2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

Глава 7		Метод тканевых мульти-блоков

Для информативных случаев необходимо проконвертировать 3 значения (по одному на столбик) для каждого случая в один результат, который дальше будет учитываться. Наиболее частые тактики – выбор максимального значения или среднего из наблюдаемых [6]. Каждый метод нормализации имеет свои преимущества, и свои ограничения.

Этап 2. Статистический анализ данных

Тесты, используемые для определения р-уровня зависят от типа используемых данных (числовые

или категориальные), а также от степени вариантности (количества степеней свободы) данных. Для простого анализа связей используются таблицы сопряженности признаков и критерий χ-квадрат. Для изучения распределения выживаемости большинство исследователей применяют график KaplanMeyer, а затем логарифмический ранговый критерий для определения различий в группах. Чаще всего материалы от пациентов делят на группы высокого и низкого риска на основе экспрессии новых биомаркеров. Некоторые коммерческие программные средства, как например программа X-tile [7], могут помочь в выборе точки отсечки. Эта точка должна быть подтверждена независимыми сериями случаев для оценки ее корректности. В настоящее время группой NCI-EORTC разработаны рекомендации REMARK (Reporting recommendations for Tumor Marker prognostic studies) [8], которые необходимо учитывать при использовании этих маркеров в клинической практике.

Литература:

1.Battifora H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest 1986;55:244-8.

2.Wan WH, et al. A rapid and efficient method for testing immunohistochemical reactivity of monoclonal antibodies against multiple tissue samples simultaneously. J Immunol Methods 1987;103:121-9.

3.Kononen, J., et al. Tissue microarrays for highthroughput molecular profi ling of tumor speciments. Nat Med 1998;4:844-7.

4.Chu P and Arber DA. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol 2000;113:374-82.

5.Badve SS, et al. Estrogenand progesterone-receptor status in ECOG 2197: comparison of immunohistochemistry by local and central laboratories and quantative reverse transcription polymerase chain reaction by central laboratory. J Clin Oncol 2008;26:2473-81.

6.Bentzen SM, et al. Multiple biomarker tissue microarrays: bioinformatics and practical approaches. Cancer Metastasis Rev 2008;27:481-94.

7.Camp RL, et al. X-tile: a new bio-informatics tool for biomarker assessment and outcome-based cut-point optimization. Clin Cancer Res 2004;10:7252-9.

8.McShane LM, et al. Reporting recommendations for tumor marker prognostic studies (REMARK). J Natl Cancer Inst 2005;97:1180-4.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 79

Глава 8 | Демаскировка антигенов

George L Kumar PhD, Lars Rudbeck PhD*

перевод Н.В. Даниловой

В большинстве случаев образцы ткани фиксируются в формалине и затем заливаются в парафиновые блоки. Формалин сохраняет морфологию ткани, но в то же время меняет трехмерную структуру тканевых белков. Эти изменения могут привести к модификации антигенных эпитопов и/или изменению электростатических взаимодействий. Потеря эпитопа антигеном делает невозможным его взаимодействие с паратопом антитела и может быть восстановлена только путем демаскировки эпитопа. Уменьшение негативных электростатических изменений в антигенах снижает авидность иммунной реакции и может быть компенсировано пролонгированной инкубацией с первичным антителом [1] или использованием разнообразных разбавителей для антител [2].

Разработка первичных антител, реагирующих с резистентными эпитопами (резистентными после фиксации), в некоторой степени улучшила ситуацию. Однако, введение в практику ферментной обработки тканевых срезов и, в особенности, методов температурной демаскировки антигенов, нацеленных на восстановление аффинности и авидности иммунной реакции, сделало эти методы обязательным этапом предварительной обработки при иммуногистохимическом исследовании (IHC) [3].

Необходимо правильно определить некоторые понятия. Некоторые термины, такие как «температурное восстановление эпитопа» (HIER) и «демаскировка эпитопа» используются для описания процесса разрушения эпитопа во время фиксации формалином. «Температурное целевое восстановление» (HITR) – другой широко используемый термин, под которым подразумевается целевое восстановление нуклеиновых кислот перед гибридизацией in situ. И наконец, термин «температурное восстановление антигена» (HIAR) используется для описания восстановления антигенности, потерянной в результате формалиновой фиксации [3]. В данном руководстве для обозначения восстановления антигенов будет использоваться термин HIER, как наиболее часто используемый в имму-

ногистохимической практике.

Рутинное использование HIER после воздействия формалина на антигены продемонстрировало хороший эффект в отношении снижения погрешностей результатов IHC, возникающих из-за разницы во времени фиксации [3-5]. Также рекомендуется использовать кусочки ткани одинакового размера для фиксации. Оба эти правила вносят значимый вклад в стандартизацию IHC. Однако, появление большого количества HIER-методик в последние 10-15 лет внесло некоторую путаницу и усложнило стандартизацию. Необходимо отметить, что применение методики HIER потребовало улучшения методов сцепления срезов со стеклами (адгезии) по сравнению с рутиной окраской гематоксилином и эозином, так как срезы обрабатываются при температуре 60-70°С.

Dako длительное время оценивает и сравнивает публикуемые процедуры для восстановления

эпитопов и приводит обновленные рекомендации для того, чтобы помочь специалистам по IHC получать оптимальные и воспроизводимые результаты окрашивания при использовании первичных антител и визуализационных систем производства компании Dako [6-9].

* Цит. по: Dako Education Guidebook — Demasking of Antigens (2008)

80 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 8	Демаскировка антигенов

В этой главе будут описаны следующие протоколы для восстановления антигенов:

1.Методы с использованием водяной бани

А.Dako PTLink.

B.Традиционный метод с использованием водяной бани.

2.Обработка в ретривере.

3.Обработка в автоклаве.

4.Обработка в микроволновой печи.

5.Ферментная обработка.

6.Комбинированная ферментная обработка и HIER.

7.Комбинированная депарафинизация и целевое восстановление.

Несмотря на широкое рапространение цитратных буферов с рН 6,0, было показано, что буферы с высоким рН широко применимы для различных антител [10-11]. У каждой лаборатории есть возможность определить, какой из представленных буферов оптимален для каждого антигена/антитела и использовать их систематически. Несмотря на то, что 0.01 М цитратный буфер с рН 6,0 (коды К8005/ S1700/S1699) исторически был самым распространенным раствором для демаскировки антигенов, сейчас внедряются буферы с высоким рН (коды К8004/S2368/S2367), демонстрирующие лучшие конечные результаты (табл. 8.1.).

Таблица 8.1.

РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ДЕМАСКИРОВКИ АНТИГЕНОВ

Наименование продукта		Код
Target Retrieval Solution, pH 6,1, Ready-to-Use		S1700
Target Retrieval Solution, pH 6,1, 10x Concentrated		S1699
Target Retrieval Solution, pH 9, Ready-to-Use		S2368
Target Retrieval Solution, pH 9, 10x Concentrated		S2367
FLEX Target Retrieval Solution, Low pH		K8005
FLEX Target Retrieval Solution, High pH		K8004
Target Retrieval Solution, pH 9, 10x Concentrated, (3-in-1)		S2375

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 81

Демаскировка антигенов	Глава 8

Следующее ниже описание протоколов демаскировки является только рекомендательным. Каждая лаборатория может сравнивать эти методы и выбирать наиболее подходящий протокол для постоянного использования. Общей рекомендацией для HIER методов является необходимость контроля параметров температуры, а также фактической температуры в определенные интервалы времени.

Методы с использованием водяной бани

А. Dako PTLink

Dako PTLink упрощает восстановление антигена с использованием водяной бани с помощью автоматизации и использования специализированных протоколов, включающих в себя предварительный нагрев, восстановление антигена и дальнейшее охлаждение. Обычно восстановление антигена длится 20 минут при температуре 97°С.

Необходимые материалы

Dako PTLink (код РТ100/РТ101).

Кассета для стекол (код S3704).

Раствор для демаскировки антигенов.

Стекла FLEX IHC (код К8020) или другие адгезивные стекла.

Индивидуальные защитные материалы.

Протокол

Работать с любыми реагентами, используемыми в PTLink, необходимо в защитных перчатках.

1.Депарафинировать и регидратировать срезы.

2.Приготовить рабочий раствор из выбранного для демаскировки антигена в соответствии с рекомендациями.

3.Налить в резервуар 1,5 л выбранного раствора для демаскировки антигена.

4.Накрыть резервуар крышкой. Зафиксировать крышку с помощью наружной предохранительной защелки.

5.Установить необходимые параметры:

a.рекомендуемое время 20-40 минут;

b.температура 97°С;

c.предварительный нагрев 65°С (возможно повышение до 85°С).

82 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 8	Демаскировка антигенов

6.Нажать кнопку [RUN] на каждом резервуаре (на дисплее появится значение PREHEAT). Дождаться, пока раствор нагреется до выбранной температуры предварительного нагрева.

7.Открыть PTLink и погрузить кассету с депарафинизированными стеклами в предварительно нагретый раствор для демаскировки антигена*.

8.Накрыть резервуар крышкой. Зафиксировать крышку с помощью наружной предохранительной защелки.

9.Нажать кнопку [RUN] на каждом резервуаре для начала нагрева. На дисплее появится значение WAPM-UP и крышка будет заблокирована.

10.PTLink нагреет раствор до выбранной ранее температуры, затем начнет отсчет времени, в течение которого стекла будут находиться внутри.

11.Когда цикл демаскировки будет закончен, на дисплее появится значение COOL. Цикл охлаждения закончится, когда температура достигнет установленной температуры предварительного нагрева.

12.Затем, после охлаждения, на экране появится значение DONE и крышка будет разблокирована автоматически.

13.Открыть PTLink и извлечь кассеты со стеклами из резервуаров. Далее немедленно поместить стекла на промывочную станцию PTLink (код РТ109), содержащую разведенный при комнатной температуре промывочный буфер Dako (10x) (код S3006).

14.Промыть стекла в течение 1-5 минут.

15.Поместить стекла в автостейнер Dako и продолжать окрашивание.

B. Традиционный метод с использованием водяной бани

Одним из важных преимуществ данного метода является его широкая доступность. Наиболее часто используется температура, близкая к точке кипения воды (95-99°С).

Необходимые материалы

Водяная баня с контролем температуры.

Кассета для стекол (код S3704).

Контейнер (резервуар) для инкубации с крышкой.

Раствор для демаскировки антигенов.

Tris-Buffered раствор хлорида натрия (код S3001).

Силанизированные стекла (код S3003) или стекла с другим адгезивным покрытием.

*В качестве альтернативы можно использовать раствор для депарафинирования и демаскировки антигена «три в одном». (См. с. 88 «Комбинированное депарафинирование и восстановление антигена»).

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 83

Демаскировка антигенов	Глава 8

Термометр.

Индивидуальные защитные материалы.

Протокол

Работать с любыми реагентами, используемыми в PTLink, необходимо в защитных перчатках.

1.Депарафинировать и регидратировать срезы.

2.Заполнить контейнер достаточным количеством раствора для демаскировки антигена так, чтобы раствор покрывал стекла и установить температуру равную 95-99°С.

3.Поместить стекла в кассетах в предварительно нагретый раствор для демаскировки, накрыть контейнер крышкой и инкубировать стекла в течение 20-40 минут после того, как вода достигнет необходимой температуры.

4.Извлечь контейнер из бани и охлаждать содержимое при закрытой крышке в течение 20 минут при комнатной температуре.

5.Промыть стекла в трис-буферном растворе хлорида натрия (TBS) или дистиллированной водой комнатной температуры. Важно помнить, что при извлечении стекол из раствора они не должны высохнуть.

6.Переместить стекла в TBS.

7.Продолжить иммуногистохимическое окрашивание.

Использование ретривера

Ретриверы способны создавать и поддерживать давление 103 кПа/15 и температуру до 120°С

при этом давлении. Соответственно, можно установить его на 125°С и использовать для демаскировки антигена. Рекомендуется использовать ретриверы из нержавеющей стали, поскольку приборы из алюминия подвержены коррозии под действием некоторых растворов для демаскировки. Как альтернативу ретриверу из нержавеющей стали можно заполнить раствором для демаскировки антигена пластиковые контейнеры для стекол, и поместить на дно ретривера в дистилированную воду.

Необходимые материалы

Ретривер из нержавеющей стали, предпочтительно с электронным управлением.

Металлические или пластиковые кассеты для стекол.

Раствор для демаскировки антигена.

Силанизированные стекла (код S3003) или стекла, покрытые другим подходящим адгезивом.

Трис-буфер (TBS) (код S3001).

84 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 8		Демаскировка антигенов

Контейнер для инкубации (опция).

Персональные защитные материалы.

Протокол

Рекомендуется надевать на лицо защитную повязку, а на руки – перчатки.

1.Депарафинировать и регидратировать стекла.

2.Заполнить ретривер достаточным количеством раствора для демаскировки антигена так, чтобы он полностью покрывал стекла. В другом варианте заполнить раствором для демаскировки только контейнер для инкубации со стеклами и налить в ретривер около 500 мл (или более) дистилированной воды

3.Довести содержимое до температуры, близкой к точке кипения, поместить кассеты со стеклами в раствор для демаскировки, закрыть ретривер и включить снова, чтобы растворы дошли до точки кипения. Для программируемых ретриверов: установить целевую температуру и время нагрева, поместить кассеты со стеклами в раствор для демаскировки, закрыть ретривер и начинать процедуру демаскировки при комнатной температуре.

4.Кипятить от 30 сек до 5 мин, перед открытием дать ретриверу остыть 20 мин до комнатной температуры. Перед открытием выпустить остаточное давление. Программируемый ретривер следует открывать, после окончания программы.

5.Перенести стекла в промывочный буфер (TBS) комнатной температуры. При переносе стекол из контейнера очень важно следить, чтобы стекла не высохли.

6.Продолить IHC согласно стандартному протоколу.

Использование автоклава

Автоклав, также как и ретривер, позволяет установить давление в 15 фунт/кв. дюйм (103 кПа) и поддерживать температуру 120°С на протяжении всего цикла [12-13].

Необходимые материалы

Стендовый измерительный автоклав.

Металлические или пластиковые кассеты для стекол.

Контейнер для инкубации.

Раствор для демаскировки антигена.

Силанизированные стекла (код S3003) или стекла, покрытые другим подходящим адгезивом.

Трис-буфер (TBS) (код S3001).

Персональные защитные материалы.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 85

Демаскировка антигенов	Глава 8

Протокол

Рекомендуется надевать на лицо защитную повязку, а на руки – перчатки.

1.Депарафинировать и регидратировать стекла.

2.Поместить стекла в пластиковую или металлическую кассету.

3.Заполнить контейнер для инкубации достаточным количеством раствора для демаскировки антигена (обычно 250 мл), чтобы он покрывал стекла. Поместить в контейнер кассету со стеклами и закрыть.

4.Поместить контейнер в автоклав и следовать инструкции в руководстве пользователя.

5.Установить температуру 120°С и давление 103 кПа, а также время 10-20 минут. Начать процесс.

6.После отвода давления, открыть крышку и вытащить контейнер со стеклами из автоклава.

7.Промыть стекла в промывочном буфере (TBS) или дистилированной воде. При переносе стекол из контейнера очень важно следить, чтобы стекла не высохли.

8.Перенести стекла в TBS.

9.Продолжать IHC согласно стандартному протоколу.

Использование предварительной ферментативной обработки

Как и другие методы предварительной обработки, данный метод может корректироваться в зависимости от качества фиксации материала внутри конкретной лаборатории. Данный метод необходимо модифицировать (разведение фермента и время инкубации, а также необходимость нагрева) в зависимости от условий фиксации материала в отдельной лаборатории. В качестве примера антигенов, для которых чаще всего используется предварительная ферментная обработка, можно привести

цитокератины и иммуноглобулины.

Доступные протеолитические ферменты фирмы Dako:

Протеиназа К, (Концентрированная), (код S3004).

Протеиназа К, Ready-to-Use, (код S3020).

Пепсин (код S3002).

Протеолитический фермент, Ready-to-Use, (код S3007).

Необходимые материалы

Влажная камера.

Силанизированные стекла (код S3003) или стекла, покрытые другим подходящим адгезивом.

Протеолитический фермент, Ready-to-Use, (код S3007).

TBS (код S3001).

86 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

Глава 8	Демаскировка антигенов

Протокол

1.Депарафинировать и регидратировать стекла.

2.Разместить стекла горизонтально и нанести на них достаточное количество рабочего раствора фермента так, чтобы он полностью покрывал срезы (обычно 200-300 мкл).

3.Инкубировать некоторое время (обычно 5-15 минут).

4.Остановить ферментативную реакцию, промыть стекла дистиллированной водой или TBS.

Рекомендуется включать обработку ферментами в соответствующие протоколы автостейнеров. Для антител RTU обработка ферментом в протокол включена.

Для протеолитических ферментов Dako существуют следующие рекомендации:

Протеиназа К концентрированная, (код S3004) и Ready-to-Use, (код S3020):

Инкубация 6 минут при комнатной температуре обычно достаточна, однако может быть продлена до 15 минут.

Пепсин (код S3002):

Инкубация 10 минут при комнатной температуре обычно достаточна, однако может быть продлена до 15 минут.

Протеолитический фермент, Ready-to-Use, (код S3007):

Инкубация 5-10 минут при комнатной температуре достаточна.

Для получения детальной информации обратитесь к спецификации.

Комбинированная ферментативная обработка и HIER

Некоторые антигены гораздо эффективнее демаскировать с помощью комбинированной (фермент и HIER) предварительной обработки. К ним относятся некоторые цитокератины и легкие цепи иммуноглобулинов. Приведенный ниже протокол описывает метод предварительной обработки сначала протеиназой К, а затем HIER в водяной бане или в микроволновой печи.

Необходимые материалы:*

Силанизированные стекла (код S3003) или стекла, покрытые другим подходящим адгезивом.

Target retrieval solution, pH 6.0 (коды S1700, S1699 или S8005).

TBS (код S3001).

TBST, pH 7.6 (код S3006).

* Другие растворы для демаскировки антигенов используются согласно подобному протоколу, однако с корректировками, зависящими от индивидуальных потребностей лаборатории.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 87

Демаскировка антигенов	Глава 8

Протокол

1.Депарафинировать и регидратировать стекла.

2.Нанести на стекла протеиназу К и инкубировать в течение 5-10 минут.

3.Промыть в дистилированной воде и поместить стекла в TBS.

4.Провести температурную демаскировку антигена, используя PTLink, другую водяную баню, либо микроволновую печь по методике, описанной ниже.

Температурная демаскировка на водяной бане

5.Наполнить контейнер достаточным количеством раствора для демаскировки антигена (200 мл), чтобы он покрывал стекла, и нагреть контейнер до температуры водяной бани 95-99°С. Оставить контейнер в водяной бане и инкубировать 20-40 минут.

6.Извлечь контейнер из водяной бани, дать остыть вместе с содержимым, открыв крышку в течение 20 минут при комнатной температуре.

7.Промыть TBS или дистилированной водой комнатной температуры.

8.Перенести стекла в TBST, pH 7,6.

9.Продолжить IHC согласно стандартному протоколу.

Температурная демаскировка в микроволновой печи:

5.Наполнить контейнер достаточным количеством раствора для демаскировки антигена (200 мл), чтобы он покрывал стекла и установить кассету для стекол. Вставить стекла в и закрыть.

6.Поместить контейнер для инкубации в микроволновую печь и инкубировать 2 раза по 5 минут.

7.Между шагами 4 и 5 долить в контейнер достаточное количество дистилированной воды (50 мл), чтобы она покрывала стекла.

8.После второй обработки извлечь контейнер, дать остыть вместе с содержимым, открыв крышку в течение 20 минут при комнатной температуре.

9.Промыть дистилированной водой комнатной температуры.

10.Продолжить IHC согласно стандартному протоколу.

Комбинированное депарафинирование и демаскировка антигена

Комбинированное депарафинирование и HIER позволяют значительно сократить время демаскировки, и упростить процесс без потери качества. Использование Dako PTLink облегчает депарафинирование и демаскировку, позволяя автоматизировать процесс в один шаг.

88 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/