2 курс / Гистология / РУКОВОДСТВО_ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_ММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ_МЕТОДЫ

Руководство | Имунногистохимические методы

Первое издание на русском языке

	Редакторы перевода	Авторы перевода
	Франк Георгий Авраамович	Данилова Наталья Владимировна
	заведующий кафедрой патологической	ассистент кафедры физиологии и
	анатомии ГОУ ДПО РМАПО, член-	общей патологии, преподаватель курса
	корреспондент РАМН, профессор, доктор мед.	патологической анатомии
	наук | 125284 Москва, Поликарпова ул., д. 10	ГОУ ВПО ФФМ МГУ имени М.В.Ломоносова
	Мальков Павел Георгиевич	| 119192 Москва, Ломоносовский просп., д. 31,
		корп. 5
	доцент кафедры физиологии и общей
	патологии, руководитель курса патологической	Москвина Лариса Вячеславовна
	анатомии ГОУ ВПО ФФМ МГУ имени	ассистент кафедры физиологии и общей
	М.В.Ломоносова, кандидат мед. наук | 119192	патологии, преподаватель курса патоло-
	Москва, Ломоносовский просп., д. 31, корп. 5	гической анатомии ГОУ ВПО ФФМ МГУ
	Андреева Юлия Юрьевна	имени М.В.Ломоносова | 119192 Москва,
		Ломоносовский просп., д. 31, корп. 5
	старший научный сотрудник
	патологоанатомического отделения ФГУ	Гайфуллин Нуршат Минуллаевич
	МНИОИ им. П.А.Герцена, доктор мед. наук |	доцент кафедры физиологии и общей
	125284 Москва, 2-й Боткинский пр-д, д. 3	патологии, преподаватель курса
	Завалишина Лариса Эдуардовна	патологической анатомии ГОУ ВПО ФФМ МГУ
		имени М.В.Ломоносова, кандидат мед. наук |
	ведущий научный сотрудник
		119192 Москва, Ломоносовский просп., д. 31,
	патологоанатомического отделения ФГУ
		корп. 5
	МНИОИ им. П.А.Герцена, доктор биол. наук |
	125284 Москва, 2-й Боткинский пр-д, д. 3

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 9

Предисловие к английскому изданию

От имени компании DAKO, представляем пятое переработанное и дополненное издание руководства «Иммуногистохимические методы». Введение новых глав, описание новых техник, расширяют знания в области иммуногистохимии (IHC). В пятое издание также включены данные о флуоресцентной гибридизации in situ (FISH): методе, получающим широкое распространение в патологической

анатомии. Успешные элементы предыдущих изданий были сохранены. В то же время, были внесены необходимые изменения. Содержание руководства было тщательно отобрано на предмет предоставления актуальной информации о методах IHC и FISH, касающейся изготовления препаратов, окраски

ианализа изображений. Фактически каждое изменение, внесенное в данное издание, основывается на комментариях и предложениях коллег, пользовавшихся предыдущими изданиями. В руководство включены статьи, которые освещают теорию IHC, практические руководства, пошаговые протоколы

ипрактические применения методики в разнообразных областях. В это издание были введены следующие новые разделы: стандартизация методов IHC, идентификация ткани, пептидные нуклеиновые кислоты, микромассивы ткани, приготовление микропрепаратов ткани для анализа FISH, двухцветная CISH (хромогенная in situ гибридизация), фильтры для получения изображений при исследовании FISH. Глава, касающаяся демаскировки антигена, была полностью пересмотрена и усовершенствована – здесь приводятся утвержденные и стандартизованные протоколы. Другие дополнения касались информации об антителах, многоцветной окраске в IHC, иммунофлуоресценции, а также виртуальной микроскопии и анализе изображения. Мы надеемся, что это издание будет также полезно, как и предыдущие, и просим Вас делиться опытом с нами и с другими коллегами.

Выпуск нового издания требует привлечения талантливых людей и усилий множества специалистов. От имени Dako, мы благодарим всех участвовавших авторов, которые сделали возможным выпуск этого нового издания. Особую благодарность за содействие и предложения выражаем:

Clive R. Taylor MD, Dr. Phil. FRCPath, FRCP (Ir). University of Southern California, Los Angeles, CA, USA.

James F. Happel DLM (ASCP) HTL. Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA.

Dan Osborn. Omega Optical, Inc., Brattleboro, VT, USA.

J. Paul Robinson PhD and Jennifer Sturgis, BS. Purdue University Cytometry Laboratory (PUCL), Purdue University, West Lafayette, IN, USA.

Sunil S. Badve MD, FRCPath, Rashmil Saxena, BFA. HT(ASCP)CM. Clarian Pathology Laboratory, Indiana University. Indianapolis. IN. USA.

Robert M. Zucker PhD, US Environmental Protection Agency National Health and Environmental Effects Research Laboratory, Research Triangle Park, NC, USA.

David С. Spaulding PhD, Stellar Biotechnologies, Port Hueneme. CA. USA.

Thomas Boenisch. Retired Dako Consultant and Researcher, Santa Barbara, CA, USA.

10 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Предисловие

Betsy Spaulding MSc, Joachim Schmid PhD and Mark Verardo PhD. Dako R&D. Carpinleria. CA. USA.

Jon-Sverre Schanche PhD, Dave Stanforlh MS, Ulla Henriksen PhD, Sven Muller PhD, Steen H. Matthiesen PhD, Andreas Schenau MSc, Nanna К. Chnstensen РhD and Henrik Winther PhD. Dako Global R&D, Glostrup, Denmark.

Helene Metz and Peter Staben. Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark.

Jaime Sullivan BS. Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, USA.

Technical Support Group. Dako North America, Inc., Carpinteria, CA, USA.

George L. Kumar, PhD, главный редактор

Dako North America, Inc. Carpinteria, CA, USA.

Lars Rudbeck, PhD, научный редактор

Dako Denmark A/S., Produktionsvej. Glostrup, Denmark.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 11

Предисловие к русскому изданию

Иммуногистохимические методы занимают сегодня свое четкое место в патологоанатомических исследованиях. Это касается как научных разработок, так и повседневной практической деятельности морфологов. При этом наибольший удельный вес принадлежит онкоморфологии, однако иммуноморфологические исследования стали крайне необходимыми, а иногда и обязательными и при

широком спектре заболеваний неопухолевой природы. Специалистам хорошо известно «Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека» под ред. С.В.Петрова и Н.Т.Райхлина, выдержавшее уже три издания. Книга эта весьма востребована, поскольку в ней были обобщены все, имевшиеся к тому времени (2004 год) данные о возможностях ИГХ-диагностики опухолей основных нозологических форм.

Предлагаемое настоящее руководство (перевод с английского широко известного за рубежом

5-го издания под ред. G.L.Kumar и L.Rudbeck) целиком посвящено методологии и технологии иммуногистохимических методов, гибридизации in situ – флюоресцентной и хромогенной, освещены вопросы иммунохимии, энзимологии, рассмотрены варианты оборудования, расходные материалы, возможные ошибки и, что особенно важно, – контроль и стандартизация исследований.

Надеемся, что руководство окажет большую помощь врачам-патологоанатомам и лаборантам в их непростой, все усложняющейся работе.

Франк Г.А.,

доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАМН.

12 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Обозначения

Первичное	Антитело	Вторичное
антитело		антитело

Антитело	Вторичное	Тканевой
	F(ab1)2 антитело	антиген

Фермент HRP	Фермент АР	Биотиновая	Стрептавидин DBA (агглю-
(пероксидаза	(щелочная	метка	тинин из
хрена)	фосфатаза)		Dolichos bifl orus
			- долихос двух-
			цветковый)

Биотинил	Флуоресцентная	Прочный	Полимер
тирамид	метка	красный

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 13

14 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Глава 1 | Антитела

Thomas Boenisch MS

изменения внесены Betsy Spaulding, Henrik Winther PhD, Sussie Steen Jensen MS перевод Н.М. Гайфуллина

Основным реагентом, используемым во всех иммуногистохимических* методах, является антитело. Появление новых антисывороток, их фракций, иммуноглобулинов и моноклональных антител

к возрастающему числу тканевых антигенов, полезных в клинической диагностике, значительно увеличило количество и качество иммуногистологических методов. Чтобы лучше понять возможности методов иммуногистохимии, а также связанные с ними проблемы, необходимо иметь базовые знания об антителах, возможностях и ограничениях их применения.

Иммуноглобулины

Рис. 1.1. Схематическое изображение структуры молекулы иммуноглобулина. Она включает две одинаковые тяжелые (H) цепи и две одинаковые легкие (L) цепи. Меж- и внутрицепьевые дисульфидные связи (|—u—|) формируют структуру молекулы и способствуют ее стабильности.

Антитела принадлежат к группе белков, называемых иммуноглобулинами (Ig), которые присут-

ствуют в крови иммунизированных животных. Для сбора фракции сыворотки, которую часто называют антисывороткой, из крови удаляются клетки и фибрин. Существует пять основных классов иммуноглобулинов, которые перечисляются в порядке уменьшения их количества в плазме крови или сыворотке: IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. Каждый иммуноглобулин (рис. 1.1.) состоит из двух одинаковых тяжелых цепей (H) и двух одинаковых легких цепей (L). Н-цепи различаются по антигенным свойствам и структуре, и определяют класс и подкласс молекулы. Две L-цепи имеют тип каппа (κ) или лямбда (λ). Распределение κ и λ цепей различается во всех классах и подклассах иммуноглобулинов, а также между различными видами. Ковалентные межцепьевые дисульфидные связи соединяют L-цепь с Н-цепью и Н-цепь с Н-цепью. Принимая участие в образовании третичной структуры, они придают молекуле иммуноглобулина большую стабильность.

Из пяти классов иммуноглобулинов в данном разделе более подробно будут рассматриваться IgG и IgM, поскольку они чаще всего используются в иммуногистохимии. Если не указано иное, большинство данных о структуре IgG в этом тексте было получено из исследований человеческого IgG

подкласса IgG1.

*Используемый нами термин «иммуногистохимия», обозначает и включает также понятие «иммуноцитохимия».

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 15

	Антитела	Глава 1
	IgG
	Тяжелые цепи IgG обозначаются гамма
	(γ) цепи. IgG имеет общую формулу γ2 κ2 или γ2
	λ2, которая обозначает, что одна молекула IgG
	(молекулярная масса 150 кДа) состоит из двух
	тяжелых γ цепей и двух легких цепей, принадле-
	жащих к типу κ или λ. Структура молекулы IgG
	(рис. 1.2) была определена отчасти с помощью
	протеолитического расщепления и редуктивного
	расщепления молекулы. Расщепление папаином
	приводит к разрушению связи, чувствительной	Рис. 1.2. Диаграмма, изображающая структуру IgG
	к действию фермента, которая расположена со	кролика (который существует как отдельный основной
		подкласс). Тяжелые (Н) и легкие (L) цепи состоят
	стороны N-концевого участка от дисульфидных
		из вариабельной (V) и константной (С) областей и
	связей, соединяющих тяжелые цепи. Это приводит	связываются посредством меж- и внутрицепьевых
	к образованию двух моновалентных антигенсвязы-	дисульфидных связей (|—u—|). Протеолитическое
	вающих фрагментов (Fab) и одного кристалличе-	расщепление папаином (● ● ● ● ●) приводит к образованию
	ского фрагмента (Fc). Пепсин расщепляет γ−цепи	двух антигенсвязывающих фрагментов (Fab) и одного
	со стороны С-концевого участка от дисульфидных	кристаллического фрагмента (Fc), в то время как в
		результате расщепления пепсином (- - - -) образуется
	связей, соединяющих тяжелые цепи, в резуль-
		один F(ab’)2 фрагмент.
	тате чего образуется один бивалентный анти-
	генсвязывающий фрагмент F(ab’)2. В этом случае
	Fc-фрагменты разрушаются. Редуктивное расще-
	пление молекулы IgG разрушает межцепьевые дисульфидные связи и, при блокировании свободных
	сульфгидрильных групп, приводит к образованию двух Н-цепей (молекулярная масса каждой состав-
	ляет 50 кДа) и двух L-цепей (по 25 кДа каждая).

Молекула IgG может быть дополнительно разделена на так называемые домены, а именно вариабельные домены (V) и константные домены (С). Каждый домен состоит из 110-120 аминокислот и одной внутрицепьевой дисульфидной связи. На вариабельном домене легкой цепи (VL), и на вариабельном домене тяжелой цепи (VH) располагаются амино-концевые участки молекулы иммуноглобулина. VL и VH вместе образуют антигенсвязывающий центр. В пределах VL и VH доменов антитела располагается несколько гипервариабельных (HV) участков. Во время реакции с антигенами HV участки сближаются с антигенной детерминантой (эпитопом). Расстояние между антигеном и HV участками антитела составляет около 0,2-0,3 нм.

В этой области локализуются уникальные структуры, называемые идиотипическими детерминантами. Каждый клон антител экспрессирует свой собственный идиотип. Каждая L-цепь в дополнение к VL домену содержит константный домен (CL). Н-цепь также имеет три константных домена (СН1, СН2 и СН3) и несет карбоксильный концевой участок иммуноглобулина. В домене СН2 располагается углеводная часть молекулы IgG и некоторые высоко гидрофобные нейтральные арома-

тические аминокислоты. Шарнирные области локализуются между доменами СН1 и СН2 Н-цепей.

16 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Глава 1	Антитела

Незначительные различия в пределах этих областей вносят вклад в специфичность подкласса иммуноглобулина G. Подклассы IgG обозначаются подстрочными индексами: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 и IgG4. В то время как в IgG человека общее соотношение цепей типов κ и λ составляет 2:1, в подклассах IgG1

и IgG2, например, соотношение составляет соответственно 1:1 и 8:1. Мыши имеют около 95% κ-цепей, поэтому большинство моноклональных антител IgG от этих видов имеют цепи типа κ. Количество дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи, также неодинаково в различных подклассах IgG. В IgG1, как и в IgG4, имеется две связи, в то время как в IgG2 и IgG3 содержится, соответственно, четыре и пять связей. В связи с подвижностью шарнирной области, угол, который образуют оба Fab фрагмента, может меняться, чтобы компенсировать изменяющиеся расстояния между идентичными антигенными детерминантами.

IgM

IgM является пентамером (молекулярная масса около 900 кДа), состоящим из пяти субъединиц молекулярной массой около 180 кДа каждая (рис. 1.3.). Общая формула может быть представлена как (μ2 κ2)5 или (μ2 λ2)5. Каждая субъединица соединяется с другими субъединицами белком, богатым сульфгидрильными группами, или J цепью (15 кДа) и состоит из двух тяжелых цепей типа μ и двух легких цепей типа κ или λ. J-цепи способствуют целостности и стабильности пентамера. Как и в случае

сIgG, субъединицы IgM могут быть фрагментированы с помощью ферментативного или редуктивного расщепления на F(ab')2, Fab и Fc фрагменты, а также тяжелые и легкие цепи соответственно. Fc фрагмент IgM является циклическим пентамером (молекулярная масса около 340 кДа). Обработка пентамерного IgM 0,1% раствором меркаптоэтанола расщепляет дисульфидные связи между субъединицами с образованием пяти мономеров. Были описаны подклассы IgM1 и IgM2.

Вто время как IgG является самым распространенным антителом в гипериммунизированном организме хозяина, у вновь иммунизированного животного первым обнаруживаемым гуморальным антителом является IgM. В процессе образования первичных антител имеется несколько основных стадий. После введения антигена сначала достигается равновесие между концентрацией антигена во вне- и внутрисосудистом пространстве. Затем антиген распадается на более мелкие фрагменты и, наконец, элиминируется из внутрисосудистых пространств вновь образованными антителами. Период

смомента введения иммуногена до первого появления IgM антител называется латентным периодом и может длиться около одной недели. В пределах двух недель или в ответ на второе введение антигена обычно преобладает IgG класс иммуноглобулинов. Как и все белки, антитела подвержены катаболизму. В то время как антитела класса IgM имеют относительно короткий период полураспада, составляющий только от четырех до шести дней, антитела IgG имеют среднюю продолжительность существования около трех недель. Если повторно не проводятся бустер-инъекции иммуногена, по

прошествии этого периода концентрация антител в сыворотке крови будет снижаться.

Образование антитела на молекулярном уровне является комплексным процессом, и подробное описание этого процесса выходит за пределы этого руководства. Заинтересованному читателю мы рекомендуем обратиться к известному пособию по молекулярной иммунологии [1].

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ | 17

	Антитела		Глава 1
	Поликлональные антитела	a	b
	Поликлональные антитела (рис. 1.4.)
	являются гетерогенной смесью антител,
	направленных против различных эпитопов
	одного и того же антигена. Антитела образу-
	ются различными клонами В-клеток животного
	и, как следствие, имеют различные иммуно-
	химические свойства. Антитела в поликло-	Рис. 1.3. Схематическое изображение (a) пяти субъединиц
	нальной смеси могут иметь незначительно
		IgM мыши, связанных дисульфидными связями (|—u—|) и
	различающиеся значения специфичности и
		J-цепью с образованием структуры пентамерного кольца.
	аффинности (см. «Аффинность антител»).	Каждая субъединица (b) состоит из двух тяжелых цепей
	Поликлональные антитела чаще всего обра-	(Н) типа мю и двух легких цепей (L), каждая из которых
	зуются у кроликов, но также встречаются и у	содержит константный (С) и вариабельный (V) домены.
	других млекопитающих, включая козу, свинью,
	морскую свинку и корову. Для продукции поли-
	клональных антител, чаще всего, используются кролики, поскольку, во-первых, этих животных легко
	содержать и, во-вторых, у человека относительно редко образуются антитела против белков кролика
	по сравнению с другими видами, такими как козы. Кроме того, антитела кролика преципитируют белки
	человека в широком диапазоне избыточного количества как антигена, так и антитела. Многолетний
	опыт селекции для достижения оптимального иммунного ответа привел к тому, что чаще всего для
	продукции поликлональных антител используется новозеландская порода кроликов-альбиносов.

Поликлональные антитела образуются у кроликов в ответ на иммунизацию антигеном (также

известным как иммуноген) в дозировке от 10 мкг до 200 мкг. Иммунизация, как правило, выполняется внутрикожно или подкожно, но также может быть выполнена в подушечку стопы, мышцу или брюшную полость. Антиген может быть приготовлен с адъю-

вантом, который может усилить иммунный ответ (таким как полный или неполный адъювант Freund), или без него. Для белков и пептидов меньшего размера или менее иммуногенных

белков или пептидов иммуноген может также быть соединен с белком-носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH), бычий сывороточный альбумин (BSA), яичный альбумин (OVA) и

очищенный белковый дериват туберкулина (PPD). Период иммунизации длится от 3 до 8 месяцев, при этом животному обычно проводятся бустер-инъекции иммуногена один раз в две недели.

Забор крови производится из уха кроликов, яремной вены более

крупных животных или из сердца после умерщвления живот-

Рис. 1.4. Схематическое изображение

	поликлональных антител,	ного. Сыворотка приготавливается путем удаления клеток из
		крови с помощью центрифугирования, при этом раствор поли-
	связывающихся с различными
	эпитопами антигена.	клональных антител может быть использован в форме стаби-

18 | ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ