3. Получение клеток, обладающих высоким терапевтическим потенциалом, путем культивирования стволовых клеток вне организма в специальных средах.

В Казахстане все научные коллективы пока работают только над введением экзогенных клеток в организм человека. В Центре хирургии же разработан новый научный подход к лечению заболеваний сердца. В нем будет использована новая модель эндогенной стимуляции собственных стволовых клеток больных с различными хирургическими заболеваниями.

Совместно с Институтом кардиологии МЗ РК и Институтом молекулярной биологии ЦБИ МОН РК разрабатывается модель лечения заболеваний сердца стволовыми клетками костного мозга в эксперименте. В 2007—2008 гг. на базе Центра хирургии и Института кардиологии исследования будут проводиться на больных с сердечно-сосудистой патологией. Им будут введены в миокард собственные стволовые клетки, полученные из их же костного мозга.

Совместно с Научно-исследовательским институтом проблем биологи-

3

, ческой безопасности (пос. городского типа Гвардейский) Министерства

образования и науки РК производится отработка модели культивирования

I стволовых клеток костного мозга и крови с целью их направленной диф_

ференцировки в кардиомиоциты и клетки сосудов. Кардиомиоциты и клетки сосудов планируется в 2008 г. трансплантировать больным с сердечно­сосудистой патологией.

Таким образом, сегодня в Национальном научном центре хирургии им. А. Н. Сызганова совместно с сотрудниками трех государственных

\ учреждений Министерства здравоохранения и Министерства образования и

науки Республики Казахстан, интенсивно работающих в области клеточных

у технологий, проводятся научные исследования по всем мировым направлениям

изучения и использования в клинике стволовых клеток.

Впервые в Казахстане под моим руководством были разработаны

] основополагающие документы для развития научных исследований стволовых

j клеток и их внедрения в медицинскую практику. Это Концепция по изучению

] и использованию стволовых клеток и Программа по ее реализации в формате

отраслевой, названная нами "Развитие клеточных медицинских технологий в Республике Казахстан" на 2007—2012 гг.

, Хочу особо отметить, что Концепция и Программа в своей идейной основе,

методическом и методологическом плане являются единым документом, построенным по блочному принципу рассматриваемых проблем, связанных между собой преемственностью решений и неразрывностью внутренних связей между ее главными разделами. Они касаются только гемопоэтических стволовых клеток, наиболее изученных и применяемых в клинической практике

, в большинстве развитых стран мира.

1 Концепция и Программа предусматривают развитие фундаментальных и

i прикладных исследований в области стволовых клеток в Казахстане и

разработку на их основе новых технологий, включающих получение стволовых клеток из различных источников, их подготовку для клеточной терапии, длительное хранение без потери исходных свойств. Предполагается в' перспективе обеспечение сети лечебно-профилактических учреждений страны достаточным количеством безопасных и эффективных отечественных препаратов стволовых клеток, отвечающих требованиям международных стандартов.

В результате реализации предлагаемой Программы население страны практически может получить доступ к новым, а в некоторых случаях (кардиохирургия, онкогематология, наследственные заболевания, иммуно-дефициты)—и жизненно важным лекарственным средствам.

Считаю важным отметить тот факт, что без реальной государственной поддержки решить проблемы изучения и применения стволовых клеток в Казахстане будет трудно.

Возможности использования клеточной терапии при заболеваниях серДД^а широко обсуждаются на страницах научной прессы. Исследователи решают ряд научных и клинических проблем, связанных с созданием подобных технологий. Ключевыми из них являются: определение фенотипа клеток, наиболее перспективных для лечения заболеваний сердца; обоснование

4

яциональных путей их введения и установление сроков, в которые показана ^ансплантация. Предлагается использовать различные клетки для лечения заболеваний сердца: стромальные клетки костного мозга, скелетные миобласты, гемопоэтические стволовые клетки. Более прогрессивным считается использование определенных фракций малодифференцированых клеток, например CD133⁺. Возможными путями доставки являются: интрамиокардиальное введение (в основном, как дополнение при операциях на открытом сердце, например при выполнении аортокоронарного шунтиро­вания); интракоронарное введение, обсуждаются различные варианты системного введения (теоретическая предпосылка: клетки сами "найдут" поврежденный миокард и "осядут" там); наконец, мобилизация клеток-предшественников из тканевых ниш (в частности, из костного мозга) введением

ЦИТОКИНОВ.

Следует особо отметить, что в нашей стране прослеживается тенденция использования клеточных технологий в клинике прежде, чем они будут экспериментально и фундаментально обоснованы, пройдут надлежащие доклинические и клинические испытания. Исходя из качества проводимых исследований в стране, приходится констатировать, что проделанная работа не всегда направлена на поиск истины, часто имеет место наукообразная реклама коммерческих клеточных технологий. Доказательная база в них строится, в основном, на данных об их "якобы" клинической эффективности. В то же время такие важнейшие аспекты, как полная фенотипическая характеристика трансплантационного материала, судьба клеток после трансплантации, состояние иммунитета после пересадок клеток, часто остаются за рамками исследований. Вот почему публикации фундаментальных работ на эту тему являются новостью, ожидаемой отечественными специалистами.

Академик ВАНРК, профессор,

доктор медицинских наук

Халык К,акарманы

М.А. АЛИЕВ

5

Академик HAH PK M. А. Алиев (Национальный научный центр хирургии им. А. Н. Сызганова)

ПЕРСПЕКТИВЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕРДЦА

Современные методы лечения ИБС включают профилактику факторов риска, медикаментозную терапию (антиагреганты, в-блокаторы, ингибиторы АПФ и др.), хирургическое лечение (аортокоронарное шунтирование, баллонная дилатация, стентирование и др.). Несмотря на эффективность современных методов лечения, по-прежнему имеется необходимость в разработке принципиально новых подходов к лечению ИБС и инфаркта миокарда (ИМ) как одного из наиболее грозных осложнений ИБС.

Следует учесть, что ишемическая болезнь сердца остается одной из основ­ных причин инвалидизации и смертности взрослого населения большинства развитых стран мира. В структуре летальности при заболеваниях системы кровообращения удельный вес ишемической болезни сердца достигает 47%. Около 5056 больных с прогрессирующей сердечной недостаточностью уми­рают через 5 лет после постановки диагноза (Grogan et al., 1995). Для пациен­тов с ИБС, у которых традиционное лечение неэффективно или противопо­казано ввиду серьезных сопутствующих заболеваний, потребность в альтерна­тивной терапевтической стратегии не вызывает сомнений. Наиболее перспек­тивным подходом является применение методов относительно новой отрасли медицины — регенерационной и восстановительной клеточной терапии.

Высокий уровень летальности при заболеваниях сердца во многом связан с неспособностью миокарда взрослого человека к регенерации. Погибшие или поврежденные его клетки замещаются соединительнотканным рубцом, что приводит к прогрессирующей потере функционирующего миокарда, снижению сократительной способности сердца и формированию сердечной недоста­точности. Консервативные методы лечения ишемической болезни сердца остаются симптоматическими. Что же касается большинства хирургических методов коррекции коронарного кровотока, то при наличии обширных постин­фарктных рубцовых полей оперативное вмешательство не позволяет добиться продолжительного улучшения состояния пациента. Единственным эффектив­ным методом лечения в подобных случаях является пересадка сердца. Однако в последние годы в мире отмечено снижение количества операций по кардио-трансплантации, что обусловлено, в первую очередь, дефицитом донорских органов. Таким образом, значительная часть больных с серьезными повреж­дениями миокарда не может рассчитывать на излечение—программы помощи таким пациентам, по существу, являются паллиативными (Шевченко, 2003).

Именно поэтому в странах Западной Европы существенно повысился интерес к клиническим возможностям трансплантации ГСК при различных заболеваниях. В большинстве экономически развитых стран количество подобных операций к 2000 г. превысило 400 на 1000 000 населения. Более 90

крупных центров Западной Европы, Австралии, Японии, Китая являются Участниками исследовательских программ Европейской группы транспланта­ции костного мозга и стволовых клеток. По данным Европейского регистра, к настоящему времени успешно выполнены пересадки ГСК при таких тяжелых заболеваниях, как рассеянный склероз, склеродермия, системная красная волчанка, миастения, ревматоидный артрит, системный васкулит, болезнь Крона и др- Следует отметить, что трансплантации ГСК при патологии сердеч­но-сосудистой системы посвящено наименьшее количество сообщений. Однако уже накоплен довольно интересный экспериментальный и клинический материал, позволяющий надеяться на дальнейшее практическое применение этого метода (Шевченко, 2006).

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) считаются наиболее изученным стволовым источником, что во многом связано с их использованием в клинике при трансплантации костного мозга. Потенциал образования клеточной массы у ГСК огромен — стволовые клетки костного мозга ежедневно продуцируют 10" клеток, составляющих форменные элементы периферической крови. Сам факт существования ГСК был установлен в 1961 г. в экспериментах по восста­новлению гемопоэза у мышей, получивших смертельную дозу радиоактивного облучения, разрушающего стволовые клетки костного мозга [1].

В последние годы, в связи с появлением публикаций о пластичности клеток костного мозга у животных, возникла идея трансплантации ГСК костного мозга для лечения инфарктов и другой патологии сердечно-сосудистой системы. По мнению D. Orlic и соавторов (2001), миграция пересаженных клеток костного мозга под влиянием цитокинов в область миокарда, подвергше­гося неблагоприятному воздействию, приводит к его ускоренной регенерации: результатом трансплантации клеток костного мозга животным с ишемическим некрозом сердечной мышцы явилось ограничение зоны инфаркта На 40%, дилатации полостей сердца—на 26%, что сочеталось с существенным улучше­нием показателей гемодинамики за счет неоангиогенеза и образования около 15 х 10⁶ новых кардиомиоцитов. Кроме того, сообщается о способности так называемых мышечных клеток-сателлитов и выделенных из скелетной мышцы миобластов трансформироваться в кардиомиоциты. Мышечные клетки-сателлиты (среди миоцитов их менее 5%) фактически представляют собой мышечную популяцию стволовых клеток, поскольку они обладают высоким потенциалом дифференцировки в миоциты, в том числе и в кардиомиоциты.

Предпринимаются попытки использовать для регенерации поврежденного миокарда потенциал собственных ГСК больного путем их мобилизации в системный кровоток. Экспериментальное подтверждение возможности регенерации миокарда после ишемического повреждения с помощью ростовых факторов было получено в известных экспериментах на мышах: подкожное введение G-CSF и фактора стимуляции костного мозга непосредственно до и в течение нескольких дней после экспериментального инфаркта миокарда действительно приводило к появлению новых кардиомиоцитов в области рубца, улучшало гемодинамику и продлевало жизнь животным (Orlic et al., 2001,2002). Однако до сих пор не получен ответ на вопрос о том, какая именно популяция клеток костного мозга (стволовые гемопоэтические или стромальные)

7

способна давать начало нейронам и кардиомиоцитам и какие условия этому способствуют (Mezey et al., 2000).

Возможности замещения погибшего миокарда с помощью ГСК при инфаркте миокарда были изучены в эксперименте на животных специалистами Национального института здоровья США (Orlic et al., 2002). Моделирование инфаркта миокарда осуществляли путем перевязки левой коронарной артерии, а через 5 ч выполняли трансплантацию в периинфарктную зону стволовых клеток костного мозга, помеченных зеленым флуоресцирующим протеином. При гистологическом контроле через 9 дней после трансплантации отмечалась интенсивная миграция флуоресцирующих клеток в зону инфаркта миокарда. Применение специальных меток показало, что флуоресцирующие клетки содержат кардиальный миозин и активно пролиферируют в зоне повреждения. Более того, среди вновь образованных мышечных клеток миокарда иммуногистохимически зафиксирован процесс неоангиогенеза, визуали­зируемый с помощью окрашивания сс-актина волокон гладких мышц сосудов.

Переворот в тактике лечения острого инфаркта миокарда может произвести установленная способность клеток костного мозга к дифференцировке в кардиомиоциты и сосудистые структуры, что существенно уменьшает признаки ишемического повреждения сердца. Исследователями (Jackson et al., 2001) установлено, что клетки костного мозга, экспрессирующие c-Kit-лиганд, под влиянием G-CSF продуцируют фенотипические аналоги ангиобластов. После их инфузии крысам с ишемией миокарда такие ангиобласты мигрируют непосредственно в зону повреждения сердечной мышцы, где они приостанавливают некротические изменения в кардиомио-цитах, формируя новые кровеносные сосуды. Однако авторы обращают внимание на то, что только максимально раннее проведение клеточной трансплантации с момента возникновения ишемии позволяет предупредить процесс патологического ремоделирования миокарда.

Важным является тот факт, что кроме прямого введения ГСК в повреж­денную зону возможен и вариант "непрямой заместительной терапии" с исполь­зованием цитокинов, воздействие которых увеличивает количество циркули­рующих в периферической крови кроветворных клеток-предшественников. В Национальном институте здоровья США была выполнена серия эксперимен­тов, в ходе которых животным в течение четырех дней вводили G-CSF, что обеспечивало значительное повышение концентрации циркулирующих в крови ГСК. В последующем на 5-е сутки у животных моделировали инфаркт миокарда. При гистологическом исследовании было установлено, что ГСК замещают погибшие кардиомиоциты стенки левого желудочка в области инфаркта, чего не наблюдалось у животных контрольной группы. На 27-е сутки вновь образованные кардиомиоциты характеризовались несколько меньшими размерами и были похожи на кардиомиоциты новорожденных. При этом они содержали весь спектр кардиоспецифических маркеров. Пролиферативный потенциал образованных de поио миокардиальных клеток был в 1,6 раза выше, чем у эндотелиоцитов, и в 2,8 раза выше, чем у гладкомышечных клеток. Отме­чен также активный процесс ангионеогенеза, выявляемый с помощью различ­ных специфических маркеров. Выживаемость животных на 27-е сутки после

8

инфаркта миокарда при введении G-CSF была в 4 раза выше, чем в контрольной группе.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ГСК, трансплантированные в сердечную мышцу, могут трансформироваться в кардиомиоциты, а также формировать сосуды в зоне инфаркта миокарда. Эти процессы индуцированы репаративной регенерацией и сопровождаются улучшением функций миокарда и повышением выживаемости эксперимен­тальных животных (Шевченко, 2006).

Возможность стимуляции регенерации сердечной мышцы — достаточно спорный вопрос. Отсутствие репродуктивной способности кардиомиоцитов (КМЦ) у взрослых млекопитающих давно стало общепризнанным фактом: КМЦ не пролиферируют, замещение дефекта сердечной мышцы происходит без их участия, в основном за счет пролиферации клеток стромы (фибро-бластов) [1, 2]. Если возникло повреждение сердечной мышцы, то оно необратимо и проявляется ремоделированием миокарда по вышеописанному сценарию, часто закономерно заканчиваясь развитием сердечной недоста­точности (СН) в течение нескольких месяцев или лет [3].

Традиционно считается, что как только в онтогенезе сердце полностью сформировалось, кардиомиоциты теряют молекулярную пластичность, позволяющую им делиться. Следовательно, при остром повреждении сердца млекопитающих не регенерируют, а рубцуются. Имеется важный механизм, используемый кардиомиоцитами млекопитающих для управления клеточным циклом—МАРр38-киназная активность. Новые исследования демонстрируют, что взрослые кардиомиоциты с недостаточной активностью р38 продолжают многократно пролиферировать в присутствии фактора роста фибробластов 1 (Engel. et al., 2005). Генетические исследования ингибирования р38 показали, что фермент регулирует гены, непосредственно влияющие на пролиферацию кардиомиоцитов. Эти открытия позволяют сделать первый шаг к пониманию того, что снижающие активность р38 препараты могут уменьшить формиро­вание рубцовой ткани и усилить регенерацию сердца после его повреждения. Возможно, это не единственный механизм регуляции пролиферации кардиомиоцитов, поэтому до клинического применения еще далеко.

Однако еще в 60-х годах прошлого века было доказано, что можно стимулировать образование бластоподобных клеток в поврежденном миокарде [4]. Недавние исследования показали наличие в миокарде млекопитающих популяции незрелых регионарных клеток со свойствами стволовых [5—7]. В 2003 г. были найдены c-kit⁺ клетки в биоптатах сердец пожилых людей с гипертрофией миокарда и у больных идиопатической дилатационной кардиомиопатией) [8], а в 2004 г. были выделены и описаны регионарные стволовые клетки (СК) из миокарда человека [9].

Даже когда сердце уже трансплантировано от донора реципиенту, в нем остаются некоторые повреждения, и стволовые клетки реципиента активно включаются в работу восстановления нового органа, мигрируя в него. В контрольном миокарде и, в большем количестве, в трансплантированных сердцах были идентифицированы предполагаемые стволовые клетки и прогениторные клетки (Quaini et al., 2002). Для идентификации мигрировавших

9

недифференцированных клеток, экспрессирующих антигены стволовых клеток, и для различения примитивных клеток реципиента и полученных от донора может быть использована Y- хромосома.

Исследователи ищут достаточно простой способ, чтобы помочь восстановлению функции поврежденных в результате химиотерапии сердец; это встречается у 10% больных раком после лечения химиопрепаратами. СК, как известно, восстанавливают поврежденные сердца. В опытах на мышах человеческие СК могут превращаться в два вида клеток, способных восстановить функцию сердца: клетки сердечной мышцы, за счет которых сердце сокращается, и эндотелиальные клетки, которые равномерно распределены по всему органу, образуя кровеносные сосуды. В одном исследовании спустя два месяца после трансплантации человеческих стволовых клеток мышам с пораженными сердцами приблизительно в 2% клеток в сердцах реципиентов обнаруживался человеческий генетический маркер (Zhang et al., 2004). Человеческие СК в основном сливаются с мышиными кардиомиоцитами, в результате образуются новые мышечные клетки, которые содержат и человеческую, и мышиную ДНК. Но чтобы сформировать новые клетки кровеносных сосудов, они, по-видимому, дифференцируются сами, замещая поврежденные мышиные кровеносные сосуды человеческими клетками. Эти открытия должны помочь разрешить споры относительно того, создает ли трансплантация СК новые типы клеток, которые пересаживают в сердце.

Обоснование терапевтических эффектов трансплантации клеток требует, прежде всего, доказательств присутствия клеток в зоне трансплантации. Для этого в НИИТиИО (Москва) был использован генно-инженерный метод доставки в клетки in vitro рекомбинантного делецированного аденовируса, в составе генома которого присутствует ген Lac-Z из Е Coli. Ген Lac-Z кодирует фермент р-галактозидазу, наличие которого выявлялось при добавлении субстрата X-Gal. С помощью этого генно-инженерного метода в опытах на животных были получены доказательства того, что аутологичные прекульти-вированные клетки, введенные в миокард, сохраняют свою жизнеспособность и выявляются в зоне трансплантации по крайней мере в течение 30 суток. При повреждении сердец и трансплантации в принекротическую зону левого желудочка клеток было установлено, что показатели эффективности восстановления насосной функции сердца при интрамиокардиальном введении предифференцированных кардиомиоцитоподобных клеток костного мозга не уступали показателям работы сердца при использовании фетальных кардио-миоцитов. Такой вывод был сделан на основании результатов сравнительного исследования аортального, ударного и минутного объемов сердца в условиях применения дозированных нагрузок с объемом и сопротивлением в стендовой установке по Neely (Потапов и др., 2003).

Метод клеточной трансплантации в настоящее время считается наиболее перспективным для стимуляции регенерационно-репаративных процессов в миокарде. Выделяют три основных подхода к решению данной задачи:

1. Трансплантация (ТП) клеток в миокард с целью привнести клетки, которые могут заместить недостаток сократительных элементов в сердечной мыпще. С 1995 г. в научной литературе стали появляться публикации, ю

описывающие на экспериментальных моделях положительный эффект трансплантированных в миокард клеток, призванных активно участвовать в систоле сердца: эмбриональных кардиомиоцитов [10—-^ь скелетных миобластов [13-15] дладкомьшечных клеток [16,17], _преди(рФ^еР^енциР^{ованнь1Х} в кардаомиогенном направлении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [18,19], ген-модифицированных клеток [20].

2. Трансплантация клеток с целью стимулировать репаративные процессы в миокарде. Возможность с помощью метода клеточной ТП дооиться умень­шения размеров постинфарктного рубца, уменьшить образование постин­фарктной аневризмы показана в экспериментальных работах [II, 1», II, Ну Показано, что улучшаются эластические свойства рубца: он становится менее ригидным, улучшая кровенаполнение ЛЖ в диастолу, ^и меньше мешает полноценной систоле; уменьшает интенсивность рубцевание (это предотвра­щает экспансию рубцовой ткани) и размеры рубца. Клеточная ^ш способство­вала также профилактике дилатации левого желудочка.

3. Трансплантация клеток с целью стимулировать рост новых сосудов для ликвидации ишемии миокарда (неоангиогенез). Интерес исследователей к сти­муляции развития новых кровеносных сосудов в миокарде значительно вырос в последние годы. Рост новых сосудов—так называемый неоангиогенез—это процесс, который может компенсировать дефицит гемоперфузии ишеми-зированных областей. Неоангиогенез может быть реализован путем введения различных факторовроста, генной терапией, а также трансплантацией клеток-предшественников сосудистого эндотелия и клеток, принимающих участие в регуляции роста капиллярных сетей. По нашему мнению, именно метод клеточной ТП является наиболее перспективным в стимуляции роста новых сосудов.

В экспериментах по пересадке клеточного материала в миокард удалось относительно подробно описать структурные перестройки в сердечной мышце после трансплантации, и эта информация позволяет обсу*^дать несколько эффектов.

Известно, что привнесенные в миокард клетки выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и Др- исооенно это касается стволовых клеток, основные эффекты от имплантации которых выражаются в мощной индукции репаративных процессов в месте повреждения [11,23]. В то же времямикроокружение, в которое попадают введенные клетки, также оказывает влияние на их развитие. Так, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) под влиянием микроокружения развиваются в фенотип КМЦ [13, 23, 24], однако механизмы и сигналы такой трансфор^маш™ пока не расшифрованы.

Пересадку клеток в миокард можно использовать для ограничения роста зоны ИМ, улучшения механических свойств рубцово-измененнои мышцы сердца, улучшения васкуляризации миокарда. Используемые для этих целей клетки должны прежде всего длительно выделять биологически активные вещества и уменьшать степень фиброза миокарда. Трансплантированные клетки могут обладать антиапоптотическим действием, усиливать ангиогенез, улучшать сократимость миокарда и предотвращать его ишемию.

и

недифференцированных клеток, экспрессирующих антигены стволовых клеток, и для различения примитивных клеток реципиента и полученных от донора может быть использована Y- хромосома.

Исследователи ищут достаточно простой способ, чтобы помочь восстановлению функции поврежденных в результате химиотерапии сердец; это встречается у 10% больных раком после лечения химиопрепаратами. СК, как известно, восстанавливают поврежденные сердца. В опытах на мышах человеческие СК могут превращаться в два вида клеток, способных восстановить функцию сердца: клетки сердечной мышцы, за счет которых сердце сокращается, и эндотелиальные клетки, которые равномерно распределены по всему органу, образуя кровеносные сосуды. В одном исследовании спустя два месяца после трансплантации человеческих стволовых клеток мышам с пораженными сердцами приблизительно в 2% клеток в сердцах реципиентов обнаруживался человеческий генетический маркер (Zhang et al., 2004). Человеческие СК в основном сливаются с мышиными кардиомиоцитами, в результате образуются новые мышечные клетки, которые содержат и человеческую, и мышиную ДНК. Но чтобы сформировать новые клетки кровеносных сосудов, они, по-видимому, дифференцируются сами, замещая поврежденные мышиные кровеносные сосуды человеческими клетками. Эти открытия должны помочь разрешить споры относительно того, создает ли трансплантация СК новые типы клеток, которые пересаживают в сердце.

Обоснование терапевтических эффектов трансплантации клеток требует, прежде всего, доказательств присутствия клеток в зоне трансплантации. Для этого в НИИТиИО (Москва) был использован генно-инженерный метод доставки в клетки in vitro рекомбинантного делецированного аденовируса, в составе генома которого присутствует ген Lac-Z из Е Coli. Ген Lac-Z кодирует фермент р-галактозидазу, наличие которого выявлялось при добавлении субстрата X-Gal. С помощью этого генно-инженерного метода в опытах на животных были получены доказательства того, что аутологичные прекульти-вированные клетки, введенные в миокард, сохраняют свою жизнеспособность и выявляются в зоне трансплантации по крайней мере в течение 30 суток. При повреждении сердец и трансплантации в принекротическую зону левого желудочка клеток было установлено, что показатели эффективности восстановления насосной функции сердца при интрамиокардиальном введении предифференцированных кардиомиоцитоподобных клеток костного мозга не уступали показателям работы сердца при использовании фетальных кардио-миоцитов. Такой вывод был сделан на основании результатов сравнительного исследования аортального, ударного и минутного объемов сердца в условиях применения дозированных нагрузок с объемом и сопротивлением в стендовой установке по Neely (Потапов и др., 2003).

Метод клеточной трансплантации в настоящее время считается наиболее перспективным для стимуляции регенерационно-репаративных процессов в миокарде. Выделяют три основных подхода к решению данной задачи:

1. Трансплантация (ТП) клеток в миокард с целью привнести клетки, которые могут заместить недостаток сократительных элементов в сердечной мышце. С 1995 г. в научной литературе стали появляться публикации,

ю

описывающие на экспериментальных моделях положительный эффект трансплантированных в миокард клеток, призванных активно участвовать в систоле сердца: эмбриональных кардиомиоцитов [10—12], скелетных миобластов [13—15], гладкомышечных клеток [16,17], предифференцированных в кардиомиогенном направлении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [18,19], ген-модифицированных клеток [20].

2. Трансплантация клеток с целью стимулировать репаративные процессы в миокарде. Возможность с помощью метода клеточной ТП добиться умень­шения размеров постинфарктного рубца, уменьшить образование постин­фарктной аневризмы показана в экспериментальных работах [11,18,21,22]. Показано, что улучшаются эластические свойства рубца: он становится менее ригидным, улучшая кровенаполнение ЛЖ в диастолу, и меньше мешает полноценной систоле; уменьшает интенсивность рубцевания (это предотвра­щает экспансию рубцовой ткани) и размеры рубца. Клеточная ТП способство­вала также профилактике дилатации левого желудочка.

3. Трансплантация клеток с целью стимулировать рост новых сосудов для ликвидации ишемии миокарда (неоангиогенез). Интерес исследователей к сти­муляции развития новых кровеносных сосудов в миокарде значительно вырос в последние годы. Рост новых сосудов—так называемый неоангиогенез — это процесс, который может компенсировать дефицит гемоперфузии ишеми-зированных областей. Неоангиогенез может быть реализован путем введения различных факторов роста, генной терапией, а также трансплантацией клеток-предшественников сосудистого эндотелия и клеток, принимающих участие в регуляции роста капиллярных сетей. По нашему мнению, именно метод клеточной ТП является наиболее перспективным в стимуляции роста новых сосудов.

В экспериментах по пересадке клеточного материала в миокард удалось относительно подробно описать структурные перестройки в сердечной мышце после трансплантации, и эта информация позволяет обсуждать несколько эффектов.

Известно, что привнесенные в миокард клетки выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и др. Особенно это касается стволовых клеток, основные эффекты от имплантации которых выражаются в мощной индукции репаративных процессов в месте повреждения [11,23]. В то же время микроокружение, в которое попадают введенные клетки, также оказывает влияние на их развитие. Так, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) под влиянием микроокружения развиваются в фенотип КМЦ [13, 23, 24], однако механизмы и сигналы такой трансформации пока не расшифрованы.

Пересадку клеток в миокард можно использовать для ограничения роста зоны ИМ, улучшения механических свойств рубцово-измененной мышцы сердца, улучшения васкуляризации миокарда. Используемые для этих целей клетки должны прежде всего длительно выделять биологически активные вещества и уменьшать степень фиброза миокарда. Трансплантированные клетки могут обладать антиапоптотическим действием, усиливать ангиогенез, улучшать сократимость миокарда и предотвращать его ишемию.

11

Однако обнадеживающие результаты экспериментальных исследований не всегда могут быть экстраполированы на человека. Например, было показано, что мобилизация стволовых клеток костного мозга с помощью гранулоци-тарно-колониестимулирующего фактора дает возможность стволовым клеткам костного мозга (КМ), используя эффект "хоуминга", восстанавливать функцию поврежденного сердца [25]. Однако клинические испытания этого нового метода не подтвердили эффективность такого подхода. Использование аллогенных фетальных КМЦ в клинической практике ограничено по этическим соображениям и из-за необходимости использовать иммуносупрессию, которая к тому же не гарантирует длительного приживания пересаженного материала.

Но все же накопленный экспериментальный материал позволил перейти к первым клиническим исследованиям. Выбор клеточного материала для трансплантации кардиологическим больным исключает в настоящее время использование аллогенного и ксеногенного материала. Фетальные клетки не могут быть использованы в связи с наличием этических проблем при их исполь­зовании и необходимостью применения иммуносупрессантов. Применение взрослых аллогенных клеток ограничено из-за недостаточной изученности иммунологических реакций, которые протекают после введения, например, мезенхимальных стволовых клеток. Поэтому наиболее приемлемым источ­ником является аутологичный костный мозг, в котором имеется значительное количество стволовых гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток (ГСКиМСК).

Ранее в экспериментах на животных было доказано, что ГСК обладают свойством пластичности, обеспечивающим им трансдифференцировку в кардиомиогенном направлении при попадании в специфическое микроокру­жение [25—28]. Однако рядом авторов это утверждение было опровергнуто: была показана возможность слияния ГСК со взрослыми кардиомиоцитами и образования химерных клеток; при этом у исследователя создается впечатление, что ГСК трансдифференцируются в кардиомиоциты [29,30].

Возможность дифференцировки МСК костного мозга в кардиомиоциты после обработки клеток in vitro 5-азацитидином подтверждается многими авторами [18, 24, 31, 32]. Кроме того, применение клеток КМ достоверно улучшает перфузию миокарда путем стимуляции неоангиогенеза [33—37]. Важнейшим свойством СК КМ является секреция биологически активных веществ, обладающих антиапоптотическим и ангиогенетическим эффектом [38—40]. Также из костного мозга можно получить фракции клеток с выраженным свойством стимулировать неоангиогенез и активно участвовать в росте новых сосудов — так называемых эндотелиальных прогениторных клеток. Экспериментальные [48—50] и клинические [47] исследования показали высокую эффективность применения этих клеток.

Можно заключить, что применение СК КМ в терапевтических целях сможет предотвращать развитие инфаркта миокарда, прогрессирование ИБС и хронической сердечной недостаточности путем стимуляции неоангиогенеза и развития коллатерального кровоснабжения в миокарде.

В настоящее время полагают, что СК КМ могут влиять на восстановление функции миокарда несколькими путями:

12

1) стимулировать неоангиогенез и развитие коллатерального кровотока в

миокарде;

2. увеличивать количество сократительных и/или проводниковых кле­точных элементов в миокарде за счет трансдифференцировки СК КМ и/или их слияния (fusion);

3. секретировать цитокины, которые оказывают терапевтическое воздействие на структуру и функцию миокарда.

Таким образом, костный мозг взрослых людей содержит кроме ГСК и попу­ляции СК, которые являются эндотелиальными клетками-предшественниками, фенотипически и функционально сходными с эмбриональными геман-гиобластами. Они могут использоваться для непосредственной индукции формирования новых кровеносных сосудов в инфарктной зоне (васкулогенез) и развития уже существующей сосудистой сети (ангиогенез) после экспериментального инфаркта миокарда.

Изолированные из эмбриональных сосудов или культивируемые эндоте-лиальные клетки при сокультивировании с кардиомиоцитами новорожденных крыс или при введении во взрослое мышиное сердце после ишемии дифференцируются в сокращающиеся кардиомиоциты и экспрессируют специфические сердечные маркеры (Condorelli et al., 2001).

Человеческие эндотелиальные клетки пупочного канатика в подобных экспериментальных условиях также дифференцируются в кардиомиоциты и преходяще ко-экспрессируют фактор Виллебранда и саркомерный миозин.

Напротив, нейральные стволовые клетки, которые достаточно неплохо дифференцируются в фенотип скелетной мышцы, в кардиомиоциты дифференцируются в низком проценте случаев. Фактор роста фибробластов и костного морфогенетического белка (bone morphogenetic protein), которые активируют кардиомиогенную дифференцировку в эмбриональных клетках, не активируют кардиогенез в эндотелиальных клетках и трансдифференцировку в ко-культуре, что доказывает, что за развитие сердца в эмбриогенезе и в более поздние периоды отвечают различные сигнальные молекулы. Тот факт, что эндотелиальные клетки могут превращаться в кардиомиоциты, проливает новый свет на свойство пластичности эндотелиальных клеток в течение развития и открывает перспективы для заместительной терапии аутологич-ными клетками при инфаркте миокарда.

Сосудистый эндотелиальный ростовой фактор—vascular endothelial growth factor (VEGF) — стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и индуцирует развитие кровеносных сосудов in vivo. Генная терапия при ишемии миокарда была выполнена прямым введением в миокард гена, кодирующего VEGF. Команда ученых из Yamagata University School of Medicine (Yamagata City, Japan) трансплантировала клетки Н9С2, трансфецированные геном VEGF, в инфарцированный миокард крыс. Через две недели крыс забивали и проводили морфологические исследования ткани миокарда. С помощью маркерных моноклональных антител в инфарктном миокарде была показана обильная неоваскуляризация вокруг трансплантированных клеток. Исследователи заключили, что клетки Н9С2, генетически модифицировавшие геном VEGF и затем пересаженные в поврежденные сердца крыс, переживают

13

и создают новые зоны роста сосудов. Эта методика может быть пригодной для клинического использования в будущем.

Неоангиогенез приводит к снижению апоптоза гипертрофированных миоцитов в периинфарктной зоне, длительному сохранению жизнеспособного миокарда, сокращению коллагенообразования и существенному улучшению сердечной функции. Использование человеческих цитокин-мобилизованных аутологичных костномозговых ангиобластов для реваскуляризации инфарцированного миокарда (в качестве монотерапии или в сочетании с другими современными методами лечения) может значительно уменьшить осложнения и летальность, связанные с ремоделированием левого желудочка.

Клинические данные о терапевтической эффективности доставки в принекротическую зону гемопоэтических стволовых клеток аутологичного костного мозга, как правило, не сопровождаются убедительными доказатель­ствами присутствия введенных клеток в зоне повреждения миокарда. Целью проведенного в НИИТиИО (Москва) исследования было определение месторасположения стволовых клеток костного мозга, доставленных в миокард больных ИБС интракоронарным или интрамуральным способом. Исследование выполнено у трех больных ИБС, перенесших один инфаркт миокарда и более. Интракоронарное введение стволовых клеток провели двум больным, а одному больному — интрамиокардиальную трансплантацию стволовых клеток обкалыванием зоны повреждения во время операции на открытом сердце. Для визуализации местоположения стволовых клеток в сердце аутологичные культивированные клетки костного мозга предварительно в течение одних суток метили в растворе таллия-201 (²⁰¹Т1). Было показано, что при интра-миокардиальном и интракоронарном введении стволовых клеток достигается их преимущественная локализация в зоне повреждения. При этом создаются условия не только для более эффективного воздействия введенных клеток на патологические процессы в миокарде, но и условия для снижения каких-либо побочных генерализованных воздействий на организм в целом. Отсутствие очагов накопления таллия вне зоны введения—как в пределах миокарда, так и в печени — свидетельствует о том, что клетки при обоих вариантах введения остаются только в зоне введения. Более того, у обоих пациентов, которым за три недели до интракоронарного введения был восстановлен просвет коронарных артерий в бассейне перенесенного инфаркта миокарда, вводимые клетки распределились именно в зоне гипоперфузии — зоне перенесенного инфаркта миокарда. В бассейне правой коронарной артерии, впрочем, как и в печени, никаких очагов накопления таллия-201 отмечено не было. Однако ответить на вопрос о том, как долго живут и функционируют эти клетки после их введения, использованный метод не позволяет. Поэтому результаты долгосрочного влияния вводимых аутологичных стволовых клеток радионук-лидными методами можно оценить лишь опосредованно, изучая изменения перфузии, функции и метаболизма миокарда (Остроумов и др., 2004).

В экспериментальных исследованиях и клинических наблюдениях убедительно показаны стимуляция регенерации миокарда и неоваскулогенез при трансплантации мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга, содержащих около 2% гемопоэтических и 0,05% мезенхимальных стволовых

14

клеток (Шумаков и др., 2005). Одной из перспективных стратегий, которые смогут компенсировать дефицит гемоперфузии ишемизированных областей сердца после инфаркта миокарда, является неоангиогенез, а именно стимуляция развития новых кровеносных сосудов. Целью проведенной в НИИТиИО (Москва) работы явилось изучение влияния стромальных и продифференци­рованных в эндотелиальном направлении клеток аутологичного костного мозга на стимуляцию роста новых сосудов в поврежденном миокарде. Подсчет количества сосудов в контрольной группе (без введения клеток) и в двух экспериментальных группах после ТП клеток показал достоверное увеличение количества сосудов в обеих экспериментальных группах (Потапов и др., 2005).

Ученые в Ростокском университете (University of Rostock, Германия) трансплантировали аутологичные стволовые клетки костного мозга в инфаркт­ную пограничную зону шести пациентам, которые перенесли инфаркт миокарда и шунтирование коронарной артерии (Stamm et al., 2003). Все пациенты выжили и хорошо себя чувствовали спустя 3 и 9 месяцев после операции. У четырех пациентов улучшилась функция левого желудочка, у пяти пациентов значительно возросла перфузия инфарцированных областей. Авторы полагают, что имплантация стволовых клеток в сердце является безопасной и могла бы индуцировать развитие кровеносных сосудов, улучшая, таким образом, перфузию инфарктного миокарда.

Исследованием ученых Stanford University School of Medicine (Palo Alto, США, 2005) выявлено, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) не способны замещать сердечную мышцу после инфаркта, что опровергает более ранние предположения (Balsam et al., 2004). Они обнаружили, что у мышей ГСК присутствуют в поврежденных сердцах, но сохраняют при этом фенотип клеток крови и не трансформируются в мышечные клетки. Это исследование отличается от предшествующих работ, в которых исследователи использовали цельный костный мозг мышей и затем выделяли их него различные популяции клеток, включая высокоочищенную субпопуляцию стволовых клеток, клетки которой могут формировать все виды клеток крови. До этого в экспериментах использовали менее однородные по своему составу клетки. Однако это исследование не исключает важной роли стволовых клеток в восстановлении функции сердца. Трансплантированные кроветворные клетки могут вовлекать в работу новые кровеносные сосуды в поврежденных тканях. Эти новые сосуды могут сохранить жизнеспособность сердечных мышечных клеток, которые в противном случае погибли бы, и таким образом косвенно сохраняют миокард. Методами генной инженерии клетки можно дополнительно модифицировать, задействовав при этом новые кровеносные сосуды, так что они могут стать частью успешного лечения.

Исследование ТОРС ARE- AMI (The Transplantation of Progenitor Cells And Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction) позволит оценить у больных с острым инфарктом миокарда безопасность, выполнимость и потенциальное воздействие на функцию миокарда внутрикоронарного введения или циркулирующих в периферической крови прогениторных клеток эндотелия (СРС), или полученных из костного мозга (ВМС) прогениторных клеток (Schachinger et al., 2005). Результаты этого исследования показывают,

15

что у больных острым инфарктом миокарда, которым успешно была проведена реваскуляризация методом стентирования, внутрикоронарное введение прогениторных клеток эндотелия (СРС или ВМС) безопасно и выполнимо. Абсолютная безопасность метода и благоприятное влияние на ремодели-рование левого желудочка послужили основанием для более крупных рандомизированных двойных слепых испытаний. Длительные, двухлетние клинические испытания TOPCARE-AMI выявили, что показатели ЛБФВ сохранялись, и даже наблюдался ее прирост у пациентов с клеточной трансплантацией, и уровень в сыворотке крови NT-proBNP, как объективного показателя ремоделирования левого желудочка сердца, неуклонно снижался. Длительное наблюдение в клинических испытаниях необходимо для I мониторинга устойчивости функционального эффекта, наблюдаемой у пациентов, которым ввели ГСК после ОИМ.

Мобилизация периферических стволовых; клеток крови (PBSCs) грануло- I цитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF) и интракоронарное их ] введение были исследованы в качестве альтернативы инвазивному забору клеток костного мозга. В Южной Корее в рандомизированном испытании с участием пациентов с ОИМ, которые перенесли стентирование, применение I G-CSF в сочетании с интракоронарным введением PBSCs показало улучшение 1 функции сердца и усиление ангиогенеза (Kang et al„ 2004). Однако при этом I стало серьезной проблемой учащение рестенозов, и дальнейшее расширение исследования было приостановлено. Возможное объяснение этого небла- I гоприятного эффекта — дифференцировка мобилизованных G-CSF проге- I ниторных клеток в гладкомышечные клетки в местах стентирования. Авторы предостерегают, что при дальнейшем использовании терапии мобилизо- I ванными G-CSF стволовыми клетками пациенты должны тщательно обследоваться на предмет непредвиденных эффектов.

Одним из часто применяемых критериев оценки считаются изменения в показателях общей левой желудочковой фракции выброса (ЛБФВ) сердца до ] и после клеточной трансплантации, которая обычно является оценочным I критерием в клинических испытаниях.

В немецких исследованиях BOOST на 60 пациентах статистически значимый 1 позитивный эффект введения ГСК костного мозга был установлен по истечении шести месяцев. Показатель левой желудочковой фракции выброса (ЛБФВ) вырос на 6,7% в группе ГСК и только на 0,7% — в контрольной группе. Однако по истечении 18 месяцев разница в показателях между группами исчезла.

Два крупнейших на сегодняшний день клинических испытания были проведены группами немецких и норвежских ученых. Немецкое исследование REPAIR-AMI (2005) включало 204 пациента и показало, что в группе с введением гемопоэтических стволовых клеток показатель ЛБФВ составляет 5,5% по сравнению с 3% в контрольной группе. Разница являлась статистически значимой, но интерпретации результатов препятствовало использование вентрикулографии вместо более надежных методов оценки ЛБФВ у пациентов с инфарктом миокарда.

Норвежское исследование AST AMI (2005) включало 100 пациентов только ] с инфарктом передней стенки сердца и не обнаружило никаких значительных

различий в показателях между группами при изменении в ЛБФВ от исходного уровня в течение шестимесячного наблюдения, как было показано методами SPECT, эхокардиографии и MRI. Примечательно, что там было обнаружено похожее улучшение показателей ЛБФВ в обоих группах: 8,1% — в группе с введением ГСК костного мозга и 7,0% — в контрольной группе. Похожий прирост в ЛБФВ по прошествии шести месяцев (8,5% — в опытной группе и 8% — в контрольной группе) наблюдался и в датском клиническом исследо­вании STEMMI, сообщившем об отсутствии эффекта мобилизации ГСК из костного мозга при цитокиновой стимуляции в острой фазе инфаркта миокарда.

Можно полагать, что все эти клинические испытания подтвердили безопас­ность лечения ГСК костного мозга, а отличия между ними могут быть из-за различия в числе введенных клеток и самой технологии приготовления клеток, времени распределения и других неучтенных факторов. Тем не менее су­ществует, на мой взгляд, несколько фундаментальных общих ограничений в методологии.

Мы знаем, что только малые количества ГСК, вводимые интракоронарно, остаются в месте введения в сердце (~ 4%). В настоящее время концепция трансдифференцировки ГСК подвергается обоснованным сомнениям, и были предложены другие механизмы действия, такие, как паракринная регуляция и иммунная модуляция, которые все же нуждаются в доказательствах.

Однако до сих пор во всех клинических испытаниях не был достоверно и однозначно доказан долгосрочный эффект от лечения ГСК костного мозга пациентов с острым инфарктом миокарда. Все исследования показали, что если и имеется эффект от этого инвазивного лечения, то он, по-видимому, слабый.

Тем временем, пока некоторые исследователи требуют углубленных клинических испытаний для изучения эффекта нефракционированных популяций ГСК костного мозга с применяемой в настоящее время методологией, поиск популяции клеток с большей потенцией и методов подтверждения долговременного приживления большего количества клеток продолжается. Основанное на доступных данных, наше мнение заключается в том, что необходимо большее количество экспериментальных доказательств для определения более эффективных путей клеточной терапии пациентов.

Функциональная регенерация сердца, в прямом смысле, требует замены мертвых кардиомиоцитов. Некоторые стволовые и прогениторные клетки, полученные из костного мозга, циркулирующей крови или из ткани миокарда, приобрели кардиомиогенный фенотип после инъекции или инфузии в сердце. Однако противоречивые данные экспериментальных исследований несмогли Доказать дифференцировку костномозговых стволовых клеток в кардио-миоциты. Причина этого непонятна и может являться следствием технических вариаций экспериментальных условий. Более того, разные прогениторные клетки могут иметь различные возможности для дифференцировки в кардиомиоциты. Даже исследования, не доказывающие дифференцировку в

|^кардиомиоциты, подтвердили повышенную восстановительную способность работы сердца после ввода клеток, подчеркивая важность дополнительных механизмов, посредством которых клеточная терапия может вызывать

положительные эффекты. Слияние клеток могло бы быть альтернативным механизмом, лежащим в основе приобретения сердечного фенотипа прогениторными клетками. Однако скорость процессов слияния клеток мала в большинстве проведенных исследований.

Дальнейшие эксперименты выявили новую форму связи между прогени­торными клетками и кардиомиоцитами, т. е. образование "нанотрубчатых магистралей", которые позволяют осуществлять перенос протеинов и органелл, таких, как митохондрии, между двумя разными типами клеток. Пере­нос митохондрии от мезенхимальных стволовых клеток к клеткам с не достат­ком митохондрии показал его необходимость для аэробного дыхания в клетках-приемниках. Несмотря на то что важность in vivo и in vitro фактов неустанов-лена, транспорт протеинов или органелл может повлиять на судьбу клетки и работу прогениторных клеток.

Полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки (МСК) способны дифференцироваться в кардиомиоциты in vitro. Трансплантиро­ванные в миокард МСК могут под влиянием микроокружения дифференциро­ваться и экспрессировать сердечный фенотип in vivo (Wang et al., 2000). Чтобы исследовать способность человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) дифференцироваться в мышечный фенотип и регенерировать i мышечную ткань при сердечной недостаточности, специалисты американской компании Osiris Therapeutics Inc., специализирующиеся на клеточных технологиях, создали определенные условия культивирования для индукции миогенной дифференцировки МСК, а также трансплантировали МСК в сердца экспериментальных животных.

При проведении операции на открытом сердце группа специалистов Osiris Therapeutics Inc. имплантировала человеческие МСК непосредственно в стенку желудочка бестимусных крыс. МСК были витально помечены и идентифици­рованы по специфическим антителам, которые реагируют только с антигенами человека (но не с тканями животного-реципиента). Было установлено, что МСК приживаются в сердце в различные сроки после трансплантации, и в них была отмечена экспрессия специфических мышечных белков. Результаты еще одного экспериментального исследования на свиньях, проведенного в Johns Hopkins University (Baltimore, USA), показали, что взрослые МСК (полученные по методике Osiris Therapeutics) могут с эффектом использоваться для лечения инфаркта миокарда. Аллогенные МСК костного мозга, трансплантированные в поврежденное сердце животного, способны восстанавливать функцию сердца до ее первоначального уровня. Клетки были введены непосредственно в миокард, используя специальный катетер (Biocardia Inc.), введенный в артерию путем ее пункции по типу процедур, выполняемых с целью катетеризации сердца. Методика эта безопасна и эффективна. Ее использование расширит области применения клеточной терапии стволовыми клетками в будущем; наиболее существенны исследования с использованием внутривенного пути введения.

Если дальнейшие экспериментальные исследования и клинические испытания окажутся одинаково успешными, то, по мнению исследователей, эта технология смогла бы стать новым распространенным методом лечения по

18

установлению _и созданию условий для полной обратимости повреждения _ердечной мышцы после инфаркта или другого поражения, вызванного крушением ее кровоснабжения. Использование МСК позволит также обежать потенциальных проблем с иммуносупрессией, при которой иммунная _;цстема каждого животного, возможно, реагировала на стволовые клетки, юлученные из других источников, кроме своих собственных.

Поскольку МСК остаются на ранних стадиях развития, то они не вызывают иммунного ответа, в отличие от более дифференцированных стволовых клеток. )дно из многих преимуществ этого метода состоит в том, что взрослые СК шляются легкодоступными, они могут быть получены от самого пациента, и к требуется донорство, при необходимости клетки могут быть размножены.

В 2001 г. в Клинике кардиохирургии Ростока (Clinic of Cardiac Surgery) во фемя операции шунтирования МСК костного мозга мужчины были грансплантированы путем микроинъекций непосредственно в ткань его собственного сердца. После процедуры не было обнаружено никаких зсложнений, и медики выполнили такую же процедуру на других пациентах.

В кардиохирургической клинике Санкт-Петербургского ЕМУ в период с люня 2003 г. по март 2005 г. стволовые клетки в виде аутологичных мононук-геаров костного мозга (АМКМ) применены у 56 больных, которые страдали шлемической болезнью сердца (ИБС) или дилатационной кардиомиопатией (ДКМП). Интрамиокардиальное введение АМКМ выполнено во время операции аортокоронарного шунтирования, или АМКМ вводились через катетер во время коронарографии как отдельная процедура на фоне стабильного лечения традиционными медикаментозными препаратами. Медикаментозная терапия, подобранная за месяц до начала клеточной терапии, не менялась в течение всего срока наблюдения (до 18 месяцев) ни по качеству, ни по количеству. Клинически улучшение самочувствия отметили все больные. Уменьшение сердечной недостаточности и (или) коронарной недостаточности на 1—2 ступени отмечено в течение первых 2—3—6 месяцев после инфузии АМКМ, что нашло подтверждение при контрольном проведении нагрузочного теста с 6-минутной ходьбой. При эхокардиографии в среднем глобальная фракция изгнания левого желудочка увеличилась на 12±6%. Отмечено уменьшение конечного диастолического и конечного систолического объемов левого желудочка. ОФЭКТ подтвердила отчетливое уменьшение зон гипоперфузии миокарда в сроки 3 и 6 месяцев. Данные за 12 месяцев незначительно отличаются от данных по состоянию перфузии миокарда за 6 месяцев. При позитронной эмиссионной томографии миокарда отмечено Улучшение перфузии и метаболизма миокарда через 3—6 месяцев после введения АМКМ.

Улучшение перфузии миокарда и метаболизма при интрамиокардиальном или интракоронарном введении АМКМ дает возможность использовать данный Метод лечения не только в целях коррекции сердечной недостаточности, но и Для лечения коронарной недостаточности у больных с дистальным поражением ^к°ронарного русла.

Следует подчеркнуть, что наибольший эффект достигнут в тех случаях, ^к°гда имел место рецидив стенокардии при сохранной работе по крайней мере

19

одного из ранее наложенных шунтов или при дистальной форме поражения коронарных артерий (Немков и др., 2005).

В НИИТиИО (Москва) у пациентов с сердечной недостаточностью после! лечения, включавшего медикаментозную терапию, реваскуляризацию ] миокарда и трансплантацию МСК костного мозга, изучали значение и динамику I биологически активных веществ, потенциально значимых в патогенезе! сердечной недостаточности, обратного ремоделирования миокарда и! неоангиогенеза: ИЛ-6, С-реактивного белка (СРВ, hs СРВ), неоптерина (НП), I церулоплазмина (ЦП), Fas-опосредованного апоптоза (растворимой формы 1 индуктора апоптоза — sFas-L и ингибитора апоптоза — sFas). Обследован 411 пациент: 39 мужчин и две женщины (37 — ишемическая болезнь сердца, 4 —1 дилатационная кардиомиопатия), 16 пациентам трансплантацию клеток! выполняли интракоронарно и/или интракардиально во время ангиопластики | или во время операции аортокоронарного шунтирования. Изменение! параметров функциональной регенерации миокарда через 1 и 6 месяцев после I ТАККМ связано с уровнями маркеров воспаления и апоптоза в плазме крови I пациентов до лечения. Позитивная динамика наблюдалась у всех больных с I нормальными исходными уровнями маркеров воспаления. У пациентов с J повышенными исходными уровнями С-реактивного белка и неоптерина I тенденция к позитивным изменениям функции миокарда левого желудочка ] обнаружена у тех больных, у которых происходило снижение уровней маркеров I воспаления в течение 1 и 6 месяцев после лечения (Шевченко и др., 2005).

В Германии, России, Франции, США и Китае уже проводятся трансплан-! тации клеток костного мозга [26,35,37,46], аутологичных миобластов [44,45,1 47] пациентам с ИБС и кардиомиопатиями. Большинство исследователей I отмечают безопасность применения аутологичного материала, его неаритмоген-1 ность; однако после ТП миобластов в некоторых случаях отмечались аритмии I [41], иногда с летальным исходом [42], поэтому использование этого вида клеток 1 для ТП в миокард нежелательно. Остановимся несколько подробнее на этом I вопросе.

Клетки, взятые из скелетных мышц и введенные в инфарцированные области I миокарда, встраиваются в миокард и приобретают некоторые свойства! кардиомиоцитов. Очень важно, что клеточные трансплантаты улучшают I сократимость в инфарктных областях. В смоделированный криозондом! инфарктный миокард кроликов были трансплантированы аутологичные I скелетные миобласты (предшественники мышечных клеток), чтобы! предотвратить рост зоны некроза после экспериментального инфаркта! миокарда (ИМ) (Taylor et al., 1998). Последующие гистологические I исследования сердца показали, что в области инфаркта имеются различные I по размерам островки удлиненных исчерченных клеток, проявляющих I характеристики и скелетных, и сердечных мышечных клеток. У кроликов после I трансплантации миобластов улучшилась функция сердца. Возможность I регенерации функционирующей мышцы после аутологичной трансплантации I миобластов может иметь важное значение для пациентов после ИМ.

После ИМ главный определяющий фактор неблагоприятного прогноза — I постинфарктное ремоделирование, сопровождающееся левожелудочковой

20

пилатацией. Имплантация скелетных миобластов улучшает функцию постинфарктного сердца путем регуляции процессов неблагоприятного ремоделирования, и это действие может быть значительно усилено Нацеливанием на интерлейкин-1 (IL-1), который является ключевым регулятором неблагоприятного ремоделирования и смерти транспланти­рованных клеток (Murtuza et al., 2004). В другом исследовании имплан­тированные скелетные миобласты формировали жизнеспособные трансплан­таты в инфарктном миокарде, в результате чего улучшали сократительную функцию постинфарктного сердца и уменьшали степень желудочковой дилатации (Jain et al., 2001). Эти данные показали, что трансплантация сингенных миобластов после ИМ улучшает измеренные in vivo и ex vivo показатели общей желудочковой дисфункции и патологического ремодели­рования, и свидетельствуют о том, что клеточная трансплантация может оказывать лечебный эффект после ИМ.

Аутологичные скелетные миобласты — первые клетки, которые стали использоваться в клинике у больных с выраженной сердечной недостаточ­ностью ишемического генеза, и они имеют свои преимущества. Предвари­тельные данные I фазы клинических испытаний подтвердили выполнимость и безопасность аутологичной трансплантации скелетных миобластов при тяжелых формах ишемической кардиомиопатии (Menasche, 2003). Есть некоторые данные об аритмогенном потенциале миобластов. Предварительные данные относительно эффективности обнадеживают, но они должны быть подтверждены крупными проспективными рандомизированными исследо­ваниями. В настоящее время в клинических испытаниях клеточной трансплантации для лечения ИБС участвуют более 150 пациентов во всем мире (главным образом в Европе).

Genzyme Biosurgery в сотрудничестве с Myosix SA of Paris проводит П фазу клинических испытаний, проверяющих безопасность и эффективность трансплантации миобластов в сердце с целью предотвращения прогресса сердечной недостаточности у больных, перенесших инфаркт миокарда. Исследование предполагает забор собственных (аутологичных) клеток скелетной мышцы пациента до операции шунтирования методом малоинва-зивной биопсии нижней конечности, размножение клеток в течение трех недель в лаборатории и введение их в поврежденную область сердца в бассейн шунта коронарной артерии. Первый пациент, давший согласие на участие в исследовании, был пролечен в декабре 2002 г. в Но pitaux de Paris. Ожидается, что в дальнейших клинических исследованиях примут участие пациенты не только из Франции, но и из других стран Европы, США и Канады. Однако интерпретация результатов клеточной трансплантации затруднена по Различным причинам: малочисленность наблюдений, неоднородность групп пациентов, комбинация клеточной терапии с медикаментозным и хирурги­ческим лечением.

MyoCell ™ (Биосердце) — препарат регенерационной тканевой терапии Для лечения целого спектра сердечно-сосудистых заболеваний, начиная от стенокардии до терминальных стадий болезней сердца. Аутологичные Миобласты выделяются из биоптата скелетной мышцы. Терапия MyoCell ™

21

состоит из патентованной среды транспорта и среды введения, процесса ферментной диссоциации биоптата, процесса селекции миобластов] питательной среды и последующей трансплантации в поврежденную сердечную] мышцу. Ферментативный процесс диссоциации позволяет получить весьма] специфическую субпопуляцию миобластов, а среда для введения сохраняет] клетки в неизменном виде в течение восьми дней до момента введения и позволяет мышце расти постепенно, а не бесконтрольно и способствует] лучшему формированию мышцы. В состав Биосердца MyoCell ™ гарантиро-] ванно входит активный ингредиент, состоящий из клеточной популяции] способной приживаться, пролиферировать, адаптироваться к сердечному] микроокружению и поддерживать работу сердца. Миобласты доставляются] транскутанно по катетеру по той же системе, какая используется во время операции коронарного шунтирования.

В 2001 г. была проведена первая чрезкожная малоинвазивная трансплан J тация в поврежденные области постинфарктного сердца культивированных] аутологичных миобластов, взятых путем биопсии скелетной мышцы бедра] пациента (Bioheart Inc's MyoCell). Процедура была выполнена группой кардиохирургов в медицинском центре Роттердамского университета в] Нидерландах. В поврежденные участки миокарда пациента было сделано десять] инъекций общим числом 25 млн. клеток с использованием внутрижелудочко-! вого зонда, введенного в бедренную артерию. Пациент был выписан через 24 ч] и три дня спустя чувствовал себя удовлетворительно. Это исследование было] частью оценки безопасности препарата Биосердца MyoCell, который теперь] находится на III фазе клинических испытаний в Европе. Это может стать одним] из самых значительных исследований в истории лечения пациентов с] заболеваниями сердца.

Для целей клеточной кардиомиопластики используется прямое введение в| постинфарктный рубец клеток с регенерационным потенциалом. Эта] процедура может быть проведена с использованием MyoCath ™ — частью! Биосердца, представляющей собой зондовую систему доставки препарата] MyoCell ™ в миокард посредством ретроградной катетеризации полости левого] желудочка. Поскольку было отмечено, что имплантация аутологичных] скелетных миобластов приводит к замещению ^функционирующего] миокардиального рубца функционирующей мышцей и восстановлению! функции миокарда, имплантация миобластов во время операции шунтирования! коронарных артерий или трансэндокардиально может привести к тем же самым! результатам. В принципе, имплантация миобластов по катетеру может! обеспечить тот же самый терапевтический эффект. В рамках программы! MYOHEART (Myogenesis Heart Efficiency and Regeneration Trial) проводится! мультицентровое открытое нерандомизированное клиническое исследование,! которое призвано оценить безопасность и кардио- и ангиопротективный эф-] фекты MyoCell™, имплантированного с использованием системы MyoCath™] при застойной сердечной недостаточности после инфаркта миокарда в] сочетании с установленным дефибриллятором-кардиовертером.

Перечень проводимых клинических испытаний клеточной терапии при] сердечно-сосудистых заболеваниях представлен в таблице (сайт ЦБМТ).

22

Клинические испытания клеточной терапии в лечении сердечно-сосудистых заболеваний

Показание Тип клеток и характер Тип Спонсор

воздействия исследования

ОИМ Интракоронарное введение Открытое иссле- Goethe-University

взрослых прогениторных кле- дование (Frankfurt, Germany)

ток (TOPCARE-AMI)

ЗСН после Трансплантация аутологичных II фаза GenVec

ИМ миобластов

ЗСН с необ- Введение 25—45 млн. аутоло- Открытое иссле- University of Pitts- ходимостью гичных стволовых клеток, выде- дование на 5—10 burgh, Pennsylvania установки ленных из костного мозга, в пациентах левожелу- пораженный миокард во время дочкового операции установки левоже- обхода лудочкового обхода

"ИБС, ИМ, MYOHEART (Myogenesis Heart I фаза Bioheart Inc. ЗСН Efficiency and Regeneration Trial). Препарат: MyoCell™. Устройство: MyoCath™

ИМ Ex vivo размножение аутоло- II фаза Genzyme Biosurgery /

гичных мышечных клеток и Myosix SA (Paris)

имплантация в рубцовую зону сердца во время операции шун-

тирования коронарных артерий

ИМ Интракоронарное введение ауто- Открытое иссле- Heinrich-Heine-Uni-

логичных мононуклеарных кле- дование на 10 па- versity (Dusseldorf,

ток костного мозга циентах Germany)

ИМ Введение аутологичных клеток Открытое иссле- University of Rostock

костного мозга в пограничную дование на 6 па- (Rostock, Germany)

зону инфаркта пациентов, пере- циентах несших шунтирование

ИМ Внутривенное введение взрос- I фаза Johns Hopkins/ Osiris

лых МСК, выделенных из кост- Therapeutics

ного мозга пациента

ИМ и ЗСН Препарат MyoCell, состоящий III фаза в Европе Bioheart Inc./ Univer- из запатентованных транспорт- sity of Rotterdam, The

ной среды, среды введения, Netherlands

ферментативной диссоциации биоптата, процесса выделения миобластов, среды культиви­рования и трансплантации в

пораженную мышцу сердца

ИБС с сер- Аутологичные скелетные мио- Открытое иссле- Bichat-Claude-Bernard Дечной не- бласты дование Hospital Paris (France)

Достаточ­ностью

23

Клеточная терапия болезней сердца еще не доказала своей бесспорной эффективности. Только десять клинических испытаний по применению клеток костного мозга для лечения болезней сердца были закончены с положительным результатом. Процент полного восстановления сердечной функции у пациен­тов был низок. Трудности в применении клеток костного мозга для лечения болезней сердца действительно означают недостаточный уровень исследован-ности стволовых клеток и говорят о необходимости проведения новых исследований.

Один из новых методов лечения болезней сердца, в котором используются стволовые клетки, разрабатывается в Йоркшире в Sheffield University. В случае успеха он позволит получить значительно лучшие результаты лечения и даст многим пациентам более долгую жизнь. Ученые этого университета создали первое в мире регенеративное устройство на основе стволовых клеток для вставки в поврежденные болезнью артерии. Ученые считают, что в случае успеха испытаний их изобретение сможет спасти тысячи жизней.

Каждый год во всем мире от заболеваний коронарных артерий умирает около 7 млн. человек. Один из самых распространенных в настоящее время способов лечения—имплантация стента (эндопротеза сосуда). Это устройство расширяет сузившийся в результате болезни просвет артерии и позволяет крови лучше проходить через нее.

Чтобы стент не вызывал иммунной реакции, его покрывают специальными '■ веществами, но это не самое лучшее решение. Ученые из Sheffield University считают, что гораздо лучшие результаты даст покрытие стента из человеческих стволовых клеток. Это позволит не только избежать реакции отторжения, но ■ и добиться более полной интеграции имплантата и стимуляции процессов регенерации. В данном исследовании используются эмбриональные стволовые клетки, которые выделены и культивируются в лабораториях университета.

В настоящее время проводятся исследования на животных, но как только I будет установлена безопасность и эффективность нового метода, будут начаты его клинические испытания.

Методики с применением стволовых клеток костного мозга являются достаточнб безопасными, потому что пациентам вводятся их собственные клетки. Исследователи из Медицинской школы Питтсбургского университета США (University of Pittsburgh School of Medicine — UPMC) сегодня продолжают набор добровольцев для участия в клинических испытаниях клеточной терапии стенокардии. Цель этого общенационального исследова­ния — установить безопасность и эффективность лечения аутологичными стволовыми клетками (СК) пациентов, которым по каким-либо причинам не подходят традиционные методы терапии. Предполагается, что введение стволовых клеток будет стимулировать ангиогенез — рост кровеносных сосудов — в той части сердца, которая из-за сужения коронарных артерий страдает от недостатка кровоснабжения. К настоящему времени в UPMC Car­diovascular Institute уже есть шесть пациентов, готовых к участию в испытаниях, и будет набрано еще 20 добровольцев. Всего же в 15—20 медицинских центрах США, проводящих это исследование, новый метод будет использован в лечении 150 человек в течение 2007—2008 гг. Эти клинические испытания спонсируются

24

₀дразделением клеточной терапии известной американской компании Baxter Healthcare Corp. Экспериментальный метод лечения предназначен для больных стенокардией, страдающих от болей в груди и одышки, несмотря на проведенное традиционными методами лечение.

Участники испытаний в течение пяти дней будут принимать препарат, сти-]угулирующий выход стволовых клеток в кровь, после чего при помощи спе­циального оборудования СК будут выделены из крови. Затем СК будут введены в определенную область сердца. После этой процедуры будет выполнен долго­временный мониторинг состояния пациентов с учетом проявления симптомов болезни, суточной активности, тестов на нагрузку, показаний МРТ и т.д.

Для участия в испытаниях приглашаются взрослые добровольцы с тяжелой болезнью коронарных артерий, которым не предлагаются проведение ангиоплас­тики, операции игунтирования и лечение другими традиционными методами.

По утверждениям клиницистов, методика аутологичной трансплантации клеток костного мозга безопасна, поскольку после лечения приблизительно 250 пациентов во всем мире неблагоприятного эффекта не наблюдалось, и результаты пока являются обнадеживающими. Большинство исследований, однако, свидетельствуют о 5—10%-ном улучшении функции сердца. Возможно, это немного, но, имея в виду тот факт, что большинство пациентов были очень больны к началу лечения, — это значительный результат.

Таким образом, в настоящее время метод клеточной трансплантации рассматривается большинством исследователей как перспективный. Метод уже применяется в клинической практике для улучшения прогноза у больных с сердечной недостаточностью (СН) различного генеза (ИБС, дилатационная и ишемическая кардиомиопатии и др.). Результаты трансплантации аутоло-гичных взрослых СК КМ у больных ИБС, облитерирующими заболеваниями периферических сосудов за рубежом и в России говорят об улучшении результатов традиционных методов лечения и, что немаловажно, о безопасности применения аутологичных СК КМ в клинике: ни в одном из опубликованных клинических исследований не было указаний на развитие каких-либо осложнений, связанных с использованием СК КМ.

Вместе с тем нельзя не отметить, что к настоящему моменту данных, позволяющих рекомендовать методы клеточной терапии для широкого внедрения в повседневную клиническую практику, недостаточно. Необходимы хорошо продуманные и качественно выполненные клинические исследования, Целью которых было бы определение эффективности различных вариантов клеточной терапии при заболеваниях сердца, разработка показаний и противопоказаний к использованию данного метода, выработка рекомендаций по комбинированию методов клеточной терапии с традиционными хирурги­ческими и консервативными подходами к лечению болезней сердца.

Литература

1 • Галанкин В.Н. Некоторые вопросы регенерации и гипертрофии миокарда. Автореф. дис. ... д.м.н. М., 1974. 24 с.

2- Kim W.H., Joo С. U., Ku J.H. et al. Cell cycle regulators during human atrial develop­ment // Korean J. Intern. Med., 1998. Vol. 13. P. 77-82.

25

3. СаркисовД. С. Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1979.284 с.

4. ПалежаевЛ.В., АхабадзеЛ.В., МузлаеваНА., ЯвичМ.П. Стимуляция регенерации мышцы сердца. М.: Наука, 1965. 396 с.

5. Hierlihya A.M., Sealea P., Lobeb С.G. et al. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population // FEBS Letters., 2002. Vol. 530. P. 239—243.

6. BeltramiA.P., BarlucchiL., TorellaD. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration // Cell., 2003. Vol. 114. P. 763—776.

7. Ohab H, Bradfutecd S.B., Gallardoe T.D. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation and fusion after infarction // PNAS, 2003. Vol. 100(21). P. 12313-12318.

8. Kajstura J., Torella D., Urbanek K. et al. Senescence and death of primitive cells and myocytes leads to premature cardiac aging and heart failure // Circ. Res., 2003. Vol. 93. P. 604-613.

9. Messina E., Angelis L.D., Frati G. et al. Isolation and Expansion of Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart // Circ. Res., 2004. Vol. 95. P. 911—921.

10. Koh G. Y., SoonpaaM.H., KlugM.G. et al. Stable fetal cardiomyocyte grafts in the hearts of dystrophic mice and dogs. // J.Clin. Invest., 1995. Vol. 96. P. 2034—2042.

11. LeorJ., Patterson M., Qumones MJ. et al. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium? // Circulation, 1996. Vol. 94[suppl II]. P. II, 332-336.

12. Li R.K., Jia Z.Q., Weisel R.D. et al. Cardiomyocyte transplantation improves heart function. // Ann. Thorac. Surg., 1996. Vol. 62. P. 654—660.

13. Chiu R.C., Zibaitis A., Kao R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell implantation // Ann. Thorac. Surg., 1995. Vol. 60. P. 12—18.

14. Murry C.E., Wiseman R. W., Schwartz S. M. et al. Skeletal Myoblast Transplantation for Repair of Myocardial Necrosis. // J. Clin. Invest., 1996. Vol. 98. P. 2512-2523.

15. Atkins B.Z., Lewis C.W., Kraus W.E. et al. Intracardiac Transplantation of Skeletal Myoblasts Yields Two Populations of Striated Cells In Situ // Ann. Thorac. Surg., 1999. Vol. 67. P. 124-129.

16. TomitaS., LiR.K., Weisel R.D. et al. Autologous transplantation of bone marrow cell inproves damaged heart function // Circulation, 1999. Vol. 100(suppl. II). P. II, 247— 256.

17. LiR.K., Jia Z.Q., Weisel R.D. et al. Smooth Muscle Cell Transplantation into Myocar­dial Scar Tissue Improves Heart Function // J. Mol. Cell. Cardiol., 1999. Vol. 31. P. 513-522.

18. Murry C.E., Kay MA,, Bartosek T. et al. Muscle Differentiation during Repair of Myo­cardial Necrosis in Rats via Gene Transfer with MyoD. // J.Clin. Invest., 1996. Vol. 98. P. 2209-2217.

19. Потапов KB. Трансплантация фетальных кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. Дис. ... к.м.н. М., 2003. 114 с.

20. YooKJ., LiR.K., Weisel R.D. et al. Autologous Smooth Muscle Cell Transplantation Improved Heart Function in Dilated Cardiomyopathy // Ann. Thorac. Surg., 2000. Vol. 70. P. 859-865.

21. РепинВ.С, СухихГ.Т. Медицинская клеточная биология. М.: РАМН, 1998. 200 с.

22. Sakai Т., LiR.K, Weisel R.D. Autologous Heart Cell Transplantation Improves Car­diac Function After Myocardial Injury // Ann. Thorac. Surg., 1999. Vol. 68. P. 2074— 2081.

26

?3 Chiu R.C., Zibaitis A., Kao R.L. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration

' _with satellite cell implantation // Ann. Thorac. Surg., 1995. Vol. 60. P. 12-18. 74. Wang JS., Shum-Tim D., Galipeau J. et al. Marrow stromal cells for cellular

cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages // J. Thorac. Cardiovasc.

Surg., 2000. Vol. 120. P. 999-1006.

25. OrlicD., Kajstura J., ChimentiS.,AnversaP. et al. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium // Nature. 2001. Vol. 410. P. 701-705.

26. StrauerB.E., BrehmM., Zeus Т., KosteringM. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans.// Circulation. 2002. Vol. 106. N15. P. 1913-1918.

27. Deb A., WangS., SkeldingKA. et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart// Circulation, 2003. Vol. 107. P. 1247—1251.

28. Yeh Т.Н., Zhang S., Wu H.D. et al. Transdifferentiation of human peripheral blood CD34- enriched cell population into cardiomyocytes, endothelial cells and smooth muscle cells in vivo // Circulation, 2003. Vol. 108. P. 2070—2073.

29. Nygren J.M., Jovinge S., Breitbach M., Sawen P. et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation// Nat. Med., 2004. Vol. 10. N5. P. 494—501.

30. Balsam L.B. et al. Heamatopoietic stem cells adopt mature haematopoietic fates in ischemic myocardium // Nature, 2004. Vol. 428. P. 668—673.

31. Saito Т., Dennis J.E., Lennon D.P. et al. Myogenic expression of mesenchymal stem cells within myotubes of mdx mice in vitro and in vivo // Tissue Eng., 1995. Vol. 1. P. 327-343.

32. Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Потапов И.В. и др. Выявление кардиоспеци-фического тропонина I в предифференцированных мезенхимальных стволовых клетках костного мозга млекопитающих // Вестник трансплантологии и ис­кусственных органов, 2002. № 3. С. 87.

33. НатапоК., NishidaM., HirataK. et al. Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease Clinical Trial and Preliminary Results // Jpn. Circ. J., 2001. Vol. 65. P. 845—847.

34. Kamihata H, Matsubara H., Nishiue T. et al. Implantation of bone marrow mononu­clear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional func­tion via side supply of angioblasts, angiogenic ligands and cytokines // Circulation, 2001. Vol. 104. P. 1046-1052.

35. Stamm C, Westphal В., KliineH. et al. Autologous bone-marrow transplantation for myocardial regeneration // Lancet, 2003. Vol. 361. P. 45—46.

36. TseH.F., Kwong Y.L., ChanJ.K.F. et al. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation // Lancet, 2003. Vol. 361. N9351. P. 47—49.

37. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Гуреев СВ., Онищенко НА., Темное А А. и др. Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для восстановления функции поврежденного миокарда // Материалы I Межд. конф. "Альтернативные методы реваскуляризации миокарда". М., 2004.

38. ChavakisE., DimmelerS. Regulation of endothelial cell survival and apoptosis during angiogenesis // Arterioscl., Thromb. and Vase. Biol., 2002. Vol. 22. P. 887—892.

39. DimmelerS., ZeiherA.M. Wanted! The best cell for cardiac regeneration // J. Am. Coll. Cardiol, 2004. Vol. 21. N 44(2). P. 464-466.

40. Kinnaird Т., Stabile E., Burnett M.S., Lee C.W., BarrS. et al. Marrow-derived stromal

27

cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms // Circ. Res., 2004 Vol. 94. P. 678-682.

41. SmitsP.C, van GeunsR.J., PoldermansD. et al. Catheter-based intramyocardial injec­tion of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up // J. Am. Coll. Cardiol., 2003. Vol. 42 P. 2063-2069.

42. БокершЛА., Ло П.К., Беришвили И.И., Голухова Е.З. и др. Первый клинический опыт применения аллогенных скелетных миобластов для лечения пациентов с ишемической кардиомиопатией // Бюллетень НЦССХ им. А. В. Бакулева РАМН 2004. Т. 5. № 4. С. 142-151.

43. Assmus В., Schachinger V., Теире С. et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction // Circulation, 2002. Vol. 106. P. 3009-3017.

44. HagegeAA., Carrion C, MenascheP. et al. Viability and differentiation of autologous skeletal myoblast grafts in ischaemic cardiomyopathy // Lancet, 2003. Vol. 361. P. 491— 492.

45. MenascheP., HagegeAA., Vilquin J.T. et al. Autologous skeletal myoblast transplan­tation for severe postinfarction left ventricular dysfunction // J. Am. Coll. Cardiol., 2003. Vol. 41. P. 1078-1083.

46. Schachinger V., Assmus В., Britten M.B. et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction Final One-Year Results of the TOPCARE-AMI Trial // J. Am. Coll. Cardiol., 2004. Vol. 44. P. 1690-1699.

47. PaganiF.D., DerSimonian H, ZawadzkaA. et al. Autologous skeletal myoblasts trans­planted to ischemia-damaged myocardium in humans. Histological analysis of cell survival and differentiation // J. Am. Coll. Cardiol., 2003. Vol. 41. P. 879—888.

48. Kawamoto A., Gwon H.C., IwaguroH. et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia // Circulation, 2001. Vol. 103. P. 634-637.

49. KocherAA., Schuster M.D., SzabolcsMJ. et al. Neovascularization of ischemic myo­cardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function // Nat. Med., 2001. Vol. 7. P. 430-436.

50. QuiriciN., SoligoD., CanevaL. et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133+ cells // British Journal of Haematology, 2001. Vol. 115. P. 186-194.

28

H. H. Беляев (Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина,

ЦБИ МОИ РК)

ЭНДОГЕННЫЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КАК ИСТОЧНИК АУТОЛОГИЧНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ

Основные свойства гемопоэтических стволовых клеток.

Важнейшим источником стволовых клеток во взрослом организме, как теперь хорошо известно, является костный мозг. Все многообразие типов клеток крови, непрерывно поддерживаемое на протяжении человеческой жизни, создается благодаря пролиферативной активности этих клеток, называемых гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК). ГСК обладают двумя важнейшими характеристиками. Они воспроизводят дополнительное количество стволовых клеток через самообновление, а также подвергаются дифференцировке с образованием прогениторных клеток (предшественников), которые становятся коммитированными, т. е. "обязанными" дифференциро­ваться в клетки различных гемопоэтических линий. Последнее свойство составляет основу идеологии трансплантации костного мозга [1].

ГСК могут обладать четырьмя основными свойствами: самообновлением, мультипотентностью, способностью к длительной реконституции и вторичной трансплантабельностью [2].

При делении ГСК по крайней мере одна дочерняя клетка сохраняет состояние этой ГСК. Эта способность называется самообновлением. Причем при различных условиях микроокружения могут проистекать три различных процесса: симметричное деление, асимметричное деление или полная дифференцировка обеих дочерних клеток [3]. Симметричное деление увеличивает количество ГСК, тогда как при асимметричном делении ГСК-потенциал сохраняется только в одной дочерней клетке, а другая дифференци­руется в предшественники. Деление, которое генерирует две дифференциро­ванные прогениторные клетки, элиминирует ГСК-потенциал.

Существуют две противоположные точки зрения на способность к самообновлению у ГСК по мере старения организма. По одной из них в клеточный цикл и дифференцировку входят только покоящиеся ГСК, что приводит к безвозвратному уменьшению их потенциала с возрастом [4]. Однако показано, что 10% от общего пула ГСК костного мозга делится симметрично каждый день, за счет чего происходит поддержание репопуляционного потенциала ГСК [5]. Кроме того, трансплантация костного мозга от старых Доноров молодым или старым реципиентам показывает, что ГСК-потенциал остается интактным на протяжении всей жизни у мышей [6].

Мультипотентность заключается в способности ГСК дифференцироваться по различным направлениям. Эти направления включают образование эритро­цитов, мегакариоцитов и тромбоцитов, гранулоцитов, моноцитов и макрофа­гов, остеокластов и дендритных клеток, NK-клеток, тимоцитов, Т-клеток и

29

В-клеток. Стволовые клетки, обладающие способностью к самообновлению ■ но более ограниченные в способности к дифференциации, обычно называются прогениторами (предшественниками), например общие лимфоидные предшественники В-, Т-лимфоцитов, NK-клеток и лимфоидных дендритных клеток; общие миелоидные предшественники гранулоцитов, моноцитов макрофагов, остеокластов и миелоидных дендритных клеток; мегакариоцитар-ные и эритроцитарные предшественники; гранулоцитарно-макрофагальные предшественники. Однако даже более дифференцированные стадии этих I различных линий могут иметь свойства стволовых клеток, т. е. обладать способностью к самообновлению.

Под реконституцией понимают способность ГСК восстанавливать кроветворение в костном мозге после трансплантации иммунологически I совместимому реципиенту. В основе этого явления лежит хоуминг, т. е. 3 направленная миграция ГСК в свою тканевую нишу, которой во взрослом ] огранизме является костный мозг. В зависимости от степени зрелости ГСК реконституция может быть кратковременной и долговременной [2]. При ' кратковременной реконституции трансплантированные предшественники после заселения костного мозга вступают в цикл деления, при котором наступает полная дифференцировка обеих дочерних клеток. При этом происходит потеря ГСК-потенциала. Долговременная реконституция известна только для так называемых покоящихся ГСК, которые заселяют костный мозг и длительно генерируют клеточные линии различных направлений гемопоэза.

Способность ГСК к хоумингу является важнейшей предпосылкой успешной реконституции при трансплантации костного мозга. Самым изученным фактором хоуминга для ГСК является белок SDF-1 (stroma-derived factor-1). 3 Он вырабатывается стромальными клетками костного мозга и удерживает ГСК в своей стволовой нише за счет экспрессии на их поверхности рецептора для хемокинов CXCR-4. Имея такой рецептор, ГСК мигрируют в сторону большей концентрации SDF-1 [7]. Другой молекулой, обеспечивающей адгезию ГСК на стромальных клетках костного мозга, является pi-integrin [8].

Фенотипические маркеры ГСК.

Успешное исследование ГСК было бы невозможным без открытия специ-фических маркеров на поверхности этих клеток. Так, мышиные ГСК были идентифицированы как клетки, лишенные маркеров линейной принадлежности (Lin) и несущие маркеры Sea-1 (Ly-6A/E)⁺ и c-Kit (CD 117)⁺ [9]. Однако экс- 1 прессия Sea-1 на ГСК значительно варьирует у различных линий мышей [ 10]. В качестве альтернативного маркера предлагают использовать маркер CD34, хотя встречаемость этого маркера также варьирует от линии к линии [11]. Идентификация и очистка человеческих ГСК показали, что большинство их принадлежит к С034⁺-фракции. Эти клетки обнаруживаются в костном мозге, пуповинной и периферической крови [12,13]. Однако ГСК и незрелые мульти-потентные предшественники составляют только небольшую фракцию всего пула С034⁺-клеток, выделенных из гемопоэтической ткани. Большая часть примитивных гемопоэтических клеток, представленных в человеческом кост­ном мозге, обнаруживается в небольшой части (1—5 %) С034⁺-фракции, кото-рая почти не экспрессирует CD38 [14]. Эти клетки также не экспрессируют

30

, fjLA-DR и CD45RA, но ко-экспрессируют CD90 (Thy-1), CD 117 или СР Л [15—18]. Хотя использование CD34 в качестве маркера стволовых клеток

тного мозга широко применяется, имеются доказательства существования ^К°^С ь примитивной популяции CD34 стволовых клеток. Эти клетки могут °⁴⁶ пировать С034⁺-фенотип in vivo в SCID-мышах и даже обладают способ-^1-6 тью дифференцироваться в клетки негемопоэтического ряда [ 19]. Дальней-^Н е исследования уточнили фенотип данной популяции ГСК (CD 133⁺CD34~) показали их больший, чем у CD34⁺ ГСК, реконституционный потенциал [20]. Ияентифицированы и другие важные маркеры человеческих и мышиных ГСК с долговременным реконституционным потенциалом. Они включают VERFR-2, PSGL-1, CD45, CD 164, CXCR4, MDR, AA4, Bcrpl, ABCG2, endoglin и др. [21].

Наиболее часто для идентификации ГСК и ранних предшественников используют маркеры, приведенные в табл. 1 [22].

Как видно из таблицы, спектр CD-маркеров, присущих ГСК, довольно большой. Среди них абсолютной уникальностью обладают CD133 и CD164. Остальные маркеры в той или иной степени присутствуют и на некоторых типах зрелых клеток крови. Однако в настоящее время для выделения ГСК чаще всего используют моноклональные антитела к С034-маркеру.

Использование ГСК в гематологии. Трансплантационные проблемы.

Начиная с 1963 г. основным источником аллогенных гемопоэтических трансплантаций рассматривался костный мозг [23]. Аллогенная гемопоэти-ческая клеточная трансплантация успешно используется в качестве замести­тельной терапии пациентов с пластической анемией, лейкемией и некоторыми генетическими заболеваниями крови, а также активно исследуется как средство для лечения злокачественных и незлокачественных опухолей [24,25].

Таблица 1 CD-маркеры ГСК и ранних гемопоэтических предшественников

CD-маркеры Мультипотентные Зрелые клетки

ГСК/ранние предшественники

bdJj_____ Лимфоидные Т-клетки, тимоциты

_^l£f__^^ Миелоидные Моноциты/макрофаги

4 ГСК/миелоидные

—— . и лимфоидные Эндотелиоциты

гЦ Лимфоидные Активированные В-клетки, плазмоциты

-S^iZiPgUenTop к SCF) ГСК Тимоциты

« (рецептор к IL-3) ГСК Моноциты/макрофаги, мегакариоциты,

—______ гранулоциты

• (Рецептор к IL-7) Лимфоидные Т-клетки, пре-В-клетки, моноциты

£Р*131 (общая цепь

-^°Р?^К IL-3 и IL-5) ГСК Моноциты/макрофаги

CD133

7^^____ гск -

CD 135

Т^г—-—__^ ГСК В-клетки, моноциты/макрофаги

^----^___^ ГСК -

31

I _антитела к СБ34-маркеру прикрепляют тем или иным способом к железосодер-I жашим микрошарикам, покрытым поливинилпиролидоном или декстраном, I получая, тем самым, иммуноаффинный сорбент (рис. 1).

Суспензию клеток, содержащих ГСК, смешивают с микрошариками, а I затем переносят в специальную колонку или пробирку, помещенную в I постоянное магнитное поле. При этом клетки, несущие СБ34-маркер, фиксируются в матриксе колонки или на стенках пробирки, а все остальные клетки удаляются вымыванием или декантацией. Затем магнитное поле убирают и целевые клетки собирают для дальнейшего использования. По данным проточной цитофлуориметрии, чистота полученных ГСК превышает 90%.

Прямое выделение С034⁺-клеток представляет собой позитивную клеточную селекцию, в результате которой Т-клетки удаляются пассивно. Комбинирование активного удаления Т-клеток (через СБЗ-маркер) с последующей положительной селекцией CD34⁺- или CD 133⁺- клеток позволяет поднять уровень извлечения ГСК из костного мозга или периферической крови до 60%, а содержание Т-клеток понизить более чем в 30 раз. Аутологичная трансплантация ГСК.

Осложнения, связанные с гистосовместимостью, отсутствуют при проведе­нии аутологичной трансплантации костного мозга, например в случае забора костного мозга до миелоаблации у больных множественной миеломой [30]. Однако здесь возникает другая проблема, связанная с трудностями полного удаления злокачественных лимфоидных клеток из препарата, подготов­ленного для трансплантации, ввиду возможности повторного заноса опухоле­вых клеток [31].

Экспериментальные и клинические исследования показали высокую

I эффективность использования высокоочищенных и концентрированных препаратов аутологичных ГСК, выделенных из собственного костного мозга, при лечении аутоиммунных заболеваний [32—36].

((( /£Х ^\\

N ( Q<- <?§f ^гск Ъе> >Q \ s

% ^ )))

• С034-маркер

-<: ~<1 Моноклональное антитело к CD34 ■fc Железосодержащие микрошарики

Рис. 1. Схема иммуномагнитной сепарации ГСК

33

Однако, несмотря на значительные успехи в этой области, существует ряд серьезных проблем, которые в настоящее время невозможно решить окончательно. Среди причин, вызывающих высокую смертность и тяжелую инфекционную патологию, после трансплантации на первое место выходят вирусные и грибковые инфекции, а также реакция "трансплантат против хозяина" (РТПХ). Последняя связана с техническими проблемами получения "чистой" популяции ГСК из-за относительной малочисленности ГСК (0,01% от всех клеток костного мозга) в пунктате костного мозга.

Особое значение приобретает "загрязненность" препарата ГСК Т-лимфо-цитами. Именно совокупность этих клеток является основной контроли­рующей системой иммунологического надзора за антигенным постоянством клеток организма. На поверхности практически любых клеток организма экспрессированы так называемые антигены гистосовместимости, которые распознаются собственными Т-клетками как "свои" и потому игнорируются ими [26]. Вследствие этого чужеродные клетки, различающиеся по антигенам! гистосовместимости (HLA-система), введенные в организм реципиента, будут, безусловно, уничтожаться иммунной системой хозяина при активном участии | Т-клеток.

Как правило, для проведения трансплантации костного мозга тщательно подбирают донора по совместимости HLA-антигенов с реципиентом и, кроме I того, проводят миелоаблативную или иммуносупрессорную терапию,! заключающуюся в уничтожении клеток костного мозга химиопрепаратами или иммунодепрессантами [27]. Однако в этом случае часто происходит 1 инверсия направленности иммунологического конфликта: Т-клетки донора, | "загрязняющие" препарат стволовых клеток костного мозга, проявляют■ агрессию против клеток реципиента, что приводит к тяжелой патологии в j виде РТПХ, заканчивающейся в большинстве случаев летально. РТПХ1 представляет собой серьезное препятствие для клеточной терапии миело- и I лимфопролиферативных заболеваний препаратами аллогенного костного мозга ] [28]. Несомненно, что наилучшим способом борьбы с РТПХ является удаление I из донорского костного мозга всех зрелых Т-клеток. Методы очистки ГСК.

Именно с разработкой методов получения препаративных количеств чистых ГСК связывают большие надежды в области эффективной транспланта- 1 ционной клеточной терапии. Клинические испытания трансплантации ГСК, I лишенных Т-клеток, включали разнообразные методы клеточных манипуля- I ций ex vivo на протяжении последних 20 лет [29]. В ранних испытаниях I применяли такие методы, как Е-розеткообразование (розетки Т-клеток с I эритроцитами барана), агглютинация Т-лимфоцитов с SBA (агглютинин сои) 1 и противоточная элютриация. Однако два первых метода оказались I неприемлемы из-за использования растительного белка (SBA) и бараньих I эритроцитов, а третий метод оказался технически малопригодным (большие потери CD34⁺-KneTOK, неполное удаление Т-лимфоцитов, трудности со J стерилизацией оборудования, довольно длительная процедура выделения).

Новые методы были разработаны на основе иммуномагнитной сепарации 1 клеток. Сущность этих методов заключается в том, что моноклональные 1

■

32

Появдение коммерческих технологий иммуномагнитной сепарации CD34⁺-kji₆,

ток позволило начать клинические испытания использования очищенных ГСк

при аутологичных и аллогенных трансплантациях. Особенно впечатляющ^

результаты получены при использовании ГСК у больных аутоиммунны^

заболеваниями, такими, как множественный склероз, системный склероз

ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, системная красная

волчанка, дерматомиозиты и тромбоцитопеническая пурпура [37]. Анализ

данных по лечению 390 больных, проведенному в Европе, Азии, Северной

Америке и Австралии, показал, что значительное клиническое улучшение

наблюдалось у двух третей пациентов по всем категориям болезней с большей

тенденцией к улучшению при ревматоидном артрите и ювенильноад

идиопатическом артрите. Однако лечение было ассоциировано со значительной

посттрансплантационной заболеваемостью, а также смертностью, частички

связанной с процедурой мобилизации ГСК из костного мозга (1,5%), и общей

процедурой трансплантации (9%) [38].

Несомненно, трансплантация ГСК при аутоиммунных заболеваниях возродила новые надежды и перспективы, но также подняла ряд вопросов, на которые пока нет ответа [39]. Перевешивает ли польза от появлении аутотолерантности и снижения РТПХ после удаления Т-клеток из клеточног! трансплантата ГСК возрастающий риск появления инфекций? Можно ли предсказать, у какого больного возникнут осложнения после трансплантации ГСК? Каков механизм посттрансплантационной ремиссии?

ГСК периферической крови: проблемы мобилизации из костного мозга. 1 Одним из самых обещающих методов использования ГСК для клеточной терапии является мобилизация, под которой понимают клинический процес! искусственно вызванного выброса ГСК и предшественников из костного мозга! в периферическую кровь с помощью химических агентов и цитокинов. Этот! процесс имитирует усиление физиологического выброса ГСК из костномозго­вого резервуара в ответ на стрессовые сигналы и во время тканевого поражения и воспаления.

В настоящее время мобилизованные клетки периферической крови рас-1 сматриваются как предпочтительный и главный источник ГСК, предназнаЯ ченных для аутологичных и аллогенных трансплантаций. Их применение приводит к более быстрому приживлению трансплантата и сниженикя процедурных рисков по сравнению с использованием костномозговых трансплантатов.

Мобилизация инициируется стресс-индуцированной активацией нейтрофи-1 лов и остеокластов в процессе химиотерапии и повторной стимуляцией! цитокинами, такими, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор! (G-CSF), в результате чего происходят высвобождение фактора стволовых! клеток (SCF), связанного с мембранами, пролиферация ГСК и предшествен-1 ников, а также активация и/или деградация адгезивных молекул, таких, как! VLA-4 и Р/Е селектины. Главные события, обеспечивающие отмену удержания I ГСК в костномозговой нише, включают секрецию, а затем инактивацию I хемокинов (SDF-1/CXCL12 и IL-8/CXCL8) протеолитическими энзимами,» такими, как эластаза, катепсин G, протеиназа 3, CD26 и различные матриксныеЯ

_I

_таЛлопротеиназы. Множественные стресс-сигналы возникают, например,

время воспаления и тканевого повреждения. Как следствие возникает лейкоцитоз, включающий повышенный уровень ранних предшественников с фенотипом CD34⁺/CD38⁺, обусловленный выбросом клеток из костного мозга. д_тот выброс индуцируется в клинике и в экспериментальных моделях на животных широким спектром молекул и процедур: повреждение ДНК, химиотерапевтические препараты, такие, как циклофосфамид, комбинация яфосфамида, карбоплатина и этопозида, цитокины (G-CSF, GM-CSF, SCF, flt-3 ligand) и хемокины (IL-8, Mip-lp\ Grooc, SDF-1) [40].

G-CSF, наиболее часто применяемый иммобилизационный агент, обычно назначается ежедневно в дозе 5—10 мкг/кг в течение 5—10 дней самостоятельно _или после химиотерапии. Однако у значительного количества больных, особенно подвергающихся экстенсивной химиотерапии, приводящей к аплазии костного мозга, пожилых пациентов и части здоровых людей отличается плохая мобилизация ГСК [41]. Кроме того, некоторым больным для успешной мобилизации необходимо приостановить введение лекарства во время мобилизационного процесса и добавить SCF к G-CSF [42]. Однако SCF может вызывать побочный эффект в виде аллергических реакций, поскольку помимо мобилизации СБ34-клеток он активирует тучные клетки.

Пластичность ГСК: эксперименты "за" и "против".

Наиболее впечатляющим свойством ГСК, с которым связывают заман­чивые перспективы клеточной репаративной терапии, без сомнения, является пластичность ГСК, т. е. способность превращаться в другие типы клеток при соответствующих условиях [43]. Так, в экспериментах на грызунах была показана способность ГСК дифференцироваться в скелетные мышцы, кар-диомиоциты, нейроны, клетки печени, клетки эндотелия и эпителия [44—48]. Однако вскоре появились работы, не подтвердившие эти данные. Так, недавно в журнале "Nature" был опубликован ряд статей различных групп авторов, в которых приведены данные, отрицающие превращение ГСК в клетки сердеч­ной мышцы в модельных опытах инфаркта миокарда [49,50]. Более того, было доказано, что ГСК не участвуют в репарации некротизированной ткани, а подвергаются дифференцировке, сходной с обычным гемопоэтическим процессом, протекающим в костном мозге. Однако было также показано, что при экспериментальной модели инфаркта миокарда наблюдается трансдиф-ференцировка ГСК в предшественники эндотелиоцитов в сердечной мышце [51, 52]. Таким образом, вопрос о трансдифференцировке ГСК остается открытым.

ХоумингГСК.

Возникшее противоречие, возможно, снимается благодаря исследованиям Молекулярных механизмов хоуминга ГСК. Установлено, что введение хемокина SDF-1 в экспериментально ишимизированные участки сердца, мышцы конечности или головного мозга приводит к интенсивной миграции ГСК в зону повреждения, после чего последние дифференцируются в клетки тканевого микроокружения [53,54].

Изучаются и другие молекулы, образующиеся в месте повреждения и привлекающие ГСК. Перспективное направление в клеточной терапии ГСК—

35

это использование факторов, мобилизующих ГСК из костного мозга. К таки^ факторам относятся колониестимулирующие цитокины типа G-CSF и G]yr, CSF. Российские ученые интенсивно изучают возможность вовлечения я репарационный процесс собственных ГСК больного, например при инфаркте миокарда, путем стимуляции их выброса из костного мозга. Они считают, чти механизм мобилизационного действия G-CSF связан с тем, что он является функциональным антагонистом SDF-1, т. е. приводит к разобщению это™ хемокина с рецептором CXCR-4 на поверхности ГСК и, следовательно,» высвобождению ГСК из костного мозга [55]. Терапевтическое применение CD34⁺ ГСК.

Появление коммерческих технологий иммуномагнитной сепарации CD34⁺ клеток позволило начать клинические испытания очищенных ГСК при аутологичных и аллогенных трансплантациях. Особенно впечатляющие результаты получены при использовании таких клеток у больных аутоиммунш ными заболеваниями, такими, как множественный склероз, системный склерозе ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, системная красная волчанка, дерматомиозиты и тромбоцитопеническая пурпура [56].

С помощью этой новейшей технологии удалось существенно снизить число осложнений в виде РТПХ у больных лейкозом. Однако возникла новая проблема. У больных, которым проводили трансплантацию очищенных ГСКв чаще стали возникать осложнения в виде оппортунистических вирусным инфекций, в том числе вызываемых цитомегаловирусом, в результате возникшей иммунодепрессии.

Сопоставляя эти два факта, можно заключить, что введение чистош популяции ГСК в организм приводит к системной иммуносупрессии, которая в первом случае вызывает механизм аутотолерантности, а во втором—снижение! противоинфекционной резистентности. Иммуносупрессорная активность ГСК.

Первое упоминание о причастности ГСК и ранних предшественником

гемопоэза к натуральной (неспецифической) иммунной супрессии появилось!

в литературе в конце 80-х годов [57]. В течение последующего десятилетия!

было доказано, что натуральные супрессорные (NS) клетки костного мозга I

имеют фенотип CD34⁺ [58—63]. Было установлено, что CD34⁺NS-ioieTKH I

являются незрелыми клетками с отсутствием дифференцировочных маркеров I

Т-, В-лимфоцитов и макрофагов и обнаруживаются в больших количествах в I

костном мозге и селезенке при возникновении опухоли, а также после 1

тотальной гамма-иррадиации или обработки циклофосфамидом. Другой их!

отличительной особенностью является способность агглютинировать в!

присутствии лектинов WGA и SBA. Эти клетки также несут на поверхности I

общий рецептор для IL-3 и GM-CSF. Большая часть NS-клеток костного мозга I

имела фенотип С034⁺Тпу1-ЬЗМ4"Гуг2"Мас1,2,3^-асиалоОМ~, но небольшая I

часть клеток несла дополнительно СОЗЗ-маркер. Эти клетки не прилипали к I

пластику, имели плавучую плотность 1,063—1,075 г/мл. Для CD34⁺ NS-клеток I

были характерны выраженное ингибирование функциональной активности CTL I

и NK-клеток, подавление эффекторных функций моноцитов и дендритных I

клеток, изменение состава секретируемых цитокинов в Тп-клетках, 1

36

лнпбирование антителообразования, подавление пролиферации опухолевых ^яеток и контроль дифференцировки в костном мозге. Более детальное яссмотрение работ, выполненных по CD34⁺ NS-клеткам, можно найти в литературе [64,65].

В Казахстане исследования натуральной супрессии были начаты в Институте молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина (лаборатория молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии, заведующий профессор Н. Н. Беляев) около 20 лет назад и продолжаются в настоящее время. По данному направлению за этот период были выполнены исследования в рамках шести научных тем, опубликованы 52 работы, включая 12 в дальнем зарубежье, и защищены одна докторская и три кандидатские диссертации.

Исследования феномена натуральной костномозговой супрессии начались _с изучения механизмов регуляции NS-клеток костного мозга негативными сигналами, исходящими из другой популяции костномозговых NS-клеток, названных нами контрсупрессорами. Путем изопикнического центрифуги­рования клеток костного мозга линейных мышей на градиентах плотностей перколла было получено шесть фракций со следующими плавучими плотностями: Фр. 1 = 1,033, Фр. 2 = 1,060, Фр. 3 = 1,076, Фр. 4 = 1,090, Фр. 5 = 1,10, Фр. 6 = 1,13 г/мл [66, 67]. Оказалось, что Фр. 4 содержала как супрессорные, так и контрсупрессорные клетки [68—70].

Позднее популяцию регуляторных клеток нам удалось выделить с помощью аффинного сорбента на основе гистамина и индуцировать гистамином продукцию специфического фактора, угнетающего активность NS-клеток [71— 72]. Нами было высказано предположение, что в костном мозге существует система регуляции активности NS-клеток, в которой позитивные сигналы представлены IL-3 и GM-CSF, а негативные—неким неизвестным фактором, индуцируемым эндогенным гистамином [73]. Исходя из этих и литературных данных, мы предположили, что DL-2- и гистаминактивируемые NS-клетки могут являться контрсупрессорами для обнаруженных ранее IL-3- и (или) GM-CSF-стимулируемых популяций NS-клеток.

Более детальный анализ супрессорной функции различных фракций и суб­фракций костного мозга показал, что наибольшей продукцией супрессорных факторов, индуцированной цитокинами (IL-2, IFNy, IL-3, GM-CSF), обладала Фр. 4. Используя метод проточной цитофлуориметрии, мы провели фенотипи-рование Фр. 4 на наличие дифференцировочных CD-маркеров (CD3—Т-клет-ки, CD 19—В-клетки, CD lip—моноциты, CD34—гемопоэтические стволовые клетки) [64]. Оказалось, что на мембране клеток Фр. 4 отсутствовали маркеры зрелых дифференцированных лимфоидных и миелоидных клеток, в то время как большинство клеток (73,5±2,8%) имели маркер ГСК и ранних пред­шественников (CD34⁺).

В связи с предполагаемой клеточной гетерогенностью Фр. 4 мы разделили ее на отдельные субфракции, обозначенные нами как NS1, NS2 и NS3, с Плавучими плотностями р,=1,08, р₂=1,090 и 1,09<р₃<1, Юг/мл соответственно. Фракции отличались друг от друга по продукции супрессорных факторов в ответ на воздействие различных индукторов [74] (рис. 2).

37

□ н/с ■ IL- 2 ■ I FNg а Гистамин ■ IL- 3 ■ GM- CSF

35 . :

30 ■ i f^^T;i т

_{fill HIj}

.5. NS1 T NS2 NS3

^{-10 i — -* I I}

Рис. 2. Спонтанная (н/с) и индуцированная (IL-2, IL-3, IFNy, GM-CSF, гистамин)

супрессорная активность NS1-, NS2- и ШЗ-субфракций.

По оси ординат: ИС — индекс супрессии пролиферации миеломных клеток линии PAI

в МТТ-тесте

Так, NS1 отвечала на IL-2, IFNr и гистамин, и не реагировала на IL-3 и I GM-CSF. NS2 отвечала лишь на IL-3 и GM-CSF, а NS3 - только на IL-2 и I GM-CSF. Ни одна из полученных фракций не показала спонтанной NS- ] активности.

Для более детального анализа маркеров ГСК на трех полученных I субфракциях мы использовали пару моноклональных антител, меченных двумя I различными флуоресцентными метками, одним из которых являлось антитело ] к CD34, а второе выявляло один из дополнительных маркеров ГСК (CD 117 — 1 рецептор фактора стволовых клеток SCF, CD133 — маркер плюрипотентных ] HSC, СГЗ123—рецептор к DL-3, CD135—рецептор к ростовому факторуранних промоноцитов, В-клеток и ГСК) (рис. 3).

Из рис. 3 видно, что как NS 1-фракция, так и NS3 состояла преимущественно из CD34⁺CD117⁺-клеток (рис. 3, Аи И). Однако если NS1 содержала в своем составе еще и CD34⁺CD133⁺-K/ieTKH (21,7%), то №3-фракция — нет (рис. 3, Б I и К). Таким образом, NS 1-фракция является более гетерогенной популяцией по составу стволовых маркеров, чем №3-фракция, хотя общей чертой этих двух фракций является отсутствие на них CD135. Это говорит о том, что клетки NS Г и №3-фракций являются гемопоэтическими стволовыми клетками или очень ранними предшественниками.

Иную картину в отношении CD 135 (Flk2/Flt3)-MapKepa показала NS2-фракция, которая на 74,6% состояла из CD34⁺CD135⁺-ioieTOK, на 46% — из клеток CD34⁺CD123⁺ и не имела в своем составе ни CD 117⁺-, ни CD 133⁺-клеток. 38

А Д И

Б_ Е ^СР117 К ,

-д. -Ш —mm тш ■,. .м-. Hill ада.»—,, т* .i.--. ■ |у | ™— I I ii-ii....— i. ,,J. -w ■ " ■ ■■ ■ J '" ■ ' ' ' '

I^:;.1к^ ^:::WL ^:: ж,

» Vfo ' ' '""■&•>'' • "^L'tV ' tV " ' " "'J5» ' Vk* Yiy ' 10- ' " '' '" th ' " tb' *'<>■ ' "" '""iV

В _ж CD 133 д ^

mjr* aav. Ж**т. | -шоч* 1 ?ш; fti*

s ^W1- Щ] ~_..З^Я^_ ~1ж.

■,'■„,.-„'" ^17'jfel7,! 1"" IZ," "™!?I" ' \"',~V^, *,?„, Utt' IP' «У W" ""'""'«»' ''',','_„ "

г з ^CP12Э м

CD 135

Рис. 3. Фенотипический анализ субфракций NS1, NS2 и NS3, полученных из Фр. 4

костного мозга мышей линии СВА. А—Г — фенотипические характеристики клеток

NSl-фракции; Д—3 — фенотипические характеристики Ш2-фракции;

И—М — фенотипические характеристики клеток ИЗЗ-фракции

Наличие только одного маркера мультипотентных гемопоэтических предшественников—CD34, а также присутствие на плазматической мембране таких рецепторов, как CD 135 и CD 123, свидетельствует о том, что эта фракция скорее всего состоит из ранних предшественников миеломоноцитарного ряда (вероятно, CFU-GM).

Принадлежность изучаемых нами NS-клеток к мультипотентным и унипо-тентным ГСК мы подтвердили по отсутствию маркеров коммитированных пред­шественников, локализованных в костном мозге (CD 10, IL-7R, TER-119 и CD33).

Таким образом, нам удалось выделить из костного мозга три фракции мышиных NS-клеток с плавучими плотностями 1,080 (NS1), 1,090 (NS2) и > 1,090 (NS3) г/мл, различающихся по чувствительности к известным индукторам (NS1 - к IL-2, IFN и гистамину; NS2 - к IL-3 и GM-CSF; NS3 - к IL-2 и GM-CSF). Все фракции NS-клеток имели фенотип ГСК (LhrCD34⁺) и различались

39

по степени зрелости (NS1 - CD117⁺CD133⁺, NS3 - CD117⁺, NS2 М CD123⁺CD135⁺CD33⁺).

Далее мы попытались охарактеризовать спектр факторов трех субфракций ГСК, опосредующих различные иммуносупрессорные эффекты, индуцируемые цитокинами и гастамином [75].

Исследование наличия TGFP в культуральном супернатанте субпопуляций NS-клеток проводили с помощью нейтрализации его биологической актив-) ности поликлональными антителами против мышиного TGF-p. Обработанный I антителами супернатант анализировался на наличие антипролиферативной активности.

Оказалось, что вся антипролиферативная активность, индуцированная каш IL-2, так и гастамином, в клетках NS 1-фракции была связана исключительно ! с TGFp. При действии IL-3 NS2-KfieTKH также секретировали только TGFp. I NS3-mieTKH, стимулированные IL-2, секретировали помимо TGFp какие-тоЯ другие супрессорные факторы.

Иммуноферментный анализ продуктов, секретируемых каждой фракцией ГСК (табл. 2), показал, что при воздействии IL-2 или гистамина на клетки 1 NS1 -фракции секретировался лишь TGFp.

Таблица 2 1 Продукция цитокинов различными фракциями NS/ГСК

под воздействием ряда индукторов Фракции Индукторы Концентрация супрессорных факторов

TGF0, IL-6 IL-10 IL-13 Нитриты/нитраты

(пкг/мл) (пкг/мл) (пкг/мл) (пкг/мл) (мкМ/мл)

NS1 Н/с <15 <3 <13 <15 6,8±0,3

IL-2 1499,3±32,9 <3 <13 <1,5 16,2±1,3

Гистамин 906,6±15,7 <3 <13 <1,5 21,1±1,8 I

NS2 Н/с <15 <3 <13 <1,5 <3

IL-3 1259,0±32,2 <3 <13 <1,5 27,3±1,7

NS3 Н/с <15 <3 <13 <1,5 5,3±0,4

IL-2 458,8±25,7 264,8±22,7 <13 324,1±8,2 10,2±0,4

Кроме того, также были выявлены продукты метаболизма NO (нитриты и нитраты), определяемые с помощью реакции Грисса, что свидетельствует о стимуляции продукции N0. При стимуляции №2-клеток IL-3 также секрета- 1 ровался только TGFp. Кроме того, клетки одновременно секретировали боль­шое количество N0. Анализ IL-2-зависимой продукции супрессорных фак- I торов №3-клетками выявил, что помимо TGFp клетки секретировали IL-6 и ] IL-13, а также генерировали оксид азота.

Для оценки роли обнаруженных потенциальных супрессорных факторов в

— _еГудяции активности NK-клеток и CTL, а также в Th 1 /Тп2-переключении

мы провели нейтрализационный анализ, используя соответствующие тест-$ _сцстемы культивируемых клеток ex vivo и антитела к TGFp, IL-10, IL-13 и IL-6, ie _а также L-N-иминоэтил-гидрохлорид (L-NIL) в качестве ингибитора индуци-

бильной NO-синтазы (iNOS). й В случае, когда использование антител или L-NIL в отдельности не приво-

|- ддао к полной отмене действия супрессорных факторов, проводили совместное й _в0здействие и антителами, и L-NIL [64]. й Важнейшими эффекторными клетками противоопухолевого иммунитета

считаются натуральные киллерные (NK) клетки и цитотоксические < х-лимфоциты (CTL). Мы получили популяции NK-клеток и CTL (из суспензии з спленоцитов мышей линии СВ А с помощью иммуномагнитной сепарации) и

воздействовали на них супернатантами клеточных культур трех NS-фракций, ) стимулированных соответствующими индукторами. Обработанные таким

образом киллерные клетки испытывали в цитотоксическом тесте, используя i в качестве мишеней клетки человеческой эритролейкемии К-562 и мышиной

i мастоцитомы Р815.

Кроме того, мы провели исследование влияния секретируемых NS/ГСК-фак-

1 торов на продукцию цитокинов 1-го и 2-го типов CD4⁺ Т-клетками, выделенными из мононуклеарной фракции клеток селезенки мышей линии СВА с помощью иммуномагнитной сепарации. Количество клеток, содер­жащих IFNy (1-й тип цитокинов) или IL-4 (2-й тип цитокинов), определяли с помощью проточной цитофлуориметрии, используя моноклональные антитела к данным цитокинам, меченные различными флуорохромами. Как известно, соотношение Т-хелперов Thl/Th2 очень важно для регуляции фаз иммунного ответа. По литературным данным, при опухолевом процессе это соотношение

I сдвигается в сторону уменьшения активности ТЫ- и усиления Тп2-клеток. Оказалось, что применяемые индукторы вызывают продукцию NS-клетками факторов, существенно снижающих цитолитическую активность NK и CTL, а также вызывают в NS/ГСК продукцию факторов, снижающих в Т-хелперах уровень IFNy и повышающих уровень IL-4, т. е. осуществляют иммунологический свитчинг в сторону образования Тп2-клеток. Причем супрессорньш эффект NS 1-клеток на CTL и NK-клетки был связан полностью с продукцией TGFp. ТЫ/ГМ-переключение, вызываемое продуктами NS1-клеток, также зависело от TGFp. NO усиливало этот процесс. Супрессорные и регуляторные эффекты супернатантов №2-клеток, стимулированных IL-3, были связаны исключительно с присутствием в них TGFp и N0, причем в большей степени—TGFp. Очевидно, это связано с высоким уровнем продукции TGFp клетками №2-фракции. Анализ роли различных цитокинов и N0, продуцируемых №3-клетками в ответ на воздействие IL-2, в опосредовании супрессорных эффектов показал, что в угнетении цитолитической активности NK-клеток участвуют TGFp, IL-6 и IL-13. Торможение CTL-активности было связано только с TGFP и N0. Ни IL-6, ни IL-13 в выделяемых NS3-ioieTKaMH Количествах никак не влияли на цитолитическую активность CTL. Проведенные нами эксперименты позволили утверждать, что ГСК и ранние Предшественники костного мозга обладают индуцибельной натуральной

иммуносупрессорной активностью, включающей торможение пролиферации I лимфоидных клеток, торможение цитолитической активности NK-клеток и I CTL, а также переключение в Т-хелперных клетках продукции цитокинов с I Th 1-типа на Тгг2-тип. Иммуносупрессорная активность ГСК, индуцированная I IL-2 и гистамином (NS1), IL-3 (NS2) или IL-2 (NS3), осуществляется через! продукцию супрессорных цитокинов (TGF(3, IL-6 и IL-13) и оксида азота. Роль I каждой фракции NS/TCK в естественной регуляции иммунной системы при различных патологических состояниях предстоит выяснить. Но уже сейчас I можно предположить, что появление в кровотоке больших количеств ГСК, I мобилизованных из костного мозга, должно сопровождаться системной I иммуносупрессией. Возможно, именно этим объясняется повышение частоты I возникновения оппортунистических инфекционных процессов послеЯ аллогенных и аутологичных трансплантаций ГСК.

К обоснованию клеточно-мобилизационной терапии хирургически» болезней.

Обнаружение феномена пластичности у ГСК, заключающегося в способ-И ности этих клеток дифференцироваться в типы клеток, не связанные с! миелолимфоидным фенотипом, инициировало взрыв исследовательского^ интереса к возможности восстановления поврежденных патологическими процессом или травмой тканей жизненно важных органов, таких, как сердцеД печень, легкие. Ряд экспериментальных работ, проведенных на животных"] доказавших несомненность регенерационного потенциала ГСК, выделенных I из костного мозга или мобилизованных из него с помощью колониестимули-И рующих факторов, привел к появлению новой концепции восстановительной I терапии поврежденных тканей, в основе которой лежит принцип соблюдения I естественных механизмов клеточной репарации. Предполагаемый механизм заключается в том, что любая гибель клеток, связанная с травмой (в том числе хирургической) или патологическим процессом, включая инфекционное и, неинфекционное воспаление, инфаркт (например, вызванный ишемией),' инсульт и т.п., приводит к выделению в кровь из очага тканевого повреждения ряда факторов, обладающих мобилизующими свойствами в отношении ГСК костного мозга. ГСК покидают свою естественную нишу в костном мозге и перемещаются с кровотоком в область повреждения за счет хоуминга (направ-ленного перемещения), обусловленного рядом факторов, образующихся в поврежденном участке, в частности SDF-1, к которому на ГСК имеются рецеп-торы. В результате в очаге повреждения скапливаются ГСК, которые осу- •! ществляют репарацию поврежденной ткани. На сегодняшний день существуют три гипотезы, объясняющие данный процесс: 1) трансдифференцировка ГСК в несвойственный для этих клеток, обитающих в костном мозге, фенотип I (кардиомиоциты, эндотелиоциты, гепатоциты, нервные клетки и др.); 2) слияние I с неповрежденными клетками с последующим делением и образованием новой I ткани; 3) дифференцировка малочисленных особых субпопуляций ГСК/пред- I шественников, уже коммитированных в костном мозге в сторону образования I зрелых клеток, присущих поврежденной ткани. В любом случае эксперимен-1 тальные находки нуждаются в подтверждении и, самое главное, в доказательстве I существования феномена естественной клеточной репарации у человека.

r настоящее время репаративный эффект ГСК у человека пытаются полу­ют, путем использования нескольких методических подходов: 1) аутологичные ддлогенные трансплантации костного мозга и ГСК, выделенных из него; 91 аллогенные трансплантации ГСК, выделенных из пуповинной крови; т.) аутологичные трансплантации ГСК, выделенных из собственной перифери­ческой крови после лейкофереза, и 4) мобилизация собственных ГСК из костного мозга путем введения рекомбинантных препаратов колониести-мулирующих факторов G-CSF и GM-CSF.

Нас заинтересовал метод мобилизации собственных ГСК в связи с возмож­ностью влиять на процессы тканевой репарации после проведения обширных хирУР^{гических} операций. Наиболее часто для мобилизации ГСК из костного мозга используют нейпоген, или филграстим, рекомбинантный G-CSF, применяемый в онкологии для восстановления нормального кроветворения после химиотерапии. Препарат зарегистрирован в Казахстане, хорошо переносится пациентами, вызывая десятикратное повышение ГСК в циркулирующей крови.

По современным представлениям, скорость заживления хирургических ран зависит от регенерационных способностей стволовых кроветворных клеток у конкретного больного и может регулироваться введением специальных фак­торов. Однако до сих пор неизвестны роль и степень участия полипотентных гемопоэтических стволовых клеток в процессах репарации оперируемых органов и тканей. Как правило, оперируемые органы содержат зоны тканевого некроза, вносящего существенный вклад в формирование органной недостаточности, т. е. нуждаются в клеточной регенерации.

С другой стороны, известно, что операционный стресс приводит к угнетению в послеоперационном периоде иммунитета (вторичное иммунодефицитное состояние), что, в свою очередь, может вызывать тяжелые гнойно-воспа­лительные осложнения. При этом важное значение имеют характер патологии и объем хирургического лечения, степень тяжести интраоперационной травмы (время операции, объем кровопотери, болевой синдром и т.д.), возраст больного, состояние иммунитета до операции. Ситуация осложняется тем, что у хирургических больных, как правило, иммунная система находится уже в состоянии угнетения, вызванного длительностью органного заболевания. Считается, что первостепенное значение в возникновении послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений принадлежит иммунобиологическим Факторам, на 70% определяющим исход хирургического лечения.

Современный подход к проблеме повышения уровня иммунологической Реактивности у больного перед операцией заключается в использовании иммуностимулятора "интерлейкин-2" (IL-2), в качестве которого используют Рекомбинантный IL-2 (российский препарат "ронколейкин", зарегистриро-^ванный в Казахстане). В настоящее время ронколейкин входит в список Жизненно важных лекарственных средств в РК и хорошо зарекомендовал себя ^в Качестве мощного иммуностимулирующего средства, восстанавливающего Иммунную систему, угнетенную инфекционным процессом, в том числе при ^0стрых и хронических септических состояниях [76].

Таким образом, к настоящему моменту сложились теоретические и

43

экспериментально-клинические предпосылки для направленного воздействия на систему стволовых клеток костного мозга и иммунитет с целью осуществления тканевой и органной репарации при использовании достижений генной инженерии—препаратов рекомбинантных цитокинов.

Принципиальная схема событий, возникающих при операционном стресс™ с участием ГСК, и путей фармакологической коррекции репаративного процесса и иммунного статуса представлена на рис. 4.

В области оперативного вмешательства высвобождаются факторы хоуминга, в частности хемокин SDF-1, которые вызывают специфическую хемоаттракцию ГСК, перманентно циркулирующих в крови. Введение филграстима будет усиливать мобилизацию ГСК из костного мозга и тем самым повышать уровень ГСК, прибывающих в зону тканевого повреждения. Под влиянием неизвестного процесса ГСК трансформируются в клетки поврежв денной ткани. Одновременно ГСК ингибируют любую иммунологическую активность иммунокомпетентных клеток, оказавшихся в раневой зоне. Этим самым ограничивается воспалительный процесс, который объективно препят-И ствует репарации ткани. Повышенное содержание ГСК с натуральной супрес- j сорной активностью в циркуляции может приводить к системному сдвигу иммунного равновесия в сторону Тп2-типа, что объективно будет способствоЯ вать развитию инфекционного процесса. С целью коррекции иммунного статуса необходимо вводить стимулятор иммунитета—IL-2 в виде фармакологического препарата "ронколейкин".

_■

-j /\ I

jj/iej^ Иммунная систем л к Стимуляция] Ронколейкин 4f ^^И/овтс^пердтивногоЛ

****** ^^Ч I

Филграстим L ZZ|j>- Щ Ш Г

^^^ Мобила***^ I

I _ I

Рис. 4. Схема клеточно-мобилизационной цитокинотерапии хирургических осложнений

44

Таким образом, проблема иммунной и органной недостаточности у

ургических больных в совокупности с проблемой постхирургических

сложнений диктует необходимость разработки новых подходов лечения и

₀ф_Илактики, основанных на новейших иммунобиологических технологиях,

частности использовании эндогенных стволовых клеток и экзогенных

цитокинов.

Мы поставили цель изучить участие ГСК и факторов, регулирующих их активность, а также состояние иммунной системы в ходе восстановительного процесса после хирургической операции.

Оценка уровня основных субпопуляций клеток иммунной системы.

Исследовали две группы больных: опытная группа (10 человек) — больные, подвергшиеся аортокоронарному шунтированию, контрольная группа (17 че­ловек) —больные, подвергшиеся стентированию коронарных сосудов в отделе­нии кардиохирургии Научного центра хирургии им. А. Н. Сызганова МЗ РК.

Исследовали иммун­ ный статус больных до и ~Т"Ж

операции а После операции D В момент выписки |

после хирургического _м

вмешательства в различ- ₈₀. ные сроки, оценивая ■• то ^ш~ субпопуляционный сое- | ⁶⁰ ■ I ■_ тав иммунокомпетент­ ных клеток по CD-мар- f зо - I m -I керам, а также продеку- ° го - I

циюцитокинов. ю-1 ИЦП BLn i

Результаты оценки ° ' ^^

■* ^М CD3 CD4 CD8 CD19 CD16/56

уровня основных попу- I

ляций иммунокомпе­ тентных клеток в кон­ трольной и опытной __=и=_₌₌_₌_₌__₌_₌₌₌₌₌_₌₌_₌₌___₁

Группах ПреДСТаВЛеНЫ На ]'Д° операции в После операции а В момент выписки]

рис. 5 (а и б). ₈₀ —

Как видно из 70 ^^~~

рж. 5, а, процедура стен- ^ во- I иГ

тирования не повлияла | ⁵⁰" I

на существенное измене- |⁴⁰ I

ние популяционного | ³⁰ "

состава периферической ° ²⁰" Шй _ш

крови. Снижение сред- ¹⁰ Щ~\

НИХ ДаННЫХ ПО В-ЛИМфО- _{CD3 C}04 CD8 CD19 CD16/56

Цитам (CD19) и NK-клет- I 1

кам (CD 16/56) в первые _б

сутки после процедуры

было незначимо Не- *^>ис- '• Содержание основных популяций

СКОЛЬКО иная каотина иммунокомпетентных клеток в периферической крови у

Наблюдалась В ОПЫТНОЙ больных с ИБС до и после операции стентирования (а)

группе (рис. 5, б). В этом ^или аортокоронарного шунтирования (б)

_I

случае наблюдалось достоверное снижение (Р= 0,048) количества цитотоксц. ческих СВ8⁺-клеток к моменту выписки больных из стационара (8-й — 1(Ц день). Изменение остальных показателей были незначимо.

Оценка уровня CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток.

Наибольший интерес представляла динамика изменения уровня циркули J рующих ГСК в крови после операции. На рис. 6 представлены данные такого анализа при сравнении опытной и контрольной групп, принципиально различающихся объемом хирургического вмешательства.

Как видно из рис. 6, исходное содержание ГСК в обеих группах былся одинаковым. Стентирование никак не влияло на изменение этого уровня (увеличение средних значений в два раза сразу после процедуры стентирования I незначимо). В опытной группе наблюдалось достоверное увеличение количества циркулирующих ГСК в 3,2 раза (по средним цифрам).

Оценка уровня цитокинов в сыворотке крови.

Для того чтобы получить как можно более полное представление о возможя ном иммунорегуляторном дисбалансе, мы оценивали несколько групп цитокинов.

Группа провоспалительных цитокинов. Мы оценивали содержание IL-1р и TNFa как основных медиаторов иммунного воспаления (рис. 7,8).

Анализ полученных данных показывает, что как в контрольной, так и я опытной группах отсутствует различие в содержании основных провоспали-1 тельных цитокинов до и после лечения.

Группа супрессорных цитокинов. Известно, что супрессорными по othoJ шению к врожденному и адаптивному иммунитетам являются интерлейкины 6 и 10, а также росттрансформирующий фактор "бета" (TGFp). Мы проанализи-1 ровали динамику изменения их уровней в обеих группах (рис. 9—11).

■ До операции и После операции □ В момент выписки

3 _ , . — . . .—.—,

% 2,5 -

о

1 (НН

Контроль Опыт

Рис. 6. Динамика содержания CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови у больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) I или аортокоронарного шунтирования (опыт)

80 т '

70-

5 |оВ момент выписки!

а х

IL-1 Р TNF а

Рис. 7. Уровень провоспалительных цитокинов (IL-lb, TNFa) в сыворотке крови больных с ИБС до и после стентирования

Как видно из рис. 9, уровень IL-6 значимо не менялся в ходе лечения у больных контрольной группы, тогда как в опытной группе наблюдалось достоверное снижение его повышенного уровня до нормы в первый день после операции и в момент выписки.

На рис. 10 показана динамика изменения уровня IL-10, из которой следует, что у больных контрольной группы IL-10 обнаруживается в следовых количествах и его уровень не меняется в процессе лечения. В опытной группе наблюдается достоверное (Р= 0,024) увеличение его уровня в 16,8 раза через

60 __ _ ., _ , __ _ _

50- _

= 40-

5 о9 момент выписки

_{t" I I 1}

_{"j ^И 1 И}

up тара

Рис. 8. Уровень провоспалительных цитокинов (IL-ip, TNFa) в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции аортокоронарного шунтирования

47

¹

20 -. 1

18-

16- |

| 1* " , j

<J H—j—J I I вДо операции

g 10- ■ После операции

В g DВ момент выписки

I е- I

о ИИ

Контроль Опыт

, , ~*~^ви

Рис. 9. Уровень IL-6 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

сутки после АКШ, а к моменту выписки снижается у части больных до исходного уровня. Этот факт можно расценить как проявление иммуносупрес-сорной тенденции, вызванной операционным стрессом.

Анализ содержания супрессорного цитокина TGF(3 в обоих группах не вьш явил никаких изменений его уровня в ходе хирургического лечения (рис. 11)Я

Активационные цитокины. Следующим цитокином, проанализированным нами, был IL-15, действие которого аналогично действию IL-2, однако ва

7

6 -5 -

i^4_ г i i 1

jf ИДо операции

Я 3- т ■ После операции

В D В момент выписки

О MBBHI 1 1 ■■■■■■■■ 1

Контроль Опыт

-1 -I ■—■ ■ ■—-— —■ ■

Рис. 10. Уровень IL-10 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

Г

1400 -, — ——

ох 800- ■ До операции

5 В После операции

а ⁶⁰⁰ ' DB момент выписки

«»■ И И 1

Контроль Опыт

Рис. 11. Уровень TGF|3 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

отличие от него IL-15 является более эффективным стимулятором NK-клеток, а следовательно, и противовирусного иммунитета (рис. 12).

Как видно из рис. 12, в контрольной группе средний уровень этого цитокина не менялся в ходе лечения, хотя высокая дисперсия свидетельствует о широком

120 -I ^ 1

100 - т Т _т

IS T"

=| И Я— I Т

I 60 - ■ I I ■ До операции

а. И— | ■ После операции

I D В момент выписки

? 40 - ' '

⁵ _I

20 -

_{I I}

0 -I—"^ 1—,—■^■^■в 1—

Контроль Опыт

Рис. 12. Уровень IL-15 в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

49

8 25 -

к "До операми

§■ " ■ После операции

£■ -1С . ОВмоментвыписки

5 -

_{Ш I}

о -I—^ии»-—i—,—^тшы—i—

Контроль Опыт

Рис. 13. Уровень G-CSF в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт)

варьировании этого показателя у индивидуальных больных. В опытной группе отмечалось снижение средней величины показателя в первые сутки после операции. Однако из-за высокого варьирования результатов различие это недостоверно.

80 -I 1

70 - у

₅ 60 - т

| Т 1 После операции

£■ on [XT ОВмоментвыписки

Контроль Опыт

Рис. 14. Уровень SCF в сыворотке крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт) 50

Стимуляторы ГСК. Далее мы исследовали содержание в крови гемопоэти-еских факторов, полагая, что их уровень отражает состояние гемопоэза и мобилизации гемопоэтических стволовых клеток. Данные по оценке уровня Q-CSF и SCF представлены на рис. 13 и 14 соответственно.

Как следует из рис. 13, в контрольной группе не было значимых изменений

уровне G-CSF в динамике лечения. В опытной же группе наблюдалось

существенное (Р = 0,044) повышение (в 2,6 раза) уровня этого цитокина в

первые сутки после операции. К моменту выписки его уровень снижался до

исходного состояния.

Результаты анализа содержания SCF (рис. 14) показали, что в обеих группах отмечалось широкое варьирование результатов, но статистически значимых изменений среднего уровня этого цитокина в ходе лечения обнаружено не было.

Оценка функциональной активности Т-клеток.

Для оценки функциональной активности Т-клеток мы использовали хорошо зарекомендовавший себя тест СопА-индуцированной пролиферации мононуклеарных клеток (рис. 15).

Как показал анализ, в контрольной группе пролиферативная активность Т-лимфоцитов не изменялась в ходе лечения. В опытной группе отмечалась тенденция к снижению этой активности в первые сутки после операции (Р = 0,061), что может свидетельствовать о снижении напряженности Т-кле-точной системы у большинства больных под действием операционного стресса.

В следующем эксперименте мы оценили продукцию цитокинов 1-го и 2-го типов Т-клетками под действием митогена СопА у больных обеих групп в ходе лечения (рис. 16).

■ До операми Я После операции D В момент выписки

250 1 ^ -|

Контроль Опыт

Рис. 15. Пролиферативная активность Т-клеток периферической крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования

(опыт)

51

■ До операции ■ После операции □ В момент выписки

900 -. "' -.

| 800 -£ 700 -^- 600 -

_{i::r ±k~i l Г]}

_{|S: ■ Щ^. I}

^{с ™ \ Ш I ш ,}

Контроль Опыт

Рис. 16. Продукция IFNy Т-клетками периферической крови больных с ИБС до и после операции стентирования (контроль) или аортокоронарного шунтирования (опыт) 1

Как видно из рис. 16, картина продукции цитокина 1-го типа похожа на картину пролиферативной активности Т-клеток. Хотя достоверных изменений в уровне продукции не наблюдается в обеих группах, динамика изменения пролиферативной активности в опытной группе высоко коррелирует с уровнем продукции IFNy, что может свидетельствовать о негативном влиянии операционного стресса на функциональную активность ТЫ-клеточного иммунитета.

Что касается продукции IL-4, цитокина 2-го типа, то его образование не было обнаружено ни в одном из образцов крови как в контрольной, так и Л опытной группах, что свидетельствует о том, что Тп2-тип реагирования не характерен для данных групп больных, а процедура стентирования и АКШ не влияют на его появление.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить следующие значимые изменения в иммунной системе, оцениваемой по периферической крови:

• Операционный стресс, вызванный АКШ, приводит к транзиторному сниШ жению содержания цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD8⁺.

• В этот же период в периферической крови больных группы АКШ отм&Я чается увеличение супрессорного цитокина IL-10 в 16,8 раза.

• Одновременно отмечается снижение пролиферативной активностйИ Т-клеток и продукции ими IFNy у части больных.

• Обнаруженные изменения свидетельствуют об иммунологической Т-клев точной недостаточности, индуцированной хирургической операцией.

• Хирургическая операция приводит к повышению уровня циркулирующими

₁

гемопоэтических клеток с фенотипом CD34⁺ в 3,2 раза к 8—10-му дню после операции. • На 2-е сутки после хирургической операции в крови происходит транзи-торное увеличение цитокина G-CSF - фактора мобилизации гемопоэти­ческих стволовых клеток из костного мозга.

Полученные нами данные подтверждают наше предположение о повышении мобилизации ГСК из костного мозга в кровь при хирургической операции при одновременном снижении напряженности иммунитета. Обращает на себя вни­мание тот факт, что повышение уровня мобилизационного фактора G-CSF наблюдалось в первый день после операции, а подъем уровня циркулирующих _гСК _ _к моменту выписки, когда уровень G-CSF снизился до исходного состояния. Считая, что уровни G-CSF и ГСК тесно связаны между собой и что подъем первого является причиной подъема второго, можно заключить, что в целях усиления вовлечения мобилизованных ГСК в репарационный процесс необходимо начинать вводить больным G-CSF (филграстим) за несколько дней до операции, повысив уровень циркулирующих ГСК в несколько раз до начала операции.

Что касается активации иммунитета ронколейкином, то, судя по транзитор­ному подъему супрессорного цитокина IL-10 и снижению уровня цитокси-ческих Т-лимфоцитов сразу после операции, его целесообразно вводить в пер­вые три дня после операции для предотвращения инфекционных осложнений.

Литература

1. Weissman I.L. Translating stem and progenitor cell Biology to the clinic: Barriers and opportunities // Science, 2000. V. 287. P. 1442-1446.

2. Melchers F, Relink A. Hematopoietic stem cells: Lymphopoiesis and the problem of commitment versus plasticity// Stem Cell Biology, Ed. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. P. 307—327.

3. Morrison S.J., Shah N.M., Anderson D.J. Regulatory mechanisms in stem cell biology/ /Cell, 1997. V. 88. P. 287-298.

4. Lemischka I.R., Raulet D.H., Mulligan R.C. Developmental potential and dynamic behavior of hematopoietic stem cells//Cell, 1986. V. 45. P. 917-927.

5. Cheshier S.H., Morrison SJ., Liao X., Weissman I.L // Proc. Natl. Acad. Sci., 1999. V. 96. P. 3120-3125.

6- Relink A., HaasnerD., Nishikawa SJ, Melchers F. Changes in frequencies of clonable preB cells during life in different lymphoid organs of mice//Blood., 1993. V. 81. P. 2290— 2300.

⁷- Ma Q., Jones D., Springer N.A. The chemokine receptor CXCR4 is required for the retention of В lineage and granulocytic precursors within the bone marrow microenvironment//Immunity, 1999. V. 10. P. 463—471.

⁸- PotocnikA. Role of bl integrin for hemato-lymphopoiesis in mouse development// Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2000. V. 251. P. 43-50.

⁹- Spangrude G.J., Heimfeld S., Weissman I.L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells//Science, 1988. V. 241. P. 58-62.

¹⁰- Spangrude G.J., Brooks DM Mouse strain variability in the expression in the hemato-

LPoietic stem cell antigen Ly6A/E by bone marrow//Blood, 1993. V. 82. P. 3327—3332.

11. Sato T., LaverJ.H., Ogawa M. Reversible expression of CD34 by murine hematon ■ stem cells//Blood, 1999. V. 94. P. 2548-2554. ^et'c

12. Martin-Rendon E., Watt S. Stem cell plasticity//Brit. J. Haematol, 2003. V \r>t P. 877-899.

13. Bonnet D. Haemopoietic stem cells // J. Pathol, 2002. V. 197 (4). P. 430-440.

14. Terstappen L. W., HuangS., SaffordM., Lansdorp P.M., Loken M.R. Sequential gene tions of hemopoietic colonies derived from single nonlineage-committed CD34+cp)-iJ progenitor cells//Blood, 1991. V. 77. P. 1218-1227.

15. Andrews R.G., Singer J. W., Bernstein ID. Precursors of colony-forming cells in human can be distinguished from colony-forming cells by expression of the CD33 and CD34 antigens and light scatter properties // J. Exp. Med., 1989. V. 169. P. 1721—1731. I

16. Lansdorp P.M., SutherlandH.J., Eaves C.J. Selective expression of CD45 isoforrns on functional subpopulations of CD34⁺ hemopoietic cells from human bone marrow// J. Exp. Med., 1990. V. 172. P. 363-366.

17. Craig W., KayR., CulterR.L., Lansdorp P.M. Expression of Thy-1 on human hemopoietic progenitor cells//J. Exp. Med., 1993. V. 177. P. 1331-1342.

18. YinA.H.,MigagliaS.,ZanjaniE.D.,Almeida-PoradaG., OgawaM., LearyA.G.,Olweus J. RearneyJ., BuckD. W. AC 133, a novel marker for human bone marrow hemopoietic stem and progenitor cells // Blood, 1997. V. 90. P. 5002-5012.

19. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch В., Gan O.L., Dick J.E. A newly discovered class of human hemopoietic cells with SCID-repopulating activity // Nat. Med., 1998. V. 4. P. 1038-1045.

20. KuciS., WesselsJ., BuhringHJ., SchilbachK., SchummM., Seitz G., LofflerJ., BaderP., SchleigelP.G., Neithammer D., Hangreitinger R. Identification of novel class of human adherent CD34" stem cells that give rise to SCID-repopulating cells//Blood, 2003. V. 101 (3). P. 869-876.

21. Martin-Rendon E., WattS.M. Exploitation of stem cell plasticity // Transfusion Medi­cine, 2003. V. 13. P. 325-349.

22. Immunology, Ed. RoittL, BrostoffJ., MaleD., Mosby, Edinburgh e.a., 2001.

23. Thomas E.D., Storb R. Technique for human marrow grafting // Blood, 1970. V. 36. P. 192-204.

24. Horowitz M.M. Uses and growth of hematopoietic cell transplantation//Hematopoietioc cell transplantation, Thomas E.D., Blume K.G., Harman S.J., Eds, 2^nd edition. Maiden, MA: Blackell Science, 1999. P. 12-18.

25. Storb R.F., Lucarelli G., McSweeney PA., ChildsR. W. Hematopoietic cell transplanta­tion for benign hematopoietical disorders and solid tumors // Hematology, 2003. P. 372— 397.

26. MaleD. T-cell receptors and major histocompatibility complex molecules//Irnmun°" logy, Ed. Roitt I., BrostoffJ., Maie D., Mosby, Edinburgh e.a., 2001. P. 87-103.

27. Martin P.J., Hansen J.A., Thomas E.D. Human marrow transplantation: an imrrm¹¹⁰ logical perspective//Adv. Immunol, 1987. V. 40. P. 379-438.

28. Buckley R.B. Transplantation immunology: Organ and bone marrow//J. Allegy^t-Immunol, 2003. V. 111. N 2. P. S733-S744.

29. Read EJ., Carter Ch.S. T-cell depletion of hematopietic progenitor cell products ° allogenic transplantation//Cellular Therapy: New Frontiers in Transfusion M cine, Ed. Sacher R.A., Bethesda, MD: American Association of Blood Banks. *

P. 29-44.

54

U Harousseau J.L., Stoppa A.M., Sotto J.J., Fuzibet J.G., Rossi J.E., Casassus P.,

3О ' . meuveH., Facon T, If rah N., Payen C, BataileR. A prospective, randomized trial

^ rologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma.

logous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma //

^AUEngl- •>■ ^Med'' ¹⁹⁹⁶- ^V- ³³⁵' ^P- ⁹¹~¹⁰⁵-. _tG GazittY.,LeemhuisT.,JagannathS.,DesikanK.R.,SiegelD.,FassasA., TindleS.,

3'- , 1 _nrtJ., Juttner C, Tsukamoto A., Hallagan J., Atkinson K., Reading C, Hoffman R.,

InzieB. Collection, tumor contamination and engraftment kinetics of higly purified

topoietic p_r0g_enit_{or се}ц to support high dose therapy in multiple mieloma //

Blood. 1998. V. 91. P. 4489-^1495.

. ug j)J.L. Autologous bone-marrow transplantation for rheumatoid arthritis (let-

³² iter) //Lancet, 1997. V. 350. P. 337-339; BurtR.K., TraynorA.E, Ramsey-GoldmanR. Hematopoietic stem cell transplantation for systemic lupus erythematosus (letter)// N. Engl- J. Med., 1997. V. 337. P. 1777-1779.

-n fyndallA., Black C, FinkeJ., Winkler J., Mertlesmann R., Peter H.H., Gartwohl A. Treatment of systemic sclerosis with autologous hematopoietic stem cell transplanta­tion (letter) // Lancet, 1997. V. 349. P. 254-255;

34 BurtR.K-, TraynorA.E., Cohen В., Karlin K.H., Davis FA., Stefoski D., Terry C.,Lobeck L., Russel E.J., Goolsby C, Rosen S., Gordon L.I., Keever-Taylor C, Burns W.H. T-cell depleted autologoushematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis: Re­port on the first three patients//Bone Marrow Transplant. 1997. V. 21. P. 537—542.

35. Burt R.K., Traynor A.E., Pope R., Schroeder J., Cohen В., Karlin KM., Lobeck L., Goolsby Ch., Rowlings Ph., Davis F., Stefoski D., Terry C, Keever-Taylor C, Rosen S., Vesole D., Fishman M., Brush M., Mujias S., Villa M., Burns W.H. Treatment of autoimmune diseases by intense immunosuppressive conditioning and autologous hematopoietic stem cell transplantation // Blood, 1998. V. 92. P. 3505—3514.

36. TyndalA., Passweg J., Grathwohl A. Haemopoietic stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmune diseases 2000//Ann. Rheum. Dis., 2001. V. 60. P. 702-707.

37. Tyndal A., Passweg J., Grathwohl A. Haemopoietic stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmune diseases 2000 // Ann. Rheum. Dis., 2001. V. 60. P. 702-707.

■ ourt R.K., Slavin S., Bums W., Marmont A. Induction of tolerance in autoimmune diseases by hematopoietic stem cell transplantation: getting closer to cure? // Blood, ₃₉ V. 99. P. 768-784.

• *^a< Sh., Нага Н. Allogenic hematopoietic stem cell transplantation // Therapeutic _4Q Apheresis and Dialysis, 2003. V. 7(3). P. 285-291.

opidot Т., Petit L Current understanding of stem cell mobilization: the roles of ernokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells // 41 у ^Hematol> 2002. V. 30. P. 973-981.

orris C.L., SiegelE., BarlogieB. et al. Mobilization of CD34⁺ cells in elderly patients /~/0 years) with multiple myeloma: influence of age, prior therapy, platelet count 42. fj ^mobiHzation regimen // Br. J. Haematol, 2003. V. 120. P. 413^123.

With г ^°^ ^' ^' Wh'^te D- et al. Successful peripheral blood stem cell mobilization net' ^ast™ ^ш Patients with chronic myeloid leukemia achieving complete cytoge-tita ^resP°nse with imatinib, without increasing disease burden as measured by quan-ive real-time PCR // Leukemia, 2003. V. 17. P. 821-828.

55

43. Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Livingston A.G. et al. Human bone marrow CD34- cells engraft in vivo and undergo multilineage expansion that includes giving rise to CD34⁺cells // Exp. Hematol, 1998. V. 26. P. 353-360.

44. BrittanM., Hunt T.JeffereyR. et al. Bone marrow derivation of pericryptal myofibroblasts in the mouse and human small intestine and colon // Gut., 2002. V. 50. P. 752—757

45. DirekzeN.C, Forbes SJ., Brittan M. et al. Multiple organ engrafment by bone marrow derived myofibroblasts and fibroblasts in bone-marrow-transplanted mice // Stem Cells, 2003. V. 21. P. 514-520.

46. Brazelton T.R., RossiF.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice // Science, 2000. V. 290 (5497). P. 1672—1674.

47. WangX., GeSh., McVamara G, Hao Q.L., Crooks G.M., NotlaJA. Albumine-expressJJ ing hepatocyte-like cells develop in the livers of immune-deficient mice that received transplants of purified human hematopoietic stem cells // Blood, 2003. V 101 N10 P. 4201-4208.

48. HerzogE.L.,ChaiL.,KrauseD.S. Plasticity of marrow-derived stem cells //Blood, 2003 V. 102. N10. P. 3483-3493.

49. Balsam L.B., Wagers A J., Christensen J.L., Kofidis Т., Weissman I.L., Robbins R.C\ Haemopoietic stem cells adopt mature haemopoietic fates in ischemic myocardium//) Nature, 2004. V. 428 (6983). P. 668-669.

50. Murry C.E., Soonpaa M.H., Reinecke #., Nakqjima HO., RubartM., PasumarthiK.B., Virag J.I., Bartelmez S.H., Poppa V., Bradford G., Dowell J.D., Williams D.A., Field L.J. Haemopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts // Nature, 2004. V. 428 (6983). P. 607-608.

51. Bailey AS., Jiang S., Afentoulis M., Baumann C.I., Schroeder D.A., Olson S.B., Wong M.H., Fleming W.H. Transplanted adult hemopoietic stems cells differentiate into func­tional endothelial cells // Blood, 2004. V. 103 (1). P. 13-19.

52. NorolF., MerletP., IsnardR., Sebillon P., BonnetN, Cailliot Ch., Carrion C, Ribeiro M., CharlotteF,PradeauP.,MayolJ.F.,PeinnequinA.,DrouetM.,SafsafiK., VernantJ.-P., Herodin F. Influence of mobilized stem cells on myocardial infarct repair in a nonhuman primate model // Blood, 2003. V. 102. N13. P. 4361^368.

53. AscariA. et al. Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy // Lancet, 2003. V. 362. P. 697—703.

54. Hill W.D. et al. SDF-1 (CXCL12) is upregulated in ischemic penumbra following stroke: association with bone marrow cell homing to injury // J. Neuropathol. Exp.' Neurol., 2004. V. 63. P. 84—96.

55. Levescque J.P. et al. Disruption of the CXCR4/CXCL12 chemotactic interaction during hematopoietic stem cell mobilization induced by GCSF or cyclophosphamide //J. Clin. Invest, 2003. V. 111. P. 187-196.

56. Kawabata Y., Hiokawa M., Komatsuda A., Sawada K. Clinical applications of CD34⁺ cell-selected peripheral blood stem cells // Ther. Apher. Dial., 2003. V. 7(3). P. 298—304.

57. SugiuraK.JnabaM., OgataH, YasumizuR.,InabaK, GoodRA.,Ikehara S.Weal germ agglutinin-positive cells in a stem cell-enriched fraction of mouse bone marrow have potent natural suppressor activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. V. 85. P. 4824— 4833.

58. Sugiura K, Ikehara S., Inaba M., Haraguchi S., Ogata H, Sardina E.E., Sugawara M., 1 Ohta Y., GoodRA. Enrichment of murine bone marrow natural suppressor activity in 1 the fraction of hematopoietic progenitors with interleukin 3 receptor-associated anti- 1 gen // Experimental Hematology, 1992. V. 20. N2. P. 256—263.

₅9 Young M.R.I., Wright MA., Lozano Y., Prechel M.M., Benefield J, Leonetti J, Colluns Sh.L., Petruzzelli G.J. Increased recurrence and metastasis in patients whose primary head and neck squamous cell carcinomas secreted granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and contained CD34⁺ natural suppressor cell//Int. J. Can­cer (Pred.Oncol), 1997. V. 74. P. 69-74.

50. Sugiura K, Pahwa S., Yamamoto Y., Borisov K., Pahwa R., Nelson R.P.Jr., Ishikawa J, Iguchu Т., OyaizuN., GoodRA., Ikehara S. Characterization of natural suppressor cells in human bone marrow // Stem Cells, 1998. V. 16. N2. P. 99-106.

61. WrightMA., WiersK., Vellody K., D/ordjevic D., Young M.R. Stimulation of immune suppressive CD34⁺ cells from normal bone marrow by Lewis lung carcinoma tu-mours//Cancer Immunol.Immunother., 1998. V. 46. N5. P. 253—260.

62. WiersK., WriightMA., Vellody K., Young M.R. Failure of tumor-reactive lymph node cells to kill tumor in the presence of immune-suppressive CD34⁺ cells can be over come with vitamin D3 treatment to diminish CD34⁺ cell level//Clin Exp.Metastasis, 1998. V. 16. N3. P. 275-282.

63. WiersK.M., Lathers D.M., WrightMA., Young M.R. Vitamin D3reatment to diminish the levels of immune suppressive CD34⁺ cells increases the effectiveness of adoptive immunotherapy // J. Immunother, 2000. V. 23. N1. P. 115-124.

64. Рысулы M.P., Беляев H.H., Шалбаева АД., Искалиева С.С., Богданов А.Ю. Гемо-поэтические стволовые клетки. Под ред. М. А. Алиева. Алматы: Мектеп, 2005. 133 с.

65. Беляев Н.Н. Натуральная супрессия как иммунологическая функция гемопоэти-ческих стволовых клеток//Научные приоритеты казахстанской аллергологии и иммунологии. Алматы: Раритет, 2005. С. 74—88.

66. Беляев Н.Н., Закирьянова Г.К., Беклемишев А.Б. Антимитогенный фактор костного мозга и его регуляция гистамином // Иммунология, 1991. №3. С. 27—29.

67. Закирьянова Т.К., Беляев Н.Н. Изопикническое разделение клеток костного мозга// Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии, Алматы, 1999. С. 142-145.

68. Belyaev N, Zakiryanova G, Atikova Т., Sinenko S., Bernikov S. Modulating effect of histamine in bone marrow//XXIV Annual Meeting of European Histamine Research Society. Moscow, May 20—25 1995. Moscow, 1995. P. 9.

69. Belyaev N.N., Zakiryanova G.K., BeklemishevA.B. Histamine-induced contrasuppression in bone marrow/Дп Vitro Cellular & Developmental Biology/World Congress on Cell and Tissue Culture, 20-25 June 1992, Washington, 1992. V. 28. N3. Part II. P. 169a.

70. Беляев Н.Н., Закирьянова Т.К., ХегайЛА., Беклемишев А.Б. Анализ антимитогенной и гистаминсвязывающей активности изопикнических фракций клеток костного мозга // Иммунология, 1993. №3. С. 15—17.

71. Берников СВ., Закирьянова Т.К., Беляев Н.Н. Обогащение суспензии клеток костно­го мозга гистаминсвязывающей фракцией // Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии. Алматы, 1999. С. 146—150.

72. Bernikov S., Belyaev N., Zakiryanova G. Suppressive and histamine induced contrasuppressive activity of bone marrow cells separated by percoll and affinity sorbent // XXYI Annual Meeting of European Histamine Research Society, Seville. Spain, 14—17 May, 1997. P. 321-322.

73. Беляев Н.Н, Закирьянова Г.К. Феномен гистамин-опосредованной контрсупрес­сии (ГОКС) в костном мозге. Экспериментальный и теоретический анализ // Известия HAH PK, 1995. № 3. С. 34-39.

57

74. Богданов А.Ю., Саввулиди Ф.Г., Тлеулиева Р.Т., Беляев НЛ. Альфа-фетопротеин I как индуктор натуральных супрессорных (NS) клеток костного мозга. I. Изопик- I нические фракции NS-клеток и их супрессорные эффекты // Биотехнология. I Теория и практика, 2004. № 3. С. 83—89.

75. Богданов А.Ю., Беляев ЕЛ. Альфа-фетопротеин как индуктор натуральных суп- 1 рессорных (NS) клеток костного мозга. П. Молекулярная природа супрессорных 1 факторов // Биотехнология. Теория и практика, 2004. № 3. С. 90—98.

76. Алиев М.А., Беляев НЛ.,АбзалиевК.Б., СериковЛ. С, Богданов А. Ю., Саввулиди Ф.Г., I Тлеулиева Р.Т. Иммунологическая оценка эффективности применения рон- I колейкина в кардиохирургии при лечении инфекционного эндокардита // Цито- I кины и воспаление, 2004. Т.З. № 1. С. 28—31.

%. А. Сатыбалдиева, Б. А. Жумабаева (РШ "Национальный центр

экспертизы лекарственных средств МЗ РК"),

Р. С. Кузденбаева (КазНМУ),

М. Рысулы (ТОО "Стэмкорд")

ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И УРОВНЯ

ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ЛИЦ

ПРИ ВВЕДЕНИИ ПРЕПАРАТА СУСПЕНЗИИ (ВЗВЕСИ)

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

ПУПОВИННОЙ КРОВИ

Одной из главных задач настоящего исследования является изучение влияния препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинно-плацентарной крови на основные показатели иммунной системы и цитокиновый профиль условно здоровых лиц в динамике.

В организме начало иммунного ответа отнюдь не совпадает с моментом антигенного раздражения различного происхождения. Основные механизмы иммунитета включаются вскоре после антигенного стимула, а реакции клеточ­ного иммунитета развиваются не ранее 15 дней. Кроме того, по данным литера­туры (С. И. Моисеев, К. М. Абдулкадыров, СПб, 2004 г.) приживление стволо­вых клеток наблюдается на 16—50 сутки, в среднем на 30 день. Последнее обстоя­тельство послужило причиной определения сроков исследования показателей иммунитета (количественного содержания основных иммунокомпетентных клеток и их субпопуляций) и цитокинового профиля через 15,30 и 45 дней с момента введения препарата Суспензии (взвеси) ГСК плацентарно-пупо-винной крови.

Изучение цитокинов различных видов интересовало нас с точки зрения реактивности иммунной системы и процессов иммунорегуляции у здоровых лиц в процессе трансплантации ГСК пуповинной крови.

Уровень цитокинов в сыворотке крови наряду с количественным содержа­нием иммунокомпетентных клеток может служить признаком реагирования иммунной системы на введение ГСК, маркером реакций острой фазы и воспа­ления как первой линии защиты, а также проявлением общей реактивности организма.

Оценка показателей иммунной системы условно здоровых лиц при введении препарата Суспензии (взвеси) ГСК пуповинной крови в динамике.

Изучение показателей иммунной системы осуществлялась нами путем Фенотипирования основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови ^с Помощью метода проточной цитометрии с использованием различных Сборов моноклональных антител, меченных такими флюорохромами, как Флюоресцеинизотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ), перидинин-хлорофилл Протеин (Per CP) (производства фирмы «Becton & Dickinson», США).

Метод проточной цитофлуориметрии сформировался за последние 30 лет "^а основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их

59

размеров. Методом проточной цитофлуориметрии можно исследовать пролиферативную активность нормальных и опухолевых клеток на основе анализа клеточного цикла, проводить иммунофенотипирование клето^ периферической, пуповинной крови, костного мозга [1].

Проточная цитофлуориметрия представляет собой исследование в прохо­дящем свете лазера клеток, находящихся в потоке жидкости, поэтому основным требованием к анализируемому образцу является его состояние в виде суспеЛ зии клеток. Объектами для исследования методом проточной цитофлуори­метрии (ПЦ) могут быть кровь, костный мозг, различные пунктаты и биоптаты. В основе метода лежит способность поверхностных клеточных рецепторов (CD антигенов) связываться со специфическими антителами, мечеными различными флуорохромами. При прохождении окрашенной таким образом клетки через пучок лазера происходит возбуждение флуоресцирующих красителей. При этом может происходить одновременное возбуждение разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Световой сигнал усиливается на фотоумножителях проточного цитометра и обеспечивает информацией о размере клетки, гранулярности, а также об экрИ прессии тех или иных антигенов, что позволяет определить принадлежность щ той или иной субпопуляции. В качестве источника света в проточном цитофлуориметре используется аргоновый лазер с длиной волны возбуждения 488 нм, регистрация флюоресценции осуществляется при 517 нм для флуореЯ сцеинизотиоционата FITC, при 600 нм и более для фикоэритрина РЕ и пери-динин-хлорофилл протеина РегСР/фикоэритрина-цианина 5 РЕ-Су5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножи­телях соответственно. Первый (FL1) — это детектор, выявляющий красители зеленого цвета (FITC), второй (FL2) —детектор определяет красители красного спектра (РЕ), третий (FL3) — для красителя перидининхлорофилла РегСГЯ Таким образом получают данные по прямому (forward side scatter (FSC)) под углом 0,50—2° и боковому (side scatter (SSC)) под углом 90° светорассеянию, а! также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Прямое светорассеяние дает информацию о размере клетки; боковое светорассеяние несет информацию о структуре клетки, о соотношении I размеров ядра и цитоплазмы; интенсивность флуоресценции позволяет | выявить плотность того или иного антигена на поверхности клетки [2].

Стандартная пробоподготовка для выявления поверхностных маркеров клея ток осуществляется по протоколу окрашивание—лизис—отмывка и окрашива-1 ние—лизис—без отмывки [3,21].

Протокол пробоподготовки без отмывки включает в себя следующие этапы: I

— добавление 20 мкл меченных соответствующим флюорохромомЯ моноклональных антител 100 мкл исследуемого образца крови;

—инкубация в течение 15—30 мин при комнатной температуре в затемненномИ месте;

— добавление лизирующего раствора, содержащего диэтиленгликоль НЩ формальдегид для лизирования эритроцитов с последующей инкубацией в 1 течение 10 мин. После всех вышеназванных этапов сбор данных возможен.

При необходимости отсрочить анализ на 2—24 ч, пробоподготовка можетя

йыть дополнена фиксацией клеток образца добавлением фиксирующего яствора, содержащего формальдегид. Протокол пробоподготовки с отмывкой включает в себя следующие этапы:

— добавление 20 мкл меченных соответствующим флюорохромом моноклональных антител в исследуемый образец крови;

—инкубация в течение 15—30 мин при комнатной температуре в затемненном

месте;

— добавление лизирующего раствора, содержащего диэтиленгликоль и

формальдегид для лизирования эритроцитов с последующей инкубацией в _течение 10 мин;

—центрифугирование в течение 5 мин при 300 х g оборотах в мин;

—удаление супернатанта и повторное центрифугирование в течение 5 мин при 200 х g оборотах в мин, с фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% натрия азид;

— удаление супернатанта и добавление фиксирующего раствора, содержащего формальдегид.

После соответствующей пробоподготовки определяли процентное содержание тех или иных популяций клеток на проточном цитофлуориметре (FACS Calibur, «Becton & Dickinson», США).

Метод ПЦ обладает целым рядом преимуществ:

—возможность исследования в ходе одного анализа большого числа клеток (более 100 000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток) за короткое время исследования (минуты);

—возможность измерения интенсивности флуоресценции, позволяющей выявить плотность того или иного антигена на поверхности клетки;

• возможность одновременного исследования различных характеристик и структурных компонентов одной клетки;

• возможность детектирования редких популяций клеток, например, стволовых клеток.

Определение популяционного состава клеток крови.

С развитием метода проточной цитофлуориметрии определение иммунофе-нотипа клеток крови человека уже не представляет особой сложности и позволяет оценивать экспрессию нескольких CD (Clusters of differentiation) маркеров одновременно. Для этого используют способность клеток связываться со специфическими антителами. В настоящее время уже извест­но около 250 таких CD-молекул.

Следует отметить, что последнее полуторадесятилетие в иммунобиологии ознаменовалось идентификацией целой системы дифференцировочных антигенов-кластеров на поверхности иммунных и неиммунных клеток, которые классифицируются согласно виду экспрессирующих их клеток и молекуляр­ной массе. На этой основе с помощью моноклональных антител (AT) опре­деляются CD-антигены (CD-АГ Claster differentiation antigen).

До 1989 г. было известно только 7 CD-AT. В1989 г. Номенклатурный Коми­тет ВОЗ провел IV конференцию по лейкоцитарным дифференцировочным антигенам человека и добавил 35 новых кластеров и субкластеров [1,2]. V Международное рабочее совещание (1993, Бостон, США) значительно

дополнило список и в настоящее время известно уже около 200 различных CD-антигенов.

CD-молекулы представляют собой поверхностные мембранные гликопро-теины (реже протеины), продуцируемые клеткой в клеточносвязанной (CD) и в растворимой (sCD) формах. Как и у всех рецепторов клеток, у CD молекулы различают три части: экстрацеллюлярную, трансмембранную и интрацц-топлазматическую.

Среди CD-клеточных мембранных протеинов различают, согласно Biologi­cal Abstracts, определенную группу РЕЦЕПТОРОВ, например, CD 21 — рецептор комплемента CRII, CD 23—рецептор к Ig E, CD 25 — рецептор для IL-2, CD 35—рецептор комплемента CRI, CD lib/CD 18-дляСЯ III, CD 54-ICAM-1, CD 64 — то же для IgG. Для связывания с ними на нелимфоидньгх клетках экспрессированы CD-молекулы—ЛИГАНДЫ. Следует заметить, что по своей природе все молекулы CD являются антигенами.

Взаимодействие антигенов CD на иммунокомпетентных клетках-лимфо­цитах с их специфическими лигандами на распознаваемой клетке-контрагенте приводит к активации, дифференциации и эффекторной фазе лимфоцита или другой клетки.

Номенклатура CD- АГ быстро увеличивается за счет вновь открываемых, расширяется благодаря идентификации субкластеров (обозначаемых а, Ь, с и т. д.) [4].

Все CD-антигены являются либо трансмембранными белками, либо белками, заякоренными на мембране через гликозилфосфатидилинозит. Исследование структуры большого числа CD-антигенов показало, что щш можно подразделить на группы, имеющие участки с заметной гомологией в аминокислотной последовательности и, как следствие, с одинаковой пространственной упаковкой.

Примером может служить суперсемейство иммуноглобулинов. для которых характерно наличие в структуре внеклеточной части молекул Ig-подобных доменов. Эти домены могут быть подобны вариабельным (V), константным (С) доменам иммуноглобулинов или же иметь смешанный тип (V-C). Описано более 100 белков, принадлежащих к суперсемейству иммуноглобулинов, среди них CD-2 (LFA-2), CD-58 (LFA-3), CD-54 (ICAM-1), ICAM-2, VCAM-1, рецептор Т-клеток CD-3, CD-4, CD-8, HLA класса IЩ HLA класса II [4].

Семейство интегринов—адгезивные гетеродимеры, образованные общей бета-цепью (CD 18) и одной из трех различных альфа-цепей (CD 1 la, CD 1 lb, CD lie). Интегрин CD 1 la/CD 18 известен как функциональный лимфо-цитарный антиген 1 типа (LFA-1), CD lib/CD 18 называют также CR 3, а CD llc/CD 18—CR 4 (он известен и как p. 150,95). Кроме вышеперечисленных, относятся: CD 29 (VLA-1 - VLA-6), CD41, CD 49a /CD 29 (VLA-4/LPAM-l),| CD49b,CD49c,CD49d(LPAM-2),CD51,CD61,CD 103, CD 104.

Селектины (от select и lectin) — семейство из трех структурно-родствен-1 ных мембранных гликопротеинов. Включают три типа молекул: лейкоцитар­ные L - (CD 62 L, LECAM-1, Mel 14) представлены на лимфоцитах, моноцитах, 1 нейтрофилах и опосредуют миграцию в периферические лимфоузлы (для I

62

_лйМфоцитов) и зону воспаления (моноциты, нейтрофилы). Эндотелиальные g„ (ELAM-1, CD 62E) - селектины экспрессированы на активированных эндо-_телиальных клетках. Тромбоцитарные селектины Р (CD 62 Р, PADGEM — _протеин, GMP-140) экспрессируются васкулярными эндотелиальными _клетками и тромбоцитами. При стимуляции этих клеток различными факторами, такими как тромбин, гистамин, ионофоры кальция и т. д., селектин быстро (в минуты) перемещается к поверхности клетки, где опосредует взаимодействие с клетками и отвечает, в частности, за ранние события в рекрутировании лейкоцитов в очаг воспаления.

ТМ4 — семейство мембранных протеинов, пронизывающих плазмати­ческую мембрану четыре раза. Относятся CD 53, CD 9, CD 37, CD 62, CD 82,

CD 81).

TNF/GNF (туморонекротический фактор—фактор роста нервной ткани) — суперсемейство, основанное на общности строения обогащенных цистеином повторностей экстрацеллюлярного региона рецептора. Относятся CD 27, CD 30, CD 40 и CD 95. Экспрессируются на лимфоидно-гематопоэтических клетках. Включены в индукцию секреции цитокинов, регуляцию адгезивных молекул, активацию антигенов и костимуляцию протеинов [4,5].

Все CD-молекулы выявляют с помощью меченых моноклональных антител. В качестве метки в ПЦ используются различные флюорохромы.

Анализ фенотипа клеток, как правило, проводится в два этапа [6]. На первом этапе изучаемые клетки оцениваются и выделяются по параметрам светорассеяния (FSC и SSC). Затем выделяются регионы в зависимости от флуоресцентной метки.

На рисунках представлены двухмерные гистограммы клеток пуповинной крови, меченых антителами CD 34.

На рис. 1 представлена характеристика размера и гранулярности клеток пуповинной крови. По оси абсцисс—FSC, по оси ординат—SSC. Выделенная красным цветом область R 1 характерна для лимфоцитов, имеющих низкий уровень гранулярности (SSC), область R 2 — мононуклеарные

клетки, область R 3 — грану- 8j—^" . .,..:.,„—..—,.»-■—■■■-..

лоциты, которые имеют наибо- -¹: /-: /.

лее высокий уровень SSC(rpa- 8- / /

нулярности). °° : ■ ./ ■■■'; '■-. '\-;Л "У'-У-г-.' ' У

Стволовые клетки CD 34⁺ о' •" ■'•].-: '%&'~%Хъ-> / занимают промежуточное по- Т¹⁰" ■. />".**§! /

ложение между лимфоцитами и $₀: '■'/.ЙЙиШ^ / моноцитами и характеризуются §~ '--Ч— '' /

как лимфоидные клетки круп- йдИ $7^

ного размера, практически не §'- jjfljj J^yv . имеющие включений [7], поэто- SrV

му область выделения по пара- о -, ,^Щ^?Щг1у, , . , , ,

Метрам светорассеяния FSC и о гоо 400 боо 800 юоо

SSC включает в себя как ^FSC"^H

лимфоциты, так и моноциты Рис. 1

63

„ Dala.030 ₀ Data.030

о J Т*^-" ' • ■ -—-.-—•.-- -1 о-I | ■—i

о ■ ■ ■; ,^;.:'.^:.\;-. ,':.j//' ■'' ' о '

I _r.|^iig^:; Г_

0 200 400 6Ю 800 1000 10° 10¹ 10² 10³ 10⁴

FSC-H FL2-H

Рис. 2 Рис. З

(рис. 2). На рис. 3 стволовые клетки CD 34⁺ локализованы в нижнем правом квадрате (положительный сигнал по F1 2) и имеют низкие уровни гра­нулярности (SSC), т. е. эти клетки практически не содержат клеточных включений.

Таким образом, развитие метода проточной цитометрии позволило изу­чать с высокой точностью такие малые популяции клеток, как например, стволовые клетки.

Оценка уровня основных субпопуляций клеток иммунной системы на фоне введения препарата ГСК здоровым лицам.

Забор крови для иммунологических исследований производили натощак из локтевой вены одноразовой иглой в специальную вакуумную систему (ваку-тейнер), содержащую 6% ЭДТА. После чего вакутейнер с кровью осторожно переворачивается несколько раз для перемешивания крови с антикоагулянтом.

Проводилось определение количественного содержания следующих попу­ляций иммунокомпетентных клеток:

• определение содержания зрелых Т-лимфоцитов, несущих CD 3⁺ маркер.

• определение содержания Т-хелперов, несущих CD 4⁺ маркер, которые являются Т-лимфоцитами, продуцирующими различные цитокины, участвующие в тонких процессах регуляции иммунного ответа.

—определение содержания Т-супрессоров, несущих маркер CD 8⁺; —определение содержания NK-клеток, экспрессирующих CD 16⁺ маркеры, обладающие противоопухолевой и противовирусной цитотоксичностью;

— определение активированных мононуклеарных клеток (МНК) CD 25⁺, несущих рецептор к ИЛ-2;

—определение уровня гемопоэтических стволовых клеток, несущих маркер CD34⁺.

Все обследуемые были поделены на три группы:

1. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 2,5—2,9 х 10⁵/кг;

2. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 3,4—3,8 х 10⁵/кг;

3. Добровольцы, получавшие препарат в дозе 4,2—4,8 х 10⁵/кг.

64

Диаграмма 1

Содержание CD 3+ у добровольцев

89,5

70 шл 8),е V \

% ₄₀ ■ 1 группа

30 D2 группа

20 ■ D3 группа

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Оценка иммунного статуса проводилась до введения препарата, на 15,30 и 45 сутки после введения препарата.

Результаты оценки иммунного статуса.

Как видно из диаграмм 1, отмечалось достоверное повышение уровня Т-лимфоцитов с фенотипом CD 3⁺ во всех трех группах на 15-е сутки после введения препарата. К 45 дню после введения препарата уровень этих клеток вернулся к исходному.

Содержание Т-хелперов (CD4⁺) (диаграмма 2) достоверно повышался к 15

Диаграмма 2

Содержание CD4+ у добровольцев

60 Л~ —gg — - -

' ⁵° £fl ^А 43

Ж Щ

% 30■' в1 группа

20 I «2 группа

Ю I ^{а3фуппа}

о MiiiiiiiipkJJLJ I И ИмИ 1г

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования (дни)

65

р

Диаграмма 3

Содержание CD 8+

44

^{407 35}_д=л

_{t г} ^:8,i _{№ кл}

25 fl ^:8'^:;

%₂₀ ,1 i1 группа

₁₅- I 02 группа

10 ■' d3 группа

₀1 шшт\\ш\ 1 Lin 1 fl ■iLLiJ •

До 15сут. ЗОсут. 45сут. Сроки исследования (дни)

дню во всех исследуемых группах, но наиболее высоким был в третьей группе, что свидетельствует о дозозависимости результата.

Содержание Т-супрессоров (CD8⁺) к 15 дню повышалось во всех трех груп­пах и к 45 дню после введения вернулось к норме (диаграмма 3).

Отмечалось незначительное повышение уровня NK-клеток во всех трех группах на 15 сутки (диаграмма 4).

Наиболее существенное влияние препарат оказал на изменение уровня ГСК (CD 34⁺) (диаграмма 5). Отмечалось увеличение уровня ГСК (CD 34⁺) в 4,8 раза в первой группе, в 5,2 раза во второй группе и в 4,5 раза в третьей группе на 15 сутки. К 30 дню уровень ГСК достиг максимального в 3 группе (1,1%). Через 45 дней с момента введения препарата уровень ГСК в первой

Диаграмма 4

Содержание CD 16+ у добровольцев

. TJTT"

До 15сут. ЗОсут. 45сут.

Сроки исследования

I 66

Диаграмма 5

Содержание CD 34+ у добровольцев

1,2 /V 1,1

0 8 I ilfl

% 0,6 ■ 1 группа I

0,4' °^^,ЗД°.33 ■ 2 группа

До 15сут. ЗОсут. 45сут.

Сроки исследования

группе снизился вдвое, в 2,8 раза во второй группе и в 3,3 раза в третьей группе обследуемых по сравнению с показателями, отмеченными на 30-е сутки. Необходимо отметить, что содержание CD34⁺ клеток и через 45 дней с момента введения Суспензии ГСК пуповинной крови было выше исходного уровня.

Значительно изменилось содержание клеток — активированных моно-нуклеаров, несущих рецептор для интерлейкина -2 CD25⁺ во всех группах после введения препарата ГСК пуповинной крови (диаграмма 6).

Уровень CD 25⁺ в первой группе к 15-му дню после введения препарата Достоверно повысился в 4,8 раза в первой, в 5,3 раза—во второй и в 3,8 раза— в третьей группах соответственно. К 30-му дню после введения препарата

Диаграмма 6

Содержание CD 25+ у добровольцев

¹-²[ 1,06

До 15сут. ЗОсут. 45 сут.

Сроки исследования

67

уровень CD 25⁺ достиг максимального уровня во второй группе (1,06%) _й вернулся к исходному через 45 дней наблюдения.

Таким образом, введение препарата Суспензия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови оказало выраженное стимулирующее влияние на основные показатели иммунной системы у обследованных лиц всех трех групп. Необходимо отметить резкое увеличение содержания CD 34⁺ клеток (ГСК) уже через 15 дней после введения во всех трех группах обследованных лиц, которое сохранялось в течение всего срока исследования. Наиболее показательные данные были в третьей группе, что говорит о высокой дозозависимости результатов. Повысилось содержание активированных МНК CD 25⁺, несущих рецептор к ИЛ-2, эти данные коррелируют с данными, полученными при изучении уровня ИЛ-2 у этих же добровольцев (г = 0,90). Уровень ИЛ-2 достоверно повышался к 30-му дню во второй и третьей группах.

Изучение цитокинового профиля условно здоровых лиц при введении ГСК пуповинной крови.

Цитокины—это белковые или полипептидные продукты активированных иммунокомпетентных клеток, основная роль которых заключается в осуществлении межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, гемопоэзе и развитии воспаления. Необходимо отметить, что они служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма и разделяются на несколько групп: интерлейкины (ИЛ) — факторы взаимо­действия между лейкоцитами; интерфероны (цитокины с противовирусной и противоопухолевой активностью); факторы некроза опухолей (цитокины с цитотоксической активностью); колониестимулирующие факторы (гемопоэти-ческие факторы). Разделение это весьма условно.

Условно здоровые лица-добровольцы, которым вводили препарат Суспен­зия (взвесь) гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, были разделены на три группы:

1. группа (4 человека) — введен препарат в дозе от 2,4—2,9 х 10⁵/ кг массы;

2. группа (9 человек)—доза 3,4—3,9 х 10⁵/ кг массы;

3. группа (7 человек)—доза 4,4—4,9 х 10⁵/ кг массы. Нами исследованы следующие цитокины:

• Провоспалительные цитокины: ИЛ-1, ИЛ-6, ос-ФНО (фактор некроза опухолей).

• Активационные цитокины ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-4, ИЛ-17.

• Активаторы В-лимфоцитов: ИЛ 12, ИЛ-13.

• Хемокины—ИЛ-8.

• СупрессорныйцитокинИЛ-10.

• Лейкоз-ингибирующий фактор (LIF).

• Иммунный интерферон—гамма (г-ИФН).

• Колониестимулирующие факторы (G-CSF), (GM-CSF). Содержание цитокинов определяли щл помощи твердофазного иммуно-Я

ферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем производства ЗАО "Вектор-Бест" (г. Новосибирск, Россия) - ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-6, у-ИФН, . а-ФНО, а также фирмы "Citolabs" (Израиль) - ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15,ИЛ-17, LIF, G-CSF, GM-CSF.

68

Концентрация цитокинов исчислялась в пг/мл.

Провоспалительные цитокины обеспечивают первую линию защиты и вырабатываются большим числом различных клеток организма. Естествен­ными индукторами выработки этих цитокинов является действие микробов или их токсинов. Все они усиливают синтез белков острой фазы. Провоспали­тельные цитокины обладают исключительной широтой действия и много­численными мишенями. В комплексе эти эффекты способны обеспечить раз­витие воспаления и воспроизвести все его локальные и общие симптомы [8,9].

ИЛ-1 обладает многогранным действием: мобилизует неспецифические факторы защиты и систему иммунитета, вызывает метаболические изменения. Основные биологические эффекты ИЛ-1 можно разделить на иммуноло­гические, воспалительные, кроветворные и межсистемные. ИЛ-1 причастен к запуску начальных этапов иммунного ответа, в частности к вовлечению Т-хелперов.

Под влиянием трансплантации ГСК пуповинной крови уровень ИЛ-1 у лиц 1-й группы возрастал через 15 дней с момента введения, увеличивался через 30 дней и становился даже ниже исходного уровня через 45 дней (диаграмма 7).

Аналогичная закономерность отмечалась у лиц 2-й и 3-й групп. Можно отметить ярко выраженную дозозависимость. Так, у добровольцев 3-й группы уровень ИЛ-1 был достоверно выше, чем в 1-й и 2-й группах.

Уровень ИЛ-6 изменялся несколько иначе (диаграмма 8). Так, выраженной дозозависимости не отмечалось. Содержание ИЛ-6 у лиц 2-й и 3-й групп практически было одинаковым, и различия по срокам исследования были не достоверными. Вместе с тем через 30 дней после введения у лиц 3-й группы отмечалось значительное повышение содержания ИЛ-6 и снижение его уровня через 45 дней до уровня 1-й и 2-й групп.

Диаграмма 7

Уровень ИЛ-1 у добровольцев до и после введения препарата СК

³⁵ ТТ" 30,8

зо-' — Г

25 ' 20,9 П[

20 ' Г\ г -,

ic у la? ^В^ группа

До 15сут. ЗОсут. 45 сут.

Сроки исследования

69

Диаграмма 8

Уровень ИЛ-6 у добровольцев до и после введения препарата СК

20

15 15

^{15 jS9 em SJ 11-5}

■ 2 группа ! ⁵ | а 3 группа

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Поскольку продуцентами ИЛ-6 являются такие клетки, как фибробласты, гепатоциты, моноциты и макрофаги, а индукторами являются прежде всего бактериальные продукты, то полученные результаты можно рассматривать как закономерные, т. е. введение ГСК не вызвало выраженной индукции ИЛ-6 во всех группах (за исключением 3-й группы через 30 дней с момента введения ГСК).

Уровень а-ФНО (фактор некроза опухолей-альфа) также имел выражен-

|ную дозозависимость (диаграмма 9). Так, увеличивалось содержание а-ФНО у лиц 3-й группы через 15 и 30 дней после введения ГСК. Содержание а-ФНО

Диаграмма 9

Уровень ФНО у добровольцев до и после введения препарата СК

1« ¹>⁶³

1,5 Г

1,(25 0,92 0,9 _ft,.. пяат 0,87

1 шш=я о.7! i °й| )щ в 1 группа]

и,зШ °£ш РТУ 1 ■ 2 группа

ОШ пЗ группа

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

в 1-й и 2-й группах после введения практически не изменялось, а через 45 дней

было ниже исходного.

Активационные цитокины: ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-4, ИЛ-17.

Наиболее важный активационный ИЛ-2 (диаграмма 10) стимулирует пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов, повьппает цитолитическую активность NK-клеток, является хемоаттрактантом для эозинофилов [10,11], способствует развитию лимфокинактивированных клеток-киллеров, пролиферации В-лимфоцитов и секреции иммуноглобулинов.

Как видно из данных, представленных на рис. 4, уровень ИЛ-2 во всех группах обследованных лиц отмечалась общая закономерность: выраженная дозозависимость, значительное увеличение ИЛ-2 через 15 суток, еще больший подъем через 30 дней исследования и снижение — через 45 дней с момента введения ГСК. Причем содержание ИЛ-2 в 1-й и 2-й группах к концу исследования приближалось к исходным величинам.

ИЛ-15 имеет сходную с ИЛ-2 биологическую активность, стимулируя пролиферацию Т-лимфоцитов. Анализ содержания ИЛ-15 (диаграмма 11) на фоне введения ГСК пуповинной крови показал, что в целом динамика изменений содержания его сходна с данными по ИЛ-2, за исключением более высоких показателей в первый срок исследования.

Интерлейкин-4продуцируется Т-лимфоцитами, макрофагами, тучными клетками, базофилами, стромальными клетками костного мозга. Основной функцией ИЛ-4 является индукция дифференцировки Т-лимфоцитов в Т х 2-клетки (Т-хелперы 2 типа) [ 12], стимулирует пролиферацию В-лимфоцитов, способствуя продукции IgE, активизирует макрофаги и гранулоциты [13]. I Содержание ИЛ-4 у лиц 1-й и 2-й групп через 15 дней после введения препарата ГСК пуповинной крови практически не отличалось от исходных данных I (диаграмма 12). В третьей группе в этот же срок наблюдалось значительное

Диаграмма 10

Уровень ИЛ-2 на фоне введения препарата СК пуповинной крови

⁵ 4,12

^4/ _m

I³ 5£ 2,17 ■¹ ФУ^ппа

2-^ 1,12 ₁₉| 1 (| ■ 2 группа

._, 0,83^' |о,38 083<М5 1

1 Ш f=M I ^0,р^ D3rpynna

До 15 сут. 30 сут. 45 сут.

Сроки исследования

Диаграмма Я

Уровень ИЛ-15 на фоне введения препарата СКпуповинной крови

— 0,77 1

' 0,65

0,7 ^ 0,58

ПЙ I ,<=■ °'⁵¹ °'⁵³

_°-⁵ _{2^ И °£ °,зЛ}