективной работы?
6.Как происходит разделение ДНК-фрагментов во время электрофоре-
за?
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
69 |