Полимеразно-цепнаяреакция

МетодомсравнительнойоценкиэкспрессиитранскрипционногофактораNF-kBпослужилаполимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени.Преимуществоммолекулярно-генетическогометодаявляетсявысокаяскоростьполучениярезультата,атакжевысокаячувствительность(доодноймолекулы)испецифичность.Объединениеэтаповамплификацииидетекциирезультатовснижаетрискконтаминациииошибокприанализерезультатов,появляетсявозможностьоценитькинетикупроцесса,котораязависитотначальногоколичестваисследуемогоматериала.

Материаломисследованияявляласьвенознаякровь,взятаяуэтихпациентов,изкоторойбыливыделенылимфоциты.

ВыделениеРНКизлимфоцитовпроводилиспомощьюнабораРИБО-

ПРЕБ.

1. Раствордлялизисапрогревалипри65ºСдополногорастворениякристаллов.

2. Встерильныеодноразовыепробиркивносиликлеточнуюсуспензию,затемцентрифугировали3минпри3тыс.об/мин.Надосадочнуюжидкостьсливалиспомощьюмикропипетки.Добавляливпробиркипо300мклрастворадлялизиса.Промаркировывалипробирки.

3. Содержимоепробирокперемешивалинавортексе(«МicrospinFV-2400»,фирма изготовитель-«Biosan», Россия)ипрогревали5минпри65ºСвтермостате(«Гном»,фирмаизготовитель–«ДНКтехнология»,Россия).

4. Добавляливпробиркипо400мклрастворадляпреципетации,перемешивалинамикроцентрифуге“Vortex”.

5. Центрифугировалипробиркинамикроцентрифуге(«Minispin»,фирмаизготовитель-«Eppendorf», Россия)5минпри13тыс.об/мин.

6. Аккуратноотбиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникнамикропипеткудлякаждойпробы.

7. Добавляливпробиркипо500мклрастворадляотмывки3,плотнозакрываликрышки,осторожнопромывалиосадок,переворачиваяпробирки3-5раз.

8. Центрифугировалипробиркипри13тыс.об/минвтечение2миннамикроцентрифуге.

9. Аккуратноотобиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникнамикропипеткудлякаждойпробы.

10. Добавляливпробиркипо200мклрастворадляотмывки4,плотнозакрываликрышки,осторожнопромывалиосадок,переворачиваяпробирки3-5раз.

11. Центрифугировалипри13тыс.об/минвтечении2миннамикроцентрифуге.

12. Осторожноотобиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникна10мклдлякаждойпробы.

13. Помещалипробиркивтермостатпритемпературе65ºСна2миндляподсушиванияосадка-приэтомкрышкипробирокдолжныбылибытьоткрыты.

14. Добавляливпробиркипо50мклРНК-буфера.Перемешивалинавортексе.Помещаливтермостатпри65ºСна5мин,периодическивстряхиваянавортексе.Центрифугировалипри13тыс.об/минвтечении1миннамикроцентрифуге.НадосадочнаяжидкостьсодержалаочищенныеРНКиДНК(отобираливчистыемикропробирки).Такимобразом,пробыбылиготовыкпостановкереакцииобратнойтранскрипциииПЦР.

ОчищеннаяРНК,ДНКможетхранитьсядо24часовпритемпературеот2до8часов притемпературеневышеминус16ºС.

ПолученнуютотальнуюРНКденатурировали,приэтомобразовываласьодноцепочечнаяРНК.Затемпритемпературе70°Свтечение5минпроводилиотжиг(гибридизацию)праймеров,инкубируямРНКобразца(20мкл),эквимолярнуюсмесь4-хнуклеотидов(8мкл)ипраймеры-гексамеры(1мкл),доводилиобъемсмесиводойдо50мкл.Наэтомэтапепраймеры

«находят»комплементарныеучасткивисследуемойРНКигибридизуютсясними.Затемпроводилиреакциюобратнойтранскрипции.

Комплектреагентов«РЕВЕРТА-L»дляпроведенияреакцииобратнойтранскрипции(«AmpliSensbiotechnologies»,Россия).ВсоставнаборавходитRT-G-mix-1, RT-mix, ревертаза (MMlv), ДНК-буфер.

1. Приготовлениесмесина22реакций:

-215мклсмеси«микс»,

-25 мклхлоридамагния,

2. готовую реакционнуюсмесьразливалипо10мклвэппендорфы,

3. вэппендорфысготовойсмесьюдобавлялипо10мклвыделеннойРНК,

4. ставилипробиркивтермостат(«Гном»,фирмаизготовитель–«ДНКтехнология»,Россия)стемпературой37ºСна30минут.

Далее сполученнойкДНКпроводилиреакцию обратнойтранскрипции.

ДляпостановкиРТ-ПЦРиспользовали«НаборреактивовдляпроведенияРТ-ПЦРвприсутствииинтеркалирующегокрасителяSYBRGreenI»(«Синтол»,Россия)содержаший:реакционнуюсмесь(ПЦРбуферВ-KCl,ТрисHCl(рН8,8),6,25мМMgCl2;TaqДНК-полимераза;дезоксинуклеозидфосфаты;глицерол,Tween20,интеркалирующийкраситель SYBRGreenI),25мМMgCl2,деонизированную воду.

Таблица10.Постановкареакции.

	На1пробу,мкл	На28проб,мкл
SYBRGreenI	19	532
кДНК	2	56
Праймер-микс (концентрацияforиrev5пмоль/мкл)	4	112

Использовалисьследующиеэкспериментальныепротоколы:95°С-2мин–первичнаяденатурация.

90°С-30сек–денатурация.60°С-20сек–отжиг.

72°С-15сек-элонгация.

40циклов.

Использовалисьследующиепраймеры:

Gapdh:FW5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′RV5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′NF-кВ/RelA:FW5′-TGATCCACATGGAATCGAGA-3′RV5′CAGGAAGGGATATGGAAGCA3.

РТ-ПЦРпроводилинаприбореIQ5Cyclerфирмы«Biorad»,позволяющемнаблюдатьизменениеуровняфлуоресценциивреакционнойсмесивтечениеходареакцииитакимобразомотслеживатьдинамикунакопленияампликонов.

УровеньмРНКанализируемогогенавыравнивалипоотношениюкусредненнымданнымамплификациигеновнеизменногоуровняэкспрессии(housekeepinggenes,геныдомашнегохозяйства)GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа).Прииспользованиивыбраннойматематическоймоделианализанеобходимоопределениефлуоресценциив«threshold»точке(Сt-значениепороговогоцикла)дляданногогена. СPопределяласькакточка,гдеподъемкривойфлуоресценцииампликоновисследуемогогеназначительновыше,чемфоновоесвечение.Количественнаяоценкавсегдаосуществляласьв

«экспоненциальную»фазу,таккакоценкавфазу«плато»считаетсянеэффективнойиз-занарастающегоистощениякомпонентовреакционнойсмеси(рисунок13).

Рисунок13.Криваянакопленияпродукта.

ОтносительноеколичествомРНКрассчитывалиспомощьюdeltaметода.ОтносительноеколичествомРНКрассчитывалипоформуле:

∆=Ct(генов дом.хозяйства)-Сt(генаNF-kB)

гдеC(T)-пороговыйцикл(thresholdcycle),вычислялипроцентноесодержание∆отгеновдомашнегохозяйства(Gapdh).Темсамымбылопоказаноотносительноечислокопийисследуемогогенапоотношениюк

генамGapdh. ЧислокопийгеновGapdh10⁶-10⁷.