2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

Глава 18	Пептидные нуклеиновые кислоты

Большинство доступных коммерческих PNA праймеров созданы для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Компания Dako одной из первых стала разрабатывать PNA праймеры и системы диагностики, ориентированные преимущественно на диагностику раков. Первым диагностическим PNA праймером на рынке стал Telomere PNA FISH Kit.

Этот анализ, придуманный и разработанный группой Peter Lansdorp в лаборатории Terry Fox в Britrsh Columbia Cancer Research Center, позволяет быстро и чувствительно визуализировать длину

теломеразной повторяющейся последовательности на концах каждой хромосомы [2]. Этот набор можно использовать для определения теломерного участка генома человека и других видов позвоночных в интерфазных ядерах, метафазного распределения или проточной цитометрии. PNA анализ позволяет изучать взаимоотношения между длиной теломеры и раком, старением и другими событиями, поскольку доказано, что длина теломера является главным регулятором емкости клеток для деления (рис. 18.3).

		22q11
	23					1
					Breakpoint
BCR-Downstream									BCR-Upstream
408 kb									333 kb

Рис. 18.3. Человеческий ген BCR состоит из 23 экзонов, охватывающих регион в 135 kb на хромосоме 22, плечо q11. Y5403 – смешанный праймер, основанный на сочетании ДНК и PNA и содержащий два ДНК праймера и немеченый PNA блокирующий праймер. ДНК FISH праймеры – смесь ДНК праймера, меченного Texas Red (BCR-активирующая последовательность) покрывающая 333 kb центромера до области локализации сайта инициации реаранжировки BCR и флуоресцирующий ДНК-праймер (BCR-Downstream), покрывающего 408 kb теломера до области локализации сайта инициации реаранжировки.

Недавно PNA включен в панель цитогенетических праймеров для FISH диагностики рака, для

улучшения результата анализа. Каждый праймер FISH, который включал сплит-сигнал и подразделенный сигнал категорий FISH праймера, состоит из двух фрагментов ДНК (меченных зеленым и красным флуорохромом), комплементарных к определенному участку хромосомы, которые чувствительны к реаранжировкам при заболеваниях крови и лимфопролиферативной системы.

Панель FISH праймеров используется для диагностики злокачественных гематологических

заболеваний: юкстаположительный или разделение зеленого и красного сигналов ДНК праймеров в интерфазных ядрах опухолевых клеток указывает на то, что ген перекомпановывается, что специфично для лейкемии или лимфомы. Генетическая диагностика в этих условиях может решить генетические неоднозначности, которые часто мешают диагностике традиционным иммунофенотипированием, но ранний FISH требует проведения сложной длительной процедуры, доступной лишь некоторым высокоспециализированным лабораториям. Введение PNA технологий в смеси прай-

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 179

Пептидные нуклеиновые кислоты	Глава 18

меров для FISH упростило и ускорило анализ, сделав его доступным для большего количества лабораторий. Эта уникальная смесь праймеров содержит несколько немеченых последовательностей PNA, которые гибридизуются с микросателлитными (высоко повторяющимися) последовательностями ДНК хромосом человека. Путем подавления неспецифического сигнала от меченных праймеров, который обычно мешает при таком анализе, PNA повышают соотношение сигнал/шум и улучшают чувствительность и специфичность этих тестов по сравнению с таковыми при использовании обычных FISH технологий. Доступна полная линия продукта, состоящая из двух дюжин смесей FISH праймеров, для диагностики большинства гемопоэтических опухолей.

Технологии PNA праймеров также применяется в наборах pharmacoDiagnostic® FISH kits для определения генетического статуса HER2 и TOP2A на парафиновых срезах фиксированных в формалине опухолей молочной железы. Это исследование – часть растущего арсенала специфических генетических тестов, помогающих патологу и онкологу поставить диагноз, определить прогноз и подобрать лечение для больных раком молочной железы. В наборах HER2 FISH pharmDx™ и

TOP2A FISH pharmDx™ используются как меченые, так и немеченые

180 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рис. 18.4. Предшественник B-ALL (B-клеточной острой лимфобластной лейкемии) с транслокацией BCR гена.

Рис. 18.5. Рак молочной железы (FFPE), окрашенный HER2 FISH pharmDxTM Kit, Dako Code K5331. Амплификация гена HER2 в опухолевых клетках (отношение HER2/CEN-17≥2).

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 18	Пептидные нуклеиновые кислоты

PNA праймеры. Немеченые PNA праймеры блокируют повторяющиеся последовательности, праймеры с флуоресцентной меткой генерируют зеленый сигнал, что позволяет выявлять центромеры

17 хромосомы. Количество зеленой метки в каждой клетке зависит от количества копий 17 хромосомы в клетке. Количество копий, подобно найденным генетическим последовательностям HER2 или TOP2A, формирует отношение ген/17 хромосома, что является численным выражением амплификаций или делеций. HER 2 FISH pharmDx™ Kit одобрен FDA как помогающий определить чувствительность опухолей молочной железы к лечению Герцептином® (трастуцзимабом). Набор TOP2A FISH pharmDx™ Kit также одобрен FDA для определения прогноза пациентов с высоким риском развития рака молочной железы.

Разработаны PNA праймеры для РНК последовательностей для использования в CISH с целью улучшения выявления метки. Самыми яркими примерами использования PNA праймеров в рутинной гистологической диагностике являются праймеры к РНК вируса Epstein-Barr (EBV EBER) и κ− и λ−

легким цепям иммуноглобулина человека. Праймер EBV EBER – смесь PNA, позволяющих выявить две нуклеотидные последовательности тарнскрипта РНК, EBER1 и EBER2, производимые вирусом в латентной фазе инфекционного процесса, при таких состояниях, как лимфома Hodgkin, Burkit, назофаригнеальная карцинома и мононуклеоз. Как только EBER транскрипты перестают транслироваться в белок, их нельзя обнаружить с помощью антител рутинным IHC методом.

Определение в лимфоцитах предположительных лимфом РНК только одной легкой цепи, κ или

λ (рестрикция легких цепей), указывает на моноклональность лимфоидной популяции, что является признаком анаплазии. Использование PNA CISH технологий позволяет визуализировать мРНК легких цепей на месте их синтеза – в цитоплазме, что является преимуществом данного метода перед иммунофенотипированием IHC, для которого характерен высокий уровень фонового окрашивания за счет секреции антител в сыворотку и межклеточную жидкость.

Значительные преимущества использования PNA в других областях медицины:

•микробиология – доступны коммерческие системы выявления Candida, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus sp. в мазках гомокультур, системы для определения генов, ассоциированных с лекарственной устойчивостью Staphylococcus aureus [3, 4];

•генетические исследования и наследственные заболевания – в литературе встречаются описания преимуществ применения PNA в исследованиях практически любого формата для диагностики разных генетических заболеваний [5];

•генная терапия – PNA используется для управления экспрессией генов в моделях заболеваний, с помощью различных техник, среди которых античувствительность, антигены и

приманки для факторов транскрипции [6].

Использование PNA технологий позволило упростить и ускорить ряд диагностических методик, что, в свою очередь, позволило использовать трудоемкие и быстрые методы исследования во многих лабораториях при сложных диагностических ситуациях. Явные преимуще-

ства PNA праймеров обеспечивают развитие этого направления и внедрение их в новые методы

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 181

Пептидные нуклеиновые кислоты	Глава 18

анализа, что упрощает сложные диагностические процедуры и устанавливает новые стандарты в диагностике и лечении пациентов. Точная оптимизация и коммерческое производство стандартизованных PNA реагентов гарантирует технологическую поддержку в обеспечении новых методов исследования.

Литература:

1.Egholm M, Buchardt O, Christensen L, Behrens C, Freier SM, Driver DA, et al // PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the WatsonCrick Hydrogen Bonding Rules. – Nature. – 1993. – 363. – p. 556-8.

2.Lansdorp P, Verwoerd n, van de Rijke F, Dragowska V, Little MT, Dirks R, et al // Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. – Hum Mol Genet. – 1996. – 5. – p. 685-91.

3.Forrest GN. PNA FISH: present and future impact on patient management // Expert Rev Mol Diag. – 2007.

– 7. – p. 231-6.

4.Marketed by AdvanDx Inc.

5.Pellestor F, Paulasova P, Hamamah S. Peptide nucleic acids (PNAs) as diagnostic devices for genetic and cytogenetic analysis // Curr Pharm Des. – 2008. – 14.

– p. 2439-44.

6.Karkare S, Bhatnagar D. Promising nucleic acid and mimics. – p. characteristic features and applications of PNA, LNA, and morpholino // Appl Microobiol Biotechnol. – 2006. – 71. – p. 575-86.

182 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 19 | Контроли

Ole Feldballe Rasmussen PhD

перевод Л.В. Москвиной

Различия в иммуногистохимических анализах могут быть обусловлены рядом факторов: разными фиксаторами и временем фиксации, ежедневной разницей температур, различием в исполнении протокола разными сотрудниками или состоянием реагентов в каждый конкретный день.

Большинство поставщиков реагентов предпринимают меры, гарантирующие качество их

продукции. Так как на качество иммуногистохимической окраски может повлиять большое количество факторов, не всегда можно быть уверенным в правильности окраски. Поэтому важно использовать контрольные срезы и реагенты при анализе результата диагностической иммунохимической реакции. Также важно понимать, какую информацию может дать контроль. В этой главе рассмотрены типы контролей, которые следует применять в диагностической лаборатории.

Контроль реагентов

Самыми важными иммунохимическими реагентами являются первичные антитела. При низкой специфичности первичных антител результат IHC реакции может быть некорректным. Несмотря на гарантию качества производителя, перед использованием стоит проверить качество первичных антител.

На этапе разработки, для проверки специфичности первичных антител большинством производителей используются различные иммунохимические методы. Среди них иммуноэлектрофорез, Western Blot, метод двойной диффузии, ракетный иммуноэлектрофорез и ELISA. Помимо этого, можно использовать трансгенные клетки, синтезирующие как специфичный антиген, так и близкие к нему по строению. Несмотря на это, первичные антитела необходимо тестировать и иммуногистохимически. В большинстве случаев, компании-производители тестируют антитела сначала на положительном контроле, чтобы подобрать оптимальные разведения и протоколы реакции. После этого, проводится иммуногистохимическая реакция с расширенной панелью тканей, для каждой из которых заранее известно, содержит ли она искомый антиген. Для новых антител производитель обычно осуществляет контроль качества для подтверждения чувствительности и специфичности, заявленных при разработке.

Проверка реагентов должна производиться по утвержденному протоколу с использованием стандартных реагентов, разведений, растворителей, времени инкубации и сроков, а любые изменения процедуры – регистрироваться в соответствующих протоколах. В лабораториях с непостоянным микроклиматом важно также обеспечить рекомендуемую влажность и температуру.

Отрицательный контроль

Для моноклональных первичных антител неспецифический отрицательный контроль реагентов можно проводить различными методами. Лучшим из них является использование того же изотипа,

представленного в той же концентрации, разведенного тем же растворителем и не дающего специ-

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 183

Контроли	Глава 19

фической реакции с исследуемой человеческой тканью. Менее предпочтительным является использование смеси антител, в которой представлены все наиболее важные подтипы иммуноглобулинов. Наконец, можно использовать растворитель сам по себе, который однако, не является ни достаточно эффективным, ни желаемым выбором контроля.

Для поликлональных антител отрицательным контролем реагентов может выступать раствор фракций иммуноглобулинов или нормальная (неиммунизированная) цельная сыворотка того животного, из крови которого выделены антитела. Отрицательный контроль реагентов должен использоваться в той же концентрации и с тем же растворителем, что и тестируемые антитела.

Использование одних протоколов для первичных антител и отрицательного контроля предусматривает обработку последним серийных срезов каждого образца, что позволяет оценить неспецифическое окрашивание некоторых участков тканей.

ПРИМЕЧАНИЕ: при обработке серийных срезов растворами двух или более антител, следует иметь в виду, что области отрицательного окрашивания на одном препарате могут служить негативным контролем или контролем неспецифического связывания для других антител.

В тех случаях, когда необходимо оценить вероятность неспецифического взаимодействия, обусловленного чем-то иным, кроме первичных антител, возможно окрашивание дополнительных образцов ткани выбранными реагентами. Например, ткань можно обработать только вторичными антителами и/или ферментом, после чего субстратом/хромогеном. В том случае, если неспецифическое окрашивание, вызвано активностью эндогенных ферментов, возможно обработка ткани только субстратом/ферментом.

Контрольные образцы ткани

Контрольные образцы ткани могут быть положительными и отрицательными, внешними и

внутренними. Каждый имеет определенное назначение.

Положительный контроль

Положительный контроль позволяет оценить соблюдение техники окрашивания и правильность выявления метки. При обработке контрольных образцов необходимо соблюдать рекомендованную технику демаскировки антигенов. Результат положительного контроля зависит от используемых реагентов, корректного их применения, соблюдения времени и температуры инкубации.

Эти контроли также являются индикаторами правильной подготовки ткани. Для максимальной точности, образцы контрольных тканей должны обрабатываться так же, как и материал пациента. Для лучшей сохранности антигенов, биопсийный/аутопсийный/хирургический материал необходимо зафиксировать как можно раньше. Об этом подробнее в разделе «Контроль обработки образца».

На каждую партию диагностических стекол должен приходиться один положительный контроль

ткани. В идеале, в данном контроле должна быть представлена разная интенсивность окраски: от

184 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 19	Контроли

слабой до выраженной. В том случае, если это невозможно, стоит выбрать образец ткани со слабоположительным результатом, так как это позволит наилучшим образом оценить, является ли окрашивание диагностического материала слишком слабым или очень выраженным.

Контрольный образец может окрашиваться как отдельным стеклом, так и монтироваться на одно предметное стекло с диагностическим материалом. При выборе второго варианта, возможно использование небольших массивов с выбранной тканью или линий клеток для диапазона окрасок. В этом случае одна из тканей может быть положительным контролем, другая – отрицательным (см. ниже).

Если в положительном контроле не получено ожидаемого результата, результаты диагностического теста должны быть аннулированы.

При длительном хранении срезов с контрольных тканей необходимо удостовериться, что антигены устойчивы к условиям хранения.

Внутренний контроль

Внутренний контроль, также называемый «встроенным», содержит искомые антигены как в нормальных тканевых структурах, так и в исследуемых. Поэтому можно обойтись без внешнего положительного контроля. Это идеально, так как исследуемые и контрольные структуры подвергаются одной и той же обработке. Примером внутреннего контроля может служить обнаружение белка S-100 как в клетках меланомы, так и в периферических нервных сплетениях и дендритных клетках. Среди других примеров можно привести виментин, распространенный повсеместно, и десмин, представленный в мышечной оболочке кровеносных сосудов.

Отрицательный контроль

Положительное окрашивание отрицательного контроля может свидетельствовать о неспец-

ифичности антител или неспецифическом фоновом окрашивании. Как и в случае положительного контроля, образцы тканей отрицательного контроля должны обрабатываться так же, как и образцы пациента. Кроме того, выбранная в качестве отрицательного контроля ткань не должна содержать исследуемых специфических антигенов. Например, отрицательным контролем при выявлении поверхностного антигена гепатита В может выступать образец ткани здоровой печени или HER2/neu отрицательная ткань при реакции с Dako HercepTestTM Kit.

Если препарат отрицательного контроля окрашивается сывороткой, результат реакции с исследуемым образцом нельзя оценивать.

Контроль обработки образца

Нет однозначного способа, позволяющего подтвердить качество проводки ткани. Как вариант, H.Battifora [1] предложил использовать виментин, присутствующий практически во всех образцах тканей. К тому же клон vimentin V9 взаимодействует с эпитопом, который частично изменяется при

фиксации в формальдегиде и может быть принят как индикатор качества фиксации ткани. При

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 185

Контроли	Глава 19

правильной проводке реакция виментина в сосудах ткани и стромальных клетках должна быть одинаковой. Одинаково хорошее выявление виментина указывает на качественную фиксацию образца, в то время как неравномерное окрашивание характеризует неравномерную и неоптимальную фиксацию. В этом случае для анализа образца пациента следует использовать только участки с равномерно выраженным окрашиванием.

Контрольные линии клеток

В некоторых IHC тестах, утвержденных FDA (US Food and Drug Administration), в качестве контролей используются линии клеток, входящие в состав диагностических наборов или продающиеся отдельно. Эти клетки специально выведены для оценки выявления антигенов и должны быть включены в каждую процедуру окраски, как дополнительный контроль. Как и в случае с контрольными образцами тканей, контрольные линии клеток могут быть положительными или отрицательными. Положительный клеточный контроль позволяет оценить демаскировку антигена, блокирование эндогенных ферментов и активности белков, инкубацию с первичными антителами и визуализацию. Клетки отрицательного контроля позволяют оценить специфичность и, в зависимости от характеристик выбранной линии клеток, могут также предоставлять информацию о дефектах процедуры реакции.

Идеальная линия клеток отрицательного контроля содержит настолько мало выявляемого антигена, что при правильном проведении IHC реакции окрашивания не будет. В тоже время, антигена должно быть достаточно, для выявления слабой положительной реакции, если реакция проводилась в условиях, обеспечивающих слишком сильное окрашивание антигена.

Идеальная линия клеток положительного контроля должна содержать количество антигена, обеспечивающее среднюю интенсивность окрашивания, что позволит оценить как слишком выраженную, так и слишком слабую реакцию образца.

В качестве примера использования культур клеток для контролей можно привести HercepTestTM

Kit от DAKO, который содержит клетки трех линий: отрицательного контроля, 1+ (слабоположительной) и 3+ (выраженной). Все культуры клеток помещены на одном предметном стекле.

На рис. 19.1 представлен контрольный препарат HercepTestTM. В состав наборов для флуоресцентной гибридизации in situ, например, в HER2 FISH pharmDxTM, клеточные контроли не входят, потому что в них есть пробы, как для определения выявляемого гена, так и соответствующей центромеры, чтобы можно было определить уровень амплификации гена. В данном случае, центромерная проба выступает как внутренний контроль.

Программы контролей

Результат иммуногистохимической реакции не имеет количественной меры. Напротив, чаще всего результат зависит от субъективной оценки врача и его опыта [2-4]. Поэтому контроль качества и уверенности имеет большое значение и требует внимания, как со стороны производителей, так и со стороны сотрудников лаборатории.

186 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 19	Контроли

Negative Cell Line

1+ Cell Line

3+ Cell Line

Рис. 19.1. Контрольные линии клеток из HercepTestTM

Некоторые научные компании имеют программы подтверждения качества или службы контроля качества, которые не заменяют национальные требования по внутреннему контролю качества.

Одна из таких международных систем – некоммерческая организация Национальная система внешней оценки качества исследований Великобритании (United Kingdom National External Quality Assessment Service, UK NEQAS), основанная в 1995 году для «повышения уровня образования и общественного здоровья путем внешней оценки качества медицинских лабораторных исследований» (www.ukneqas.org.uk). UK NEQAS состоит из нескольких внутренних подразделений (EQA), каждое из которых специализируется на каком-либо направлении, например, скрининге заболеваний молочной железы.

В США Американская Коллегия Патологов (College of American Pathologist, CAP) осуществляет схожие профилактические проверки работы лабораторий, входящих в ее состав (www.cap.org).

Кроме того, стоит упомянуть такую международную систему контроля качества, как Nordic Immunohistochemical Quality Control (NordiQC), организованную в 2003 году. В ней участвуют более 100 лабораторий.

Каждая организация обеспечивает профессиональное тестирование проведения IHC исследований участвующими лабораториями, отправляя им образцы тканей для выполнения исследований. После окрашивания, образцы из разных лабораторий собираются и сравниваются между собой, на основании чего формируется отчет.

Перспективы развития

Для подтверждения качества диагностики, значение иммуногистохимического контроля качества будет только возрастать. В ближайшие пять лет ожидается увеличение числа лабораторий, участвующих в программах контроля качества, и число аккредитованных лабораторий. Появление новых технологий будет содействовать более эффективному контролю качества.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 187

Контроли	Глава 19

Литература:

1.Battifora H // Am J Clin Pathol. – 1991. – 96. – p. 66971.

2.Taylor CR // Applied Immunohistochem. – 1993. – 1.

– p. 232-43.

3.Elias JM et al // Am J Clin Pathol. – 1989. – 92. – p. 836-43.

4.Taylor CR // Arch Pathol Lab Med. – 2000. – 124. – p. 945-51.

188 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/