Литература

\ Козинец Г.И., Погорелое В.М., Шмаров ДА., Боев С.Ф., Сазонов В.В. // Клетки крови — современные технологии их анализа. М.: Триада-Фарм, 2002.

2. BauerK.D., Duque R.E, Shankey T. V. Clinical flow cytometry. Principles and applica­tion. Baltimor, 1993. 635 p.

3 GratamaJ. W., SutherlandD.R., KeeneyM., Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents, 2001. Vol. 15. P. 14-22.

4. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона и Дж. Магки. М.: Мир, 1999. 506 с.

5. Беклемишев Н.Д., Сатыбалдиева Ж.А., Суходоева Г.С. Поверхностные дифференцировочные антигены клеток иммунной системы // Известия МОН РК, HAH PK. Серия биологическая и медицинская. 2000. № 5. С. 69—74.

6. РойтА., БростоффДж., МейлД. // Иммунология. М.: Мир, 2000.

7. Шмар ов Д.А., Козинец Г.И. // Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови.

8. А ндрееваЛ.Ю., Тупицын Н.Н. // Субпопуляция периферических стволовых гемопо­этических клеток (ПСГК). Проточно-цитофлюориметрическая идентификация ПСГК на основании светорассеяния, экспрессии CD 34, CD 45, AC 133* // Вопро­сы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2002. Т. 1. С. 60—65.

9. Bosh X., Miranda F., Filella X. et al. An inflammatory, but not an anti-inflammatory, cytokine profile is present in patients with unstable angina and correlates with progno­sis // Europ.Heart J. 1999. Vol. 20 (Abstr. Suppl). P. 522.

10. CusakM., MarberM.S., Odemujiwa S. et al. Does miocardial necrosis contribute to the inflammatory response in unstable angina? // Europ.Heart J. 2000. Vol. 21 (Abstr. Suppl.). P. 245.

11. Суворова К.Н. И РМЖ. 1998. Т. 6. С. 363-367.

12. Карпова В.А., Свечникова Н.Н., Коненков В.И. // Роль аллельного полиморфизма генов цитокинов в развитии атопического дерматита. Сб. "Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты". 2004.

13. Reinhold V. et al. // Acta Dermatol. Venerol. 1989. Vol. 69. P. 497-502.

14. Bohml, Bauer R. // Hautarzt. 1997. Vol. 48. P. 223-227.

15. FossiezF.,QossouO., ChomaratP. et al. //J. Experimental. Med. 1996. Vol. 183.P 2593-2603.

16. Yao Z., Painter S.L., Fanslow W.C., Ulrich D. et al. // J. Immunol. 1995. Vol. 155 . P. 5483-5486.

17. SuzukiS., KobayashiM., ChibaK. et al. // Blood. 2002. Vol. 99. № 5. P. 1863-1865.

18. Randow F, Docke W.D., Bundschuh D.S. et al. // J. Immunology. 1997. Vol. 158. P. 2911-2918.

!9. Schinkel C, LichtK, ZedlerS. et al. // J. Trauma. 2001. Vol. 50. P. 321-327.

20. Collins D.P. Related Articles Cytokine and cytokine receptor expression as a biological indicator of immune activation: important consideration in the development of in vitro model systems// Immunol J.Methods. 2000. Vol. 243 (1—2). P. 125—145.

21. Mumepee Г.Ю. Номенклатура антигенов CD (кластеров дифференцировки лейкоцитов) // Гематология и трансфузиология. 1994. Т. 39. № 6. С. 45—48.

22. ПинегжБ.В.,ЯрилжА.А., Симонова А.В. и др. Применение проточной цитометрии Для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие Для врачей-лаборантов. М.:ФГУП«Медсервис» при Минздраве России. 2001. 53 с.

81

L

С. М. Мамадалиев, Е. Н. Троицкий, Б. М. Хайруллин, Н. Т. Битов, 1 А. К. Наханов, К. Д. Сембаев (Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности НЦБ МОН РК)

ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Клеточная трансплантация как наиболее физиологический вариант заместительной терапии получает все большее распространение в современной медицинской практике. Этот метод рассматривается как возможный дополнительный либо самостоятельный способ коррекции функциональной несостоятельности некоторых органов и тканей. Многие исследователи расценивают в перспективе имплантацию культур клеток как метод, I определенной степени альтернативный органной трансплантации. В этом плане заметный прогресс достигнут в области пересадок (алло- и ксенотрансплан-тация) островковых клеток поджелудочной железы инсулинозависимым больным сахарным диабетом [ 1— 3].

Сегодня во всем мире ведутся эксперименты по созданию клеток, сокра­щающих омертвевшую после инфаркта сердечную мышцу, заживляющих ожоги на большой площади тела, наращивающих кость, а также восстанавли­вающих кроветворную функцию костного мозга у больных лейкемией. Стало известно, что стволовые клетки (СК), происходящие из эмбриональных источников и организма взрослых, имеют большой терапевтический потенциал для применения в клинической практике (клеточная терапия). СК, выделенные из костного мозга и моноцитов периферической крови человека, применяются при лечении аутоиммунных заболеваний, ревматизма, рассеянного склероза, системной красной волчанки. В Европе исследования по применению гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для лечения аутоиммунных заболеваний находятся на III стадии клинических испытаний [4,5].

Широкие возможности применения стволовых клеток для клеточной заместительной и восстановительной терапии были положительно оценены в США, Японии, Китае, Корее, Израиле и ряде других стран. В США, несмотря на существующий до последнего времени запрет на государственную поддержку работ согласно инструкции Национального института здоровья (NIH USA) по выделению СК из эмбриона человека, работа с линиями таких клеток разрешена частным лабораториям и биотехнологическим компаниям, включая разработку методов получения линий клеток человека и терапевти­ческого их использования. Однако их применение в клинической практике наталкивается на негативное восприятие общества с позиций морально-этических и религиозных ценностей. Не решена и проблема их канцерогенной и генетической безопасности.

Использование эмбрионов, абортированных по медицинским показаниям или отбракованных в процессе искусственного оплодотворения (ЭКО) дЯ*¹

82

научных и практических целей также запрещено во многих странах. Оно запрещено из этических соображений, поскольку даже в пробирке эмбрион «же может считаться будущим живым организмом.

В связи с поисками новых путей решения проблемы заместительной терапии _с использованием стволовых клеток внимание биологов и клиницистов привлекла способность ГСК давать начало различным типам специализи­рованных соматических клеток под влиянием ряда индуцирующих ростовых факторов и сохранять эту способность после длительной криоконсервации. ГСК, полученные из костного мозга, уже давно применяются для лечения онкологических заболеваний [6]. По своим свойствам ГСК относятся к плюрипотентным стволовым клеткам, способным дифференцироваться в любую линию клеток крови и иммунной системы. Их можно в различных количествах получить также из периферической и пуповинной крови [4,5,7]. Пока все проводимые исследования с применением СК носят предваритель­ный экспериментальный характер и их результаты не разрешены для клинического применения. По данным FDA (американской ассоциации по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами) широкое использование СК в клинической практике можно ожидать не ранее чем через 5 лет. Однако все-таки существуют разрешительные документы для исполь­зования определенного типа СК (гемопоэтических, кроветворного происхож­дения) в гематологии. Это единственный легальный метод, который существует уже тридцать лет и используется при лечении лейкемии и ряда других заболеваний. Трансплантация ГСК является разрешенным методом в рамках доказательной медицины, всей методологии, существующей на данном уровне нашего понимания медицины.

Основанием для проведения научно-исследовательских работ в разработке технологии выделения и культивирования ГСК человека с последующей дифференциацией в кардиомиоциты являются такие документы, как Стратегия развития Республики "Казахстан-2030", Стратегия индустриально-инно­вационного развития страны на 2003—2015 гг., Послание Президента Республики Казахстан от 18 февраля 2005 г. и Государственная программа реформирования и развития здравоохранения на 2005—2010 гг., где в качестве первоочередных задач была указана разработка новых технологий, современных методик лечения и медицинского обслуживания. Также основанием для выполнения Данного направления НИР являются результаты тендера Министерства обра­зования и науки РК на разработку научно-исследовательских проектов в 2006 г. и Постановление Правительства Республики Казахстан № 307 от 14 марта 2006 г. по Республиканской научно-технической программе "Разработка современных технологий для создания кластера по биотехнологии в Республике Казахстан на 2006-2008 гг.".

Необходимость таких исследований обусловлена тем, что сердечная не­достаточность является одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран. Для лечения сердечной недостаточности в Настоящее время используют широкий спектр лекарственных препаратов и Немедикаментозных методов, таких как коронарное шунтирование, кардио-^оюпластика, искусственное сердце, трансплантация сердца, ультрафильтра-

83

ция и др. Между тем частота развития и распространенность ее в человеческой популяции нарастает, именно поэтому существует необходимость в разработке принципиально новых, доступных и эффективных методов коррекции сердечно^ недостаточности. В этом плане разработка метода культивирования ГСК с последующей дифференциацией в кардиомиоцитоподобные клетки даст большой сдвиг в отечественной науке и в клеточно-заместительной терапии при лечении заболеваний сердечно-сосудистой патологии.

Анализ научной и патентной литературы показывает, что исследование взрослых стволовых клеток уже показало большие перспективы в лечении многих болезней, связанных с дегенерацией ткани — инфарктов, инсультов болезней Паркинсона и Альцгеймера, сахарного диабета [8—10]. Результаты экспериментов на животных показали, что взрослые СК могут восстанавливать поврежденные ткани сердца, оказывать положительное действие после инсуль­тов и устранять диабет. Уже сейчас взрослые стволовые клетки успешно при­меняют в лечении системной красной волчанки, рассеянного склероза, артрита и многих других заболеваний человека. Поэтому с научной точки зрения про­должение работ с эмбриональными стволовыми клетками не является жизнен­ной необходимостью, не говоря уже о моральных и этических вопросах [8].

Методы получения клеток и их применение в медицине разработаны или разрабатываются в различных исследовательских учреждениях ряда государств, включая Россию. В Республике Казахстан аналогичные работы до настоящего времени не проводились, и разработка методов получения и применения кардиомиоцитов из ГСК человека является весьма актуальной задачей, имеющей не только научную, но и практическую значимость.

Выбор направления исследований

В современном мире биотехнологическая отрасль исследований СК является одной из наиболее приоритетных и наукоемких областей человеческой деятельности. Авторитетный в научном сообществе журнал "Science", подводя итоги развития биологической науки в XX в., на третье место после открытия двойной спирали ДНК и расшифровки генома человека поставил открытие в человеческом организме клеток-предшественников, т. е. СК. Эти клетки способны при определенных условиях превращаться в нервные, костные, мышечные и кровяные клетки. Идея регенеративной терапии с использованием своих или чужих СК, а также использование специфических факторов роста, которые стимулируют выход СК в периферический кровоток, на сегодняшний день уже стала реальностью.

Анализ современных тенденций и факторов развития биотехнологии СКй развития клеточных технологий в лечении ряда серьезных заболеваний человека свидетельствует о том, что ведущие страны мира прилагают значительные усилия, чтобы эта область исследований развивалась опережающими темпами. В 2004 г. объем капитальных вложений в разработку клеточных технологий вырос более чем в 5 раз по сравнению с 1998 г. Созданы и создаются крупнейшие научно-исследовательские центры как в развиты* западных странах, так и в азиатском регионе (Корея, Сингапур, Япония). 1

При этом большое внимание уделяется клеточным технологиям) основанным на трансплантации СК, полученных от самого больного

84

Преимущества этих технологий заключаются в доступности подходящего _нейМмуногенного клеточного материала (приемлемый источник — костный _м0зг). Получены экспериментальные данные, указывающие на перспектив­ность применения аутологичных костно-мозговых стволовых клеток, которые пя счет морфогенетической функции своих лимфоцитов, а также ГСК способны обеспечить регуляцию восстановительных процессов в органах различного фенотипа, а также в лечении тяжелых неврологических и сердечно-сосудистых расстройств [9—13].

Одно из главных препятствий широкому применению в клинике взрослых стволовых клеток—проблемы с их размножением вне организма. Дело в том, что истинных плюрипотентных СК во взрослых тканях крайне мало, а когда их удается выделить и перевести в лабораторную культуру, они быстро начинают дифференцироваться в специализированные клетки той ткани, из которой были получены. При этом утрачивается одно из самых ценных их свойств — возможность превращаться в клетки других типов. Поэтому размножить взрослые стволовые клетки без потери ими "стволовости" до сих пор было почти невозможно.

Ученые из Whitehead Institute [14] открыли способ увеличить число взрослых стволовых клеток без изменения их качеств в 30 раз — это в 10 раз больше, чем удавалось кому бы то ни было до сих пор.

Изучая ГСК фетальных тканей мыши, ученые обнаружили популяцию клеток, которые сами не были стволовыми, но взаимодействовали с ними, позволяя им делиться и сохранять их "стволовость". При совместном культивировании этих новооткрытых клеток со стволовыми последние хорошо размножались в культуре.

Чтобы выяснить, благодаря каким белкам происходит это взаимодействие, был исследован профиль генетической экспрессии этих клеток и обнаружены гены, активные только в них. Один из них кодирует фактор роста IGF-2. Этот белок был выделен и при добавлении в культуральную среду и давал возможность увеличить численность ГСК в 8 раз. Затем были открыты еще два фактора роста, названные angptl-2 и angptl-З (сокращение от Angiopoietin-Uke 2 и 3). Использование при культивировании ГСК всех трех новых факторов роста и позволило увеличить их число в 30 раз [ 14].

Если удастся повторить эти результаты на человеческих ГСК, откроется множество новых возможностей—как для исследовательских работ, так и для клеточной терапии. Например, если будет можно размножать ГСК, гораздо более широкое применение найдут трансплантации СК пуповинной крови. В Данный момент ограничение связано с тем, что СК в одном образце пуповинной ^кРови недостаточно для взрослого реципиента, а использование крови от нескольких доноров значительно увеличивает риск отторжения.

Для генной терапии многих врожденных заболеваний у пациента берут СК,

Методами генной инженерии блокируют работу мутантного гена и вводят в

"Их нормальный ген. Затем эти клетки возвращают пациенту, но бывают

ДУчаи, когда из-за неправильной работы вектора переноса активируются

Нкогены и начинается канцерогенез. Если такие генно-инженерные СК могли

^bI быть размножены в лаборатории, можно было бы провести отбор на

85

отсутствие нежелательных изменений и только после этого вводить пациенД Исследования в этом направлении продолжаются в сотрудничестве со шведским Lund University с целью повторить эти эксперименты с ГСК пуповинной крови человека[14].

Переход этот обусловлен в первую очередь тем, что в отличие от медика­ментозного и хирургического методов лечения, при которых пытаются сохра­нить то, что еще пока не уничтожено инфарктом, при трансплантации СК возможно создание новых устойчивых ростков нормально функционирующее здоровой ткани в миокарде. В результате этого и наблюдаются более положи­тельные результаты, по сравнению с классическими способами лечения [151,

Сегодня клеточной кардиомиопластикой при сердечно-сосудистых заболеваниях занимаются в ведущих клиниках Европы, Азии, США и России (Москва, Владивосток, Иркутск, Томск, Новосибирск и др. крупные города), Накоплены неопровержимые доказательства безопасности и эффективности этого метода. В Казахстане в настоящее время эта область исследования практически не развита.

Учитывая вышеизложенное, разработка методов получения и применения кардиомиоцитов из ГСК человека для лечения больных методом трансплан­тации является крайне актуальной задачей, имеющей научно-практическое значение.

Для достижения поставленной цели нами были использованы современные методы клеточной биотехнологии. В соответствии с организационно-методическим планом работ по проекту в задачу наших исследований входило:

1. Разработка оптимальных методов получения первичного материала, содержащего гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) человека из различных источников (костный мозг, пуповинная и периферическая кровь).

2 Определение условий краткосрочного хранения и транспортирования первичного материала, содержащего ГСК.

3. Разработка методов выделения ГСК человека из различных источников.

3. Разработка и совершенствование методов культивирования ГСК человека ex vivo.

Выполнение исследований по данной проблеме обеспечит разработку технологии получения и культивирования кардиомиоцитов из ГСК человека с последующим применением в клеточно-заместительной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Общая характеристика и источники гемопоэтических стволовых клеток.

Гемопоэтические стволовые клетки — предшественники клеток, циркулирующих в крови, которые способны многократно делиться й дифференцироваться в различные популяции лейкоцитов, эритроцитов И тромбоцитов. ГСК образуют все разнообразие клеток крови, определяющих иммунитет, борющихся с инфекциями, переносящих кислород и участвующих в процессах свертывания крови. ГСК характеризуются мультипотентностьЮ и дают начало клеточным линиям, конечные элементы которых образуют форменные элементы крови, а также ряд специализированных тканевых клеток иммунной системы. Потенциал образования клеточной массы у ГСК огромен СК костного мозга ежедневно продуцируют 10" клеток, составляющих фор'

86

_нцые элементы периферической крови. Как и все стволовые клеточные ^ _сурсы, ГСК присутствуют в костном мозге в весьма незначительных коли­чествах, что обусловливает определенные трудности при их выделении [4,16]. Иммунофенотипически ГСК человека характеризуются как CD 34⁺ озитивные клетки, способные мигрировать в кровеносное русло и заселять ₀ганы иммунной системы или репопулировать строму костного мозга. ГСК _е являются наиболее незрелыми клетками костного мозга, а происходят от _редшественников, к которым относят фибробластоподобные негативные клетки. Установлено, что клетки с фенотипом CD 34^-негативные способны к вьгходу в общий кровоток, где меняют свой фенотип на CD 34⁺ позитивные, но при обратной миграции в костный мозг под влиянием микроокружения вновь становятся CD34" негативными клеточными элементами. В состоянии покоя CD 34' негативные клетки не реагируют на паракринные регуляторные сигналы стромы (факторы роста, цитокины). Однако в ситуациях, требующих усиления интенсивности кроветворения, СК с фенотипом CD 34" негативные отвечают на дифференцированные сигналы образованием как гемопоэтических, так и мезенхимальных клеток-предшественников [4].

ГСК считаются наиболее изученным источником СК, что во многом связано с их использованием в клинике при трансплантации костного мозга. Присутствие в костном мозге клеток с фенотипом CD 34~, являющихся родоначальниками как мезенхимальных, так и гемопоэтических СК, поставило вопрос о существовании наиболее ранних, приближенных к CD 34~ негативным клеткам предшественников клеточной дифференцировки в стромальную и гемопоэтическую линии.

Для функциональной характеристики выделенных ГСК используют их способность создавать колонии зрелых форменных элементов крови в культуре. Анализ сформированных колоний позволяет идентифицировать и количественно оценить типы клеток-предшественников, степень их коммитирования, а также установить направление их дифференцировки. Клоногенная активность определяется в полутвердых средах на метилцел-люлозе, агаре, плазменном или фибриновом геле, снижающих миграционную активность клеток, что предотвращает их прикрепление к поверхности стекла или пластика. В оптимальных условиях культивирования клоны из одиночной клетки развиваются за 7—14 дней. Учитывается количество клеток, способных образовать колонию (колониеобразующие единицы—КОЕ или колониеобра-³Ующие клетки — КОК). Следует заметить, что параметры КОЕ и КОК не соответствуют количеству ГСК в клеточной суспензии, хотя некоторые авторы Щ коррелируют с ним, что еще раз подчеркивает необходимость определения Функциональной активности ГСК in vitro.

Поиск возможностей более качественного выделения ГСК продолжается. ^иДнако стволовые кроветворные клетки морфологически подобны лимфоци­там и представляют собой относительно однородную совокупность клеток с почти круглыми ядрами, мелкодисперсным хроматином и небольшим Количеством слабо базофильной цитоплазмы. Точное их количество ^цРеделить тоже сложно. Допускается, что ГСК в костном мозге человека ^СтРечаются с частотой 1 на 10⁶ ядросодержащих клеток.

87

Для улучшения качества идентификации ГСК проводится последова­тельное или одновременное исследование спектра мембранносвязанны* антигенов, причем ГСК с фенотипом CD 34⁺CD 38~ клетки должны сочетаться с отсутствием маркеров линейной дифференцировки, особенно антигенов иммунокомпетентных клеток, таких как CD 4 [19].

Более перспективным для идентификации ГСК следует признать CD 133 антигенный маркер клеток-предшественников гемопоэза, экспрессия которого впервые выявлена на клетках эмбриональной печени. CD 133—трансмембран-ный гликопротеид, который появляется на поверхности клеточной мембраны на самых ранних этапах созревания ГСК, не исключено, что даже раньше чем антиген CD 34 [19].

Петренко А. и Грищенко В. [18] отмечают существенные отличия иммунологических свойств и способности к восстановлению кроветворения ГСК разного происхождения, что обусловлено неодинаковым соотношением содержащихся в их источниках ранних полипотентных и поздних коммитиро-ванных клеток-предшественников. Кроме того, ГСК, полученным из различных источников СК, присущи количественно и качественно совершенно иные ассоциации не гемопоэтических клеток.

Традиционным и более изученным источником ГСК является костный мозг. Суспензию клеток костного мозга получают из подвздошной кости или грудины методом вымывания под местной анестезией. Полученная таким образом суспензия гетерогенна и содержит смесь ГСК, стромальных клеточных элементов, коммитированных клеток-предшественников миелоид-ной и лимфоидной линий, а также зрелые форменные элементы крови. Количество клеток с фенотипом CD 34⁺ среди мононуклеаров костного мозга составляет от 0,5 до 3,6%. В периферической крови после индуцированной мобилизации гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF) ГСК содержится от 0,4 до 1,6%. В пуповинной крови содержание клеток с иммунофенотипом CD 34⁺ составляет около 0,6% [4].

Трансплантированные ГСК способны восстанавливать систему кроветво­рения при ее поражении вследствие болезни или химиотерапии основного заболевания.

Первые исследования по экспериментальной трансплантации костного мозга почти 50 лет назад начинались с анализа выживаемости животных при тотальном их облучении с последующей инфузией кроветворных клеток костного мозга.

Ученые сумели доказать особые свойства костного мозга человека. Ока­залось, что в нем содержится в 10 раз больше СК, чем в любом другом органе и пересадку костного мозга уже давно применяют для лечения иммуноде-фицитов и злокачественных заболеваний крови. Этому свидетельствуют существующие в настоящее время медицинские банки данных, где собраны сведения о потенциальных донорах костного мозга.

Качество трансплантата зависит не только от количества содержащихся в нем CD 34⁺ клеток, но и от их функциональной активности, которую можно оценить только по уровню пролиферативной активности путем оценки колониеобразования in vivo и in vitro [19]. Максимальное количество CD 34⁺

88

_леток (24,6%) обнаружено в трансплантационном материале, полученном з фетального костного мозга. Костный мозг взрослого человека содержит л i% CD 34⁺ позитивных клеточных элементов. При этом колониеобразую-пая способность CD 34⁺ клеток фетального костного мозга в 2,7 раза превы­шает возможности колониального роста костно-мозговых гемопоэтических _кЛеток взрослого человека, а клетки пуповинной крови формируют значительно больше колоний, чем кроветворные элементы, выделенные из _ерИферической крови взрослых людей, — 65,5 и 40,8 колоний 10⁵ клеток, соответственно.

Следующим ценным источником ГСК, перспективным по пролифератив-_ному потенциалу и репопуляционным возможностям кроветворных клеток, является пуповинная кровь. Неоднократно было показано, что к моменту родов пуповинная кровь содержит достаточно большое количество слабо коммитированных клеток-предшественников гемопоэза [20,21].

Особенностью ГСК является экспрессия на их поверхности антигена CD 34. Клетки с иммунофенотипом CD 34⁺ обладают высокой пролиферативной и клоногенной активностью, поэтому антиген CD 34⁺ считается широко распространенным маркером стволовых клеток. Определение количества CD 34⁺ клеток в пуповинной крови является ее важным показателем. Стволовые клетки относятся к ядросодержащим клеткам, поэтому важной характеристи­кой пуповинной крови является количество ядросодержащих клеток, которое в настоящий момент является стандартной оценкой трансплантата из пуповинной крови [22— 25].

Широкому внедрению в практику ГСК пуповинной крови способствовали не только простота и доступность получаемого исходного материала, но и другие важные свойства СК такие, как реконструкция гемопоэза, восстанов­ление клеточного и гуморального иммунитета, реакции трансплантата против клеток опухоли реципиента. Эти свойства делают ГСК пуповинной крови незаменимым при лечении онкогемотологических заболеваний и болезни крови любого генеза.

Использование пуповинной крови в качестве источника ГСК для трансплантации получило значительное распространение в последние десять лет, особенно в практике лечения педиатрических пациентов. В настоящее время в мире проведено более 5000 трансплантаций пуповинной крови [26,27], из них 6 трансплантаций проведено в России [28].

Пуповинная кровь как источник ГСК обладает рядом преимуществ, среди которых:

•быстрая и безболезненная процедура сбора;

•возможность получения и длительного хранения аутологичных, родственных и неродственных аллогенных образцов, тестированных и HLA-типированных, непосредственно готовых к использованию;

• сниженная вероятность развития острой и хронической формы реакции трансплантат против хозяина;

•возможность проведения трансплантаций с неполной HLA-совмести-мостью;

• сниженная вероятность вирусной контаминации трансплантата;

89

• возможность получения образцов от представителей редких этнических меньшинств и детей от смешанных браков.

Повышение частоты использования пуповинной крови в качестве источника ГСК привело к необходимости создания специальных хранилищ — банков пуповинной крови, в которых образцы сохраняют в течение длительного времени без потери трансплантационного потенциала [24].

Все это обусловливает необходимость развития эффективных методов 1 получения и хранения ГСК из указанных источников, а также отработки методов забора образцов, сепарации, культивирования и криоконсервации ГСК до и после культивирования в полусинтетических питательных средах.

Методы получения первичного материала, содержащего гемопоэтические стволовые клетки.

Учитывая малые объемы крови, которые можно собрать из плаценты J (в среднем не более 100 мл), на передний план выступает необходимость получения максимального количества крови из вены, а также снижения риска | бактериальной контаминации образцов пуповинной крови (ПК).

Сбор пуповинной крови осуществляется после рождения ребенка и отде- 1 ления его от последа, когда плацента еще находится in utero или после ее рождения — ex utero, а также при кесаревом сечении (ex utero). Bertolini F.h 1 др. [29] установили, что если с момента рождения до отделения новорожденного от плаценты проходит не более 30 с, то собираемый объем крови в среднем на 25—40 мл больше, чем при более позднем отделении ребенка. Ими также отмечено, что раннее отделение ребенка от последа не влечет за собой каких- I либо отрицательных последствий для новорожденного. Эту точку зрения подтвердили и Lazzari L. и др. [30].

Для получения ПК предложены открытые и закрытые системы сбора.

Для снижения риска ятрогенного инфицирования и загрязнения материн- | скими выделениями Rubinstein Р. и др. [31] предложили использовать закрытую систему сбора, основанную на широко применяемой трансфузионной системе Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, USA, с 62,5 мл CPD A (citrate-phos-J phate-dextrose, with adenine) в качестве антикоагулянта. При этом жизнеспо- I собность клеток ПК не снижалась при хранении крови в течение 36 часов, даже если объем ее составлял 10 мл. Объем крови, собираемой таким способом, в среднем составлял 64 ± 27 мл. Собирать ПК можно и в тот момент, когда плацента еще находится in utero.

По данным Boyse E.A. и др. [32], количество крови, собираемой таким способом, в среднем составляло 55 ± 25 мл. Kogler G. и др. [33], собирая ПК закрытым способом (574 образца ПК), получили большие объемы крови в среднем 79 ± 26 мл. Ими отмечено, что около 7% образцов ПК содержало менее 40 мл крови, поэтому такие экземпляры ПК не включались в число 1 потенциальных трансплантатов. Abdel-Mageed C.E. и др. [34] путем катетеризации пуповинной вены удалось получить в среднем 94 мл крови (56—143 мл). Isoyama К. и др. [35], собирая ПК путем активной эксфузии при помощи шприцов, заготавливали в среднем 69,1 мл крови (объем ПК варьировалот15до135мл). NaglerA. идр. [36] сравнили три метода сбора ПК:

_I

• при помощи эксфузии крови непосредственно в контейнер (закрытый способ);

• путем активной эксфузии крови шприцами с дальнейшим промыванием вен плаценты и одновременным дренированием крови в контейнер (открытый способ);

• посредством активного извлечения крови шприцами и промывания через артерию пуповины с одновременной эксфузией в контейнер (полу­открытый способ).

В первом случае они получили ПК в объеме 76,4 ± 32,1 мл с содержанием лейкоцитов 10,5 ± 3,6x106 мл; во втором — 174,4 ± 42,8 мл и 8,8 ± 3,4x106 мл лейкоцитов; в третьем — 173,7 ± 41,3 мл и 9,3 ± 3,8x106 мл лейкоцитов в крови. При использовании второго метода сбора было отмечено более частое инфицирование образцов ПК, чем при первом или третьем. Кроме этого, авторами установлена зависимость между массой плаценты и объемом извлекаемой крови, т. е. при большей массе плаценты количество собираемой ПК, как правило, возрастает.

Сбор ПК осуществляют после срочных родов естественным путем или кесарева сечения. В большинстве центров пуповинную кровь собирают после отхождения последа (ex utero), такой сбор может быть осуществлен вне родовой палаты специально обученным персоналом. Возможно проведение сбора ПК при нахождении плаценты в полости матки (in utero). Данный способ позволяет собрать больше лейкоцитов, но требует присутствия дополнительного персонала при родах. В основном для сбора предпочитают использовать закрытые стерильные контейнеры для донорской крови с внесенным антикоагулянтом и дренажной иглой [37]. Объем крови, которую получают из пуповины, в среднем составляет не более 100 мл [20].

Несколько лет назад СК получали только из костного мозга, который содержится в плоских костях. Для этого у донора под наркозом производили прокол кости таза и забирали шприцом необходимое количество костного мозга. После такой процедуры донор несколько дней в специализированном стационаре находился под наблюдением врача.

Необходимо заметить, что такой способ получения трансплантата практикуется и до сих пор и не имеет каких-либо серьезных осложнений. Тем не менее, в настоящее время появился более совершенный способ получения ГСК у донора—из периферической крови. При этом донор проводит несколько часов в кресле для взятия крови (смотрит телевизор или читает), кровь из вены на одной руке проходит через специальный прибор для сепарации нужных Для трансплантации ГСК и возвращается в кровяное русло донора через вену на другой руке. После такой процедуры донор практически не теряет объем крови, а восстановление взятых клеток происходит в течение первых же 7—10 Дней после процедуры. За исключением некоторых ситуаций донору, как правило, предоставляется возможность самому решать, каким способом он будет сдавать клетки крови.

Краткосрочное хранение и транспортировка первичного материала.

Доставка образцов пуповинной крови для ее обработки и длительного ^хРанения нередко осуществляется из регионов, удаленных от гематологических

91

центров. В этой связи возникает важный вопрос о возможных сроках хранения пуповинной крови до момента ее криоконсервирования, особенно при создании больших хранилищ, таких, как банки пуповинной крови [38— 41]. Юрасов С. в, и др. [42] показали, что при хранении ПК при комнатной температуре (22° С) или при 4° С в течение 24-^8 ч жизнеспособность клеток ПК принципиально не снижалась и составляла, соответственно, 92% и 88%. Однако при хранении образцов крови в течение трех суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Abdel-Mageed А. и др. [43] и Hubl W. и др. [44] в своих исследованиях показали, что при хранении в течение 2—3 суток при комнатной температуре или при 4° С прежде всего страдает жизнеспособность гранулоцитов, а не гемопоэтических клеток. Machalinski В. и др. [45] изучили влияние различных антикоагулянтов, которые связывают ионы кальция (ACD, EDTA, XAPD—1), на гемопоэтические предшественники при хранении ПК от 24 до 72 часов и выявили их отрицательное влияние на ЯСК. Machalinski В. и др. [45] рекомендовали использовать PBS (раствор фосфатного буфера) с добавлением нативного гепарина без консерванта в дозе 20 UED/мл. Такой антикоагулянт, по их мнению, позволял увеличить длительность хранения нефракционированной ПК до 72 ч, с удовлетвори­тельной сохранностью КОЕ (от 78 до 92%). Shlebak А. А. и др. [46], изучая сохранность КОЕ-ГМ и КОЕ-Г, показали, что время хранения пуповинной крови не должно превышать 9 ч.

Методы выделения гемопоэтических стволовых клеток человека из первичного материала.

Целью выделения ядерных клеток из пуповинной крови является уменьшение общего объема крови для дальнейшего замораживания клеток (экономия места) и удаление эритроцитов из-за опасности развития гемолитической реакции при трансфузии клеточной взвеси, несовместимой по эритроцитарным антигенам (А, В, 0, резус и др.).

Удаление эритроцитов можно проводить с помощью лизирующих растворов, содержащих хлорид аммония. Сохранность ГСК после лизиса эритроцитов достаточно высока, однако данный способ не применяют при банкировании в связи с необходимостью использовать очень большие объемш реагентов. Этот метод оправдан при обработке небольших объемов крови для лабораторных и диагностических исследований [47].

Для удаления эритроцитов и плазмы образец можно фракционировать методом простого центрифугирования (эффективно при обработке непосредственно после получения) или с помощью градиентов плотности [48].

Наибольшее распространение получил метод выделения ядросодержащих клеток в градиенте плотности фиколла. Сепарация в градиенте плотности позволяет получить преимущественно мононуклеарные клетки, но приводит к значительным потерям гемопоэтических предшественников (от 30 до 50%) [32]. Сепарация в градиенте плотности, где в качестве основы использую"¹ фиколл (Ficoll-Hypaque) с плотностью d- 1,077 г/мл или перколл (Percoll)^c плотностью d= 1,069 г/мл, является одним из наиболее распространенны* методов сепарации при лабораторных исследованиях. Сохранность ГСК после сепарации в градиенте плотности составляет 92%, а потеря клеток пр"

92

использовании перколла меньше, чем при использовании фиколла [49]. использование перколла с плотностью 1,080 г/мл позволяет уменьшить объем пробы пуповинной крови до 10 мл, а содержание ГСК в таком объеме достаточно для проведения трансплантации пациенту с весом менее 10 кг [50]. использование градиентов плотности растительного происхождения позволяет удалить значительное число эритроцитов, однако при последующей _криоконсервации вещества полисахаридной природы могут приводить к осмотическому шоку и гибели ГСК. Важными недостатками данного метода является его длительность (около 2,5 часа) и необходимость использования иромежуточных емкостей, прямо контактирующих с биологическим материалом, что повышает вероятность контаминации образца.

Для седиментации и последующего удаления эритроцитов могут быть использованы такие агглютинирующие вещества, как желатин, полиглюкин и гидроксиэтиленкрахмал. Седиментация с помощью 3% раствора желатина позволяет сохранить до 86% ГСК и удалить 96,4% эритроцитов, эта процедура занимает меньше времени, чем сепарация в градиенте плотности: 1,5 ч вместо 2,5 [20, 51]. Несмотря на значительный уровень деплеции эритроцитов и высокую сохранность ГСК, серьезной проблемой является способ получения желатина. Желатин—вещество ксеногенного происхождения, которое перед использованием не тестируют на присутствие инфекционных агентов. После криоконсервации желатин очень сложно удалить, поэтому в медицинской практике трансплантаций отказались от его использования для подготовки образцов пуповинной крови к хранению.

Полиглюкин также используют для осаждения эритроцитов в образцах пуповинной крови. При оптимальном соотношении полиглюкина и пуповинной крови 1:1 уровень деплеции эритроцитов составляет около 97%. Важно отметить, что после использования полиглюкина нет необходимости проведения отмывок образцов [52].

Наиболее распространенный метод неавтоматической сепарации пуповинной крови, предложенный Rubinstein et al. в 1995 г. [49], основан на ускорении седиментации эритроцитов при добавлении 6% гидроксиэтиленкрах-мала. После удаления осевших эритроцитов получают надосадок, обогащенный лейкоцитами. Последующее центрифугирование (400 х g, 15 мин) позволяет осадить клетки и удалить плазму, уменьшая объем пробы. Сохранность ГСК при использовании данного метода составляет 87,4%, а его стоимость в 2,2 и 4,1 раза ниже, чем стоимость методов, основанных на применении перколла и Фиколла соответственно [53].

Современным направлением фракционирования пуповинной крови является использование систем фильтров и автоматических сепараторов. В системе StemQuickTM (Asahi Medical, Japan) в качестве фильтра используют Многослойный нетканый полиэтилен терефталат, покрытый гидрофильным полимером. При фильтрации крови с внесенным антикоагулянтом эритроциты ^ тромбоциты проникают через поры в собирающий (стоковый) контейнер, а Фильтр задерживает лейкоциты. На втором этапе потоком жидкости (раствор ^На основе альбумина сыворотки человека и декстрана 40 в соотношении 3:16) "Лросодержащие клетки смывают с поверхности фильтра в специальный

93

контейнер. Данный метод позволяет выделить 79,5% лимфоцитов, средня» длительность процедуры — 30 мин [54]. В опытах с NOD/SCID мышами прц исследовании приживления ГСК, полученных в результате фильтрации пуповинной крови, не было обнаружено различий по сравнению _с приживлением ГСК из образцов цельной ПК [55].

Методы культивирования ГСК человека in vitro.

Другим интенсивно развиваемым направлением является так называемое раз­множение количества ГСК ex vivo. Под этим термином из английского языка на самом деле понимается обогащение ГСК, производимое in vitro. Эта про­цедура требует сложных методов биологического культивирования и специаль­ных методов сохранения ГСК [56—59]. Используя различные методики культи­вирования ГСК, можно увеличить число ядросодержащих ГСК до 20 раз (в биореакторах до 1000 раз) в исходной клеточной культуре. В опытных условиях показано, что культивирование клеток CD 34⁺ из пуповинной крови в присут­ствии цитокинов в течение 14 дней более значительно усиливает клеточный потенциал трансплантата, чем аналогичное культивирование в течение 7 суток. Разрабатываются и более эффективные новые методы культивирования. Один из них состоит в том, чтобы создать условия в культуре, когда при увеличении числа СК будут блокированы возможности их дифференцировки [4].

Существуют также методы культивирования ГСК, где клеточную суспензию, полученную из пуповинной и периферической крови, а также костного мозга высевают на фидерный слой (эмбриональные фибробласты мыши или стромальные клетки человека). Посевная концентрация составляет от 3 х 10⁴ до 2 х 10⁵ кл/мл. Для культивирования используют смесь питательных сред RPMI—1640 и IMDM в соотношении 1:1, содержащую 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глюта-мина, 5 х 10~⁵ 2-меркаптоэтанола и 10% фетальной сыворотки теленка. Для культивирования по Декстеровскому типу использовали питательную среду IMDM, содержащую 50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 20% лошадиной сыворотки и Ю^-6 М гидрокортизона. Клетки, выращенные в среде по Декстеровскому типу, производят только миелоидное дифференцирование [60].

Таким образом, как было выше сказано, при выделении ГСК из первичного материала количество клеток совершенно недостаточно для проведения эффективной клеточной терапии взрослому человеку. Следовательно, отработка методов культивирования ГСК в условиях in vitro является основной задачей при выполнении данного проекта НИР.

Материалы и методы исследований.

Образцы крови:

— лейкоцитарная масса из пуповинной крови, предоставленная ТОО "Стэмкорд";

—лейкоцитарная масса из периферической крови, предоставленная РГП "Национальный научный центр хирургии" (ННЦХ) им. А. Н. Сызганова.

Реактивы, среды и растворы, оборудование.

Для проведения исследований использовали готовые жидкие питательные среды, а также среды, изготовленные из отдельных компонентов "

94

аминокислот, витаминов, неорганических солей, глюкозы, антибиотиков. Для _прцготовления сред и растворов использовали:

—14 аминокислот в L-форме (аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лгейцин, дизин, метионин, серии, треонин, тирозин, триптофан, фенилаланин, щистин, _гЛутамин) производства фирм "Sigma" (США), "Мегск", "ROTH" (Германия), «флюка" (Швейцария);

— 8 витаминов (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, инозит, никотинамид, пантотенат, фолиевая кислота, холинхлорид) производства фирм "Sigma" и "Мегск";

—10 неорганических солей производства стран СНГ и зарубежныж фирм классификации "осч" и "фарм";

• глюкоза кристаллическая (Sigma);

• феноловый красный производства (Sigma);

• мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ).

• питательная среда ПСП;

• питательная среда ДМЕМ/П2 (Sigma);

• питательная среда L-15 (Sigma);

• питательная среда RPMI-1640 (Sigma);

• 0,25% раствор трипсина (Sigma);

• 0,02% раствор версена;

• раствор гепарина для инъекций;

• актрапид^к НМ (инсулин);

• лизирующийраствор(114mMNH₄CI;7,5мМКНС0₃; ЮОмкМЕША);

• Ficoll-Paque с плотностью d = 1,077 г/м "Pharmacia";

• 3% раствор желатина;

• раствор Хенкса;

• фетальная сыворотка крови КРС для культур клеток (Sigma);

• 6% раствор глютамина (Sigma);

• набор для изоляции CD 34⁺ прогениторных клеток человека;

• набор для изоляции CD 133⁺ прогениторных клеток человека;

• бензилпенициллин натриевая (калиевая) соль;

• стрептомицина сульфат;

• водадеионизированная;

• камера Горяева;

• 1%-ный раствор трипанового синего;

• пресепарационный фильтр;

• колонки MS.

Изготовление, контроль качества и хранение питательных сред и растворов осуществляли согласно прилагаемым к препаратам инструкциям и наставле­ниям, а также по инструкции, отработанной в институте [61].

При проведении НИР использовали следующее оборудование:

• проточный цитофлуориметр FACSCalibur фирмы Becton Dickinson (США);

• иммуномагнитный сепаратор MiniMACS фирмы Milteny Biotech (Германия);

• С0₂-инкубатор Flow Laboratories (Англия);

95

• низкоскоростная рефрижераторная центрифуга J6-HC Beckman-Coul- I ter(CIIIA);

• инвертированный микроскоп со встроенной цифровой видеокамерой KRUSS (Германия);

• инвертированный микроскоп Olympus CK2-MVR (Япония);

• шкаф биобезопасности Sterildard-Ш, Advance (США);

• система фильтрации питательных сред и сывороток крови Millipore (США);

• низкотемпературный холодильник Sanyo Ultra Low (Япония);

• системы высокой очистки воды Water Pro Ro PS/UF, Labconco (США);

• автоматические микропипетки, Eppendorf (Германия). Методы исследований.

Сбор пуповинной и периферической крови и транспортировка первичного материала.

Сбор пуповинной крови проводили открытым и закрытым способами. Открытым способом забор пуповинной крови осуществляли после рождения ребенка и отделения его от последа, когда плацента еще находилась in utero (открытый способ). Сбор осуществляли в стерильные 500 мл флаконы, содержащие фосфатно-буферный раствор с добавлением антикоагулянта (очищенный раствор гепарина без консерванта) в дозе 20 ед/мл. Для стерильного взятия пуповинной крови закрытым способом использовали специальную трансфузионную систему, содержащую антикоагулянт, и оснащенную дренажной иглой (Гемокон, Россия). Доставку указанных образцов пуповинной крови из родильного дома г. Алматы и из ТОО "Стэмкорд" осуществляли в термоконтейнерах (2—4°С) и в медицинских биксах при температуре 20°С автомобильным транспортом.

Для стерильного взятия периферической крови также использовали специальную трансфузионную систему, содержащую антикоагулянт, и оснащенную дренажной иглой (Гемокон, Россия) и в виде лейкоцитарной массы, доставленную из ННЦХ им. А. Н. Сызганова в термочемоданах при температуре 2-4°С.

Жизнеспособность клеток пуповинной и периферической крови при тран­спортировке изучали при температурах 2-^ГС и при 20°С в течение 24—48 ч.

Метод центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque.

Образцы пуповинной крови наслаивали в пробирки по 7 мл поверх 3 мл Ficoll-Paque с плотностью d = 1,077 г/м в центрифужных пробирках. Центрифугирование проводили при 1800 об/мин (921g) в течение 30 мин при комнатной температуре (20°С). После центрифугирования отбирали межфазный слой клеток в виде серовато-белого кольца с помощью стерильной иглы, соединенной через силиконовый шланг с перистальтическим насосом. Затем межфазный слой клеток разводили в питательной среде DMEM/F12 в соотношении 1:9с целью отмывки от фиколла. Отмывку проводили 3 раза в охлажденной среде DMEM/F12 следующим образом:

первая отмывка: 1400 об/мин 15 мин, 4°С;

вторая отмывка: 1200 об/мин 10 мин, 4°С;

третья отмывка: 1200 об/мин 10 мин, 4°С.

После третьей промывки клетки суспендировали в среде DMEM/F12 и подсчитывали общее количество жизнеспособных клеток методом окраши­вания 1% раствором трипанового синего с помощью камеры Горяева.

Метод выделения клеток с помощью лизирующего раствора.

В образец пуповинной крови добавляли лизирующий раствор, состоящий из хлорида аммония, гидрокарбоната калия и натриевой соли этилендиамин-тетрауксусной кислоты, в соотношении 1:9. Полученную смесь пуповинной крови с лизирующим раствором выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре (20°С). По истечении данного времени проводили центрифуги­рование при 1000 об/мин в течение 15 мин. После этого надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде DMEM/F12 и определяли количество жизнеспособных клеток путем окрашивания 1% раствором трипанового синего с последующим подсчетом неокрашенных клеток в камере Горяева. При использовании лизирующего раствора для дальнейших работ отбирали осадочный слой клеток.

Методы получения мононуклеарной фракции пуповинной крови человека с использованием желатина.

Цельную гепаринизированную кровь наслаивали на 3% раствор желатина в соотношении 1:3. Седиментацию эритроцитов проводили при комнатной температуре в течение 40 мин. Затем отбирали 1/3 часть верхнего слоя, содер­жащую мононуклеарную фракцию крови, а осадок отбрасывали. Далее с целью избавления от желатина отобранную мононуклеарную фракцию разбавляли питательной средой в соотношении 1:10 и проводили центрифугирование при 1000 об/мин в течение 15 мин. Отмывку проводили 3-кратно, как указано выше.

В полученной клеточной суспензии определяли содержание общего количества клеток и их жизнеспособность с использованием 1% раствора трипанового синего.

Определение содержания CD 34⁺ клеток в образцах пуповинной крови и исследование на наличие посторонней инфекции.

В полученных 9 образцах пуповинной крови было определено количество CD 34⁺ клеток с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur. Проточная цитофлуориметрия основана на анализе оптических свойств единичных клеток в потоке. Окрашенная флуорохромами фикоэритрин (РЕ) и FITC (Fluorescein isothiocyanate) суспензия клеток подается в специальную камеру, где с помощью гидродинамической фокусировки обеспечивается прохождение клеток через точку анализа по принципу одна за другой. В точке анализа флуоресценция флуорохрома возбуждается лазерным лучом. Далее флуоресцентный сигнал проходил через систему оптических фильтров, обеспе­чивающих выделение интересующей длины волны (цвета) и анализируется при помощи ФЭУ. Подобная система позволяет оценивать количество Флуорохрома (количество антител), находящегося (находящихся) на данной Клетке. Управление прибором, сбор данных и представление результатов осуществляются при помощи персонального компьютера. Конечный результат анализа представляется в форме двухмерных цитограмм. Исследования Проведены на базе лаборатории медицинских иммунологических препаратов Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий

97

медицинского назначения и медицинской техники Министерства здравоохра­нения Республики Казахстан (г. Алматы).

Образцы пуповинной крови исследовались на наличие 10 патогенных инфекций (гепатит А и В, ВПГ —1/11, ЦМВ, сифилис, токсоплазмоз, ВЭБ, I ВИЧ, HTLVI/II и бруцеллез) и проводились гемоцитометрические анализы ] образцов на базе лаборатории иммунологии и аллергологии ТОО "Стэмкорд" ] (г. Алматы).

Методы выделения ГСК с фенотипами CD 34⁺ и CD 133⁺ из образцов пуповинной и периферической крови с помощью иммунномагнитного сепаратора.

Выделение ГСК с помощью иммуномагнитного сепаратора состоит из следующих подготовительных этапов:

Приготовление клеток пуповинной и периферической крови.

Образцы пуповинной крови с антикогулянтом, содержащим 2 мМ EDTA I или 0,6% ACD-A в соотношении 1:4 в фосфатно-буферном растворе (ФБР), I аккуратно наслаивали на 15 мл Ficoll-Paque® в количестве 35 мл. После этого f центрифугировали на горизонтальном бакет-роторе при 400 g в течение 35 мин при температуре 20°С (без торможения). Затем удалили верхний слой, оставляя не разрушенным слой мононуклеарных клеток в интерфазе, аккуратно собирали клетки интерфазы и дважды отмывали ФБР, содержащий 2 мМ EDTA или 0,6% ACD-A, в течение 10 мин при 200 g (20°С). Полученный осадок кле- 1 ток ресуспендировали в конечном объеме 300 мкл буфера на 10⁸ общего коли­чества клеток.

Магнитное мечение CD 34⁺ клеток предшественников.

На 100 мкл FcR блокирующего реагента добавили 10⁸ клеток в объеме 300 мкл и перемешивали. Затем вносили 100 мкл гаптеновых антител (Hapten- I Antibody), вновь перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при 6°— 12°С. Конечный объем меченых 10⁸ клеток составлял 500 мкл. После этого меченые клетки аккуратно промывали с добавлением 10—20-кратного объема ФБР (5—10 мл на 10⁸ клеток), центрифугировали и полностью удалили надо-садок. Полученный осадок клеток аккуратно ресуспендировали и заполнили буфером, доводя конечный объем до 400 мкл с концентрацией клеток 10⁸.

К полученной суспензии клеток вносили 100 мкл микробусинок с антигаптеновыми антителами (Anti-Hapten MicroBeads), после чего хорошо перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при 6—12°С. После этого клеточный осадок с концентрацией 10⁸ клеток промывали и ресуспендировали в 500 мкл буфера.

Магнитное мечение CD 133⁺ клеток предшественников.

Для мечения CD 133⁺ клеток, 100 мкл FcR блокирующего реагента вносили к ресуспендированным клеткам в объеме 300 мкл с концентрацией 10⁸ клеток в фосфатно-солевом буфере, чтобы препятствовать неспецифическому связыванию антител с Fc-рецепторами клеток. Затем к меченым клеткам добавляли 100 мкл микробусинок с конъюгированными антителами к CD 133⁺ клеткам. После этого хорошо перемешали и инкубировали в течение 30 мин при 4—8°С. Отмывку клеток проводили путем добавления 10—20-кратного объема буфера с последующим центрифугированием при 300 g в течение 10 мин.

98

|Надосадок удаляли с помощью пипетки и клеточный осадок ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера. Таким образом, меченые CD 34⁺и CD 133⁺клетки из образцов пуповинной и периферической крови были готовы для проведения следующего основного этапа магнитной сепарации клеток. Магнитная сепарация меченых CD 34⁺и CD 133⁺клеток. Колонку MS с адаптером помещали в магнитное поле сепаратора MniMACS и наполнили буфером MS—500 мкл и промывали. После этого клетки пропус­кали через пресепарационный фильтр, представляющий собой нейлоновое сито с размером пор 30 мкм для удаления конгломератов клеток. Пресепара­ционный фильтр перед применением смачивали буфером. Затем очищенные клетки (меченые) помещали в колонку MS и промывали трижды буфером по 500 мкл. Колонку с мечеными клетками удаляли из магнитного поля и поме­щали ее в подходящую пробирку. На колонку наносили буфер в количестве 1 мл и смывали удержанные клетки, используя поршень, поставляемый с колонками.

Жизнеспособность полученных ГСК с фенотипами CD 34⁺ и CD 133⁺ определяли путем окрашивания 1%-ным раствором трипанового синего с последующим подсчетом в камере Горяева.

Культивирование гемопоэтических стволовых клеток. Для подбора оптимальной питательной среды культивирования ГСК использовали среды ПСП, L-15, DMEM/F12 и RPMI-1640, содержащие 20% фетальной сыворотки КРС при 37°С, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки высевали в культуральные 24-луночные плашки. Концентрацию для посева получали дополнительным разведением клеток ростовой средой и конечную концентрацию доводили до 1 х 10^б клеток на см³ среды. Во время культивирования проводили ежедневное микроскопирование культуральных плашек с культурой клеток с помощью инвертированного микроскопа. Смену среды в культуральных плашках с клетками проводили через 4—5 сут. Микрофотосъемку культуры ГСК проводили с помощью инвертированного микроскопа со встроенной цифровой камерой "KRUSS".

Результаты исследований.

Результаты определения оптимального метода забора пуповинной крови.

Количество проб и объем взятых образцов пуповинной крови открытым и закрытым способами, предоставленные сотрудниками ТОО "Стэмкорд" приведены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, при закрытом способе сбора средний объем получаемой крови составляет 102 ± 23,7, при открытом несколько меньше — 75 ± 29,5 мл. При открытом способе забора 2 пробы из четырех оказались Нестерильными, тогда как при закрытом способе все пробы, взятые с применением специальной трансфузионной системы, содержащей антикоагу­лянт и оснащенной дренажной иглой, были стерильными. Полученные данные свидетельствуют о преимуществе закрытого способа забора пуповинной крови из-за большого объема и низкой вероятности микробной контаминации. По количеству собранного материала закрытый способ также имеет преимущество Перед открытым способом.

99

Таблица 1 Сравнительные данные методов забора пуповинной крови

№ Методы Образцы Объем проб Средний объем, Стерильность,

п/п забора пупо- проб с антикоагу- мл Х±т,п = 5 МПА, МПБ,

винной крови лянтом, мл Сабуро

1. Открытый Донор № 1 60 75 ± 29,5 Нестерильно

2. способ Донор № 2 130 Стерильно

3. Донор № 3 80 Стерильно

4. Донор № 4 30 Нестерильно

5. Закрытый Донор № 1 100 102 ± 23,7 Стерильно

6. способ Донор № 2 90 Стерильно

7. Донор № 3 ПО Стерильно

8. Донор № 4 120 Стерильно

9. Донор № 5 80 Стерильно '"

10. Донор № 6 120 Стерильно

11. Донор № 7 150 Стерильно

12. Донор № 8 80 Стерильно

13. Донор № 9 70 Стерильно

Результаты определения оптимального температурного режима транспорти­ровки представлены в табл. 2.

Таблица 2 Сравнительная характеристика сохранности ядросодержащих клеток

Продолжительность Выживаемость клеток при

хранения, ч различных температурных режимах, %

2-4°С I 20°С

24 92Д 90Д

48 88,2 8^9

72 61J3 56,3

Данные, полученные нами, свидетельствуют, что при транспортировке и хранении пуповинной крови при комнатной температуре (20°С) или при 2-4°С в течение 24—48 ч жизнеспособность клеток пуповинной крови не снижалась и составляла соответственно 92% и 88%. Однако при хранении образцов крови в течение 3 суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Полученные данные по определению оптимальных условий выделения и транспортирования первичного материала также подтверждаются данными, полученными другими авторами [62—64].

Таким образом, при отработке условий транспортировки и хранения образцов пуповинной и периферической крови доставка материала должна осуществляться в течение не более чем 24 ч и при температуре не выше 2—4°С,

100

так как комнатную температуру не всегда №"~'К

возможно выдержать в условиях автотран­спорта, в особенности в летнее время.

Результаты определения оптимального метода выделения ядросодержащих клеток из образцов пуповинной и периферической крови. | ^

При использовании метода седиментации пуповинной крови на градиенте плотности Ficoll-Paque с плотностью 1,077 г/м использо­вались клеточные элементы, находящиеся в межфазном слое. Фотография образца пупо­винной крови после центрифугирования на градиенте плотности фиколла представлена на

Сравнительные результаты выделения В

мононуклеарной фракции из пуповинной А. крови методом седиментации на градиенте плотности Ficoll-Paque, обработки лизи-руюшим раствором и осаждения на 3% раство­ре желатина представлены в табл. 3.

Как видно из данных таблицы, при выделе­нии ядросодержащих клеток из первых трех образцов с использованием 3%-ного раствора

желатина было отмечено быстрое осаждение и^мгпцдг

клеточных элементов в течение первых минут в виде крупных фракций. После 40-минутной

седиментации В среде, находящейся на поверх- ^Рис- *• Центрифугирование на ности желатина, клеточных элементов обнару- градиенте плотности Ficoll- жено не было. Вследствие того, что использо- Paque.

ванный нами желатин не удовлетворял требо- ^А ~ межфазный слой

ваниям для седиментации клеток, данным мононуклеарных клеток

методом изолировать мононуклеарную фрак- пуповинной крови

цию клеток не удалось.

Выделение ядросодержащих клеток из 4 образца проводили согласно методу, описанному Raj endra N. Pahwa и др. [65], в результате чего нами были выделены клетки в количестве 1,7 млн. в указанном объеме.

Изоляция мононуклеарных клеток методом обработки пуповинной крови лидирующим раствором приводит к получению большей массы клеток по срав­нению с методом градиентного центрифугирования на Ficoll-Paque и 3%-ного раствора желатина.

Кроме того, было проведено выделение мононуклеарной фракции клеток Из лейкоцитарной массы периферической крови человека. Кровь была отобрана от здоровых доноров с помощью специальной трансфузионной системы (Гемокон, Россия), закрытым способом. Мононуклеарную фракцию Клеток из периферической крови выделяли методом градиентного центри­фугирования с использованием Ficoll-Paque. Фотография образца перифери-

101

Таблица 3 Сравнительные данные выделения ядросодержащих клеток из образцов пуповинной крови

№ Методы Объем материала Средний объем Общее коли- Среднее коли-

выделения с антикоагулянтом, материала, чество клеток, чество клеток

мл мл Х±т млн. кл. млн. кл. Х±щ

1 Градиентное 150 46,0 42,0 ± 1зУ~ центрифуги- 120 117 ±29 56,4

рование на 80 23,5 Ficoll-Paque

2 Лизирую- 150 108 ±20 61 щий 120 90

раствор 100 - 163,5 106,3 ± 35 90 110,8 80 44^9

3 3%-ный 120 95,0 ±14 - - раствор 100 —

желатина 90 — | 70 I | 1,7 |

Примечание: "—" — отсутствие клеток.

ческой крови после центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque представлена на рис. 2.

После этого отбирали меж­ фазный слой мононуклеарных мнм| клеток и проводили отмывку от

фиколла путем центрифугирования при 200 g в течение 10 мин. Затем клетки подсчитывали. Результаты по определению количества ядро­содержащих клеток представлены

Как видно из данных таблицы, полученное количество ядросо­ держащих клеток из исследуемых образцов периферической крови ■А щ достаточно для дальнейшей работы

по изоляции ГСК с фенотипами CD 34⁺ и CD 133⁺на иммунномаг нитном сепараторе MiniMACS, который позволяет выделить более 97% гемопоэтических стволовьгХ клеток. Рис. 2. Центрифугирование на градиенте Результаты определения содеР'

плотности Ficoll-Paque. ^{жания CD} ^⁺ ™^{eT0K B} образШ*

А - межфазный слой мононуклеарных ПУПОВИННОЙ крови методом прОТОЧ'

клеток периферической крови ^ной Цитофлуориметрии.

102

Таблица 4 Выделение мононуклеарной фракции клеток из лейкоцитарной массы периферической крови человека

№ Метод выделения Объем Общее Среднее

п/п материала, количество количество

мл клеток, млн. кл. клеток, млн. кл.

1 Градиентное центрифугирование 50 103,360

99,6

2 на Ficoll-Paque 50 95,840

Было исследовано 9 образцов пуповинной крови, собранной закрытым способом, на содержание CD 34⁺ клеток. В качестве контроля работы проточного цитофлуориметра был использован маркер CD 15.

График анализа полученных данных представлен в виде двухмерной цитограммы на рис. 3—11.

На данных рисунках анализа исследованных образцов пуповинной крови на левой цитограмме показана селекция лимфоцитов в соответствии с их светорассеянием. На правой цитограмме показан процент клеток в соответствии с их окрашиванием при сочетании CD 34⁺ и CD 15⁺ моноклональных антител. К примеру в образце пуповинной крови донора № 1 (рис. 3) клетки в правой цитограмме распределены следующим образом — Al(TJL) — 0,58% CD 34 положительных клеток; А2 (UR) — 0,18% CD 34 и CD 15 положительных клеток; A3 (LL)—31,66% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера; А4 (LR) — 2,7% CD 15 положительных клеток.

onko1.002 v,- qnkol.002

Pi " ,.,«..-.— ———г-'- ■ ■ ■ _■■-■■■- О-

§ " ■ '.*•:'•*. •-•■ • ''•:- ,"■" \\ I А1-о,58% | , .

• ""..:■. '•^%".. • ' ' "• '"'"*-;• • | А2-о,18%|

^{0 2Ш} ""Ч^и^{600 ш 1шо S} id*'"'*]к>'' ' '"То* 'к? ю⁴

^F&C"^H , 1— , FL1-H

| А3-31,66%|

Рис. 3. Образец пуповинной крови донора № 1

А1 — 0,58% CD 34 положительных клеток;

А 2 — 0,18% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 31,66% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—2,7% CD 15 положительных клеток.

юз

_V

onkol.002 » onto 1.002

S"T~ "i I A 1-2.1% I . ,

"..I^-. i^% '.-• ' - ' %'*'■; | A2-0.23% [

о 200 400_fsc__h60o 800 looo ^s itf p& "7₀^г io' io'

|A3-33,95%| ^FL1"^H

Рис. 4. Образец пуповинной крови донора № 2

А1 — 2,1 % CD 34 положительных клеток;

А 2—0,23% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 33,95% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—2,3% CD 15 положительных клеток.

onkol.002 -'„-, onko 1.002

8: ' . •;.• ■ !

" : ■'. •' . ..-,". ".'.'• » * .'« •'••• V." : | Д1-2,4% | | А2-0,19% |

0 200 "«'рзсн⁶⁰⁰ ^ ^1Ш0 3 /₀о^Т¥"У°^ ' ^2 ■ '■ ■ ""^з 'ft 1

|АЗ-31,35%| ^FL1_H

Рис. 5. Образец пуповинной крови донора № 3

А1 — 2,4% CD 34 положительных клеток;

А 2 — 0,19% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 31,35% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 3,07% CD 15 положительных клеток.

104

onkol.002 -а,-, onko1.002

§: .;/"■ ;".-_ •■"- : | ai-2.6% | | а2-о,31% | ""fsc-h^{600 80}° ^{1Ш0 Э} ю°" io¹ ' io² io³ io'

_r 1 .т. FL1-H

|A3-32,51%]

Рис. 6. Образец пуповинной крови донора № 4

А1 — 2,6% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,31% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3—32,51 % клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—2,16% CD 15 положительных клеток.

onko 1.002 »₀ onko1.002

о" ■'.; Д ~~ \ | А1-3.3% | | А2-0.26%|

о 200 400 _{psc н}бю 800 looo ^s I⁰ "" F'i'o' ' i6" [Ь³ io"

|АЗ-32.81%'1 ^FL1"^H

Рис. 7. Образец пуповинной крови донора № 5

А1 — 3,3% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,26% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

A3 — 32,81% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 2,74% CD 15 положительных клеток.

105

о , , onko1.002 . onkol.002

"*: _■'• ■■'."■,•:, '""'. : ,':*"л.; I I am,98%| I A2-o;iSgi

«FSC-H⁶⁰⁰ ' ^{m 100}° " ^^ff ' ^f'^^: ' ' lo"""]

|A3-33,72%|

Рис. 8. Образец пуповинной крови донора № 6

А1 —1,98% CD 34 положительных клеток;

А 2 — 0,16% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3—33,72% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А4—1,12% CD 15 положительных клеток.

о onko1.002 ₍ , onko1.002

§: * .; "-.'•^:';".. -•• ~ ! I А1-2,28%| |А2-0.12%|

^{0 20}° ^fsc-h^{600 m 1Ю0} i°° ~ '"W ' ' "^ ю³ i''

|АЗ-33,03%| ^FL1"^H

Рис. 9. Образец пуповинной крови донора № 7

А1 — 2,28% CD34 положительных клеток;

А 2—0,12% CD34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 33,03% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 1,73% CD15 положительных клеток.

onko1.002 - onko1.002

|" ' . \"-^:'-". ■■•■ _: '"•■'''.^: ./'/■• "; I A1-1.82% | | A2-0,16% |

о 200 ^fsc.h^{600 800 100}° ° 10°' Tip¹ ' "io² "w' i'o

|A3-32,32%| ^FL,"^H

Рис. 10. Образец пуповинной крови донора № 8

А1 — 1,82% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,16% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3—32,32% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4 — 2,17% CD 15 положительных клеток.

onkot.002 -₀ orikol 002

§Н "■ '■ ; _г- /,- ' ' | " ! | А1-2.01%| |А2-0,24%|

0 200 400 _{psc н}600 Ю0 WOO ^S ib° '"'"' |fo' ' ' "'lV 'lQ³ Го"

|A3-33,03%| ^FL1"^H

Рис. 11. Образец пуповинной крови донора № 9

А1 — 2,01% CD 34 положительных клеток;

А 2—0,24% CD 34 и CD 15 положительных клеток;

А 3 — 33,03% клеток, не имеющих ни того, ни другого маркера;

А 4—1,78% CD 15 положительных клеток.

Количественное отношение CD 34⁺ позитивных клеток к общему числу клеток в вышеприведенных образцах представлено в табл. 5.

Как видно из данных таблицы, во всех образцах пуповинной крови количество CD 34⁺ клеток не превышает более 3,30% от общего количества мононуклеарных клеток, что подтверждают данные, полученные другими исследователями.

Два образца после культивирования in vitro из исследованных девяти проб были повторно исследованы на проточном цитофлуориметре с целью определения количества CD 34⁺ клеток в условиях лаборатории медицинских

107

Процентное содержание CD34⁺ клеток в образцах пуповинной крови

№ Образцы Общее Общее Общее Процентное

п/п пуповинной количество количество количество соотношение

крови мононуклеарных клеток CD 34⁺ клеток CD 34⁺ клеток

клеток лимфоцитов

1. Образец 1 10000 3512 58 0,58

2. Образец 2 3651 210 ~ 2,10

3. Образец 3 3758 260 2,60

~4 Образец 4~~ 3911 330 3,30 ~~"~~

5. Образец 5 3701 240 2,40

6. Образец 6 3698 198 1,98

7. Образец 7 3716 228 ~ 2,28 ^~

8 Образец 8 3682 182 1,82 ~9 Образец 9 3706 201 2ДН

иммунобиологических препаратов Национального центра экспертизы лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники Министерства здравоохранения Республики Казахстан.

Результаты проточной цитофлуориметрии культивированных клеток показали, что в суспензии СК с фенотипом CD 34⁺не были обнаружены. Анализ данных проточной цитофлуориметрии показал, что исследуемые клетки не попадают в область задаваемых параметров, что в свою очередь свидетель-

Рис. 12. ГСК в поле зрения камеры Горяева. Стрелками указаны ГСК с фенотипом CD 34⁺

108

^гвовало о большом размере клеток, характерном для клеток макрофагального

типа.

Результаты выделения ГСК с фенотипом CD 34⁺ и CD 133 из перифери­ческой крови человека с применением иммуномагнитного сепаратора.

В результате проведенных исследований из двух образцов лейкоцитарной массы периферической крови человека были получены ГСК с фенотипами CD 34⁺и CD 133⁺ с использованием иммуномагнитного сепаратора MiniMACS (jVliltenyi Biotec, Германия). После чего проводили подсчет ГСК с указанными фенотипами с помощью камеры Горяева. Фотография ГСК в поле зрения камеры Горяева под микроскопом представлена на рис. 12.

Выделение ГСК, меченых CD 34⁺ и CD 133⁺ антителами, на иммуномагнит-_ном сепараторе проводилось однократно, и учитывались только жизнеспо­собные клетки. Количество ГСК с указанными фенотипами представлено в табл. 6.

Таблица 6 Количественный анализ ГСК из периферической крови

№ Объем Содержание моно- Меченые Меченые

п/п исследуемого нуклеарной фракции по CD 34⁺, млн. по CD 133⁺, млн.

материала жизнеспособных

клеток, млн.

1. 50 103,360 7,62 -

2. 50 95,840 - 47)0

Как видно из таблицы, при применении магнитного сепаратора клеток удается получить из малых объемов образцов (проб) достаточное количество клеток для дальнейшего их культивирования.

Результаты по определению принципиальной возможности культивирования ГСК.

Полученные меченые клетки культивировали в 24-луночных культураль-ных плашках с использованием питательных сред DMEM/F12 и RPMI-1640 с 20%-ной фетальной сывороткой при 37°С в увлажненной атмосфере с содержанием 5% С0₂. При указанных условиях культивированию подверга­лись также и другие типы клеток (немеченые клетки) после магнитной сепарации с посевной концентрацией 1 млн. клеток в 1 мл.

Как видно из рис. 13, гемопоэтические стволовые клетки морфологически подобны лимфоцитам и представляют собой относительно однородную совокупность круглых клеток. В результате наблюдения и ежедневного микроскопирования в течение 20 дней размножения выделенных меченых и Немеченых клеток не наблюдалось.

На рис. 14—15 представлены культура гемопоэтических стволовых клеток с фенотипами CD 34⁺ и CD 133⁺ на 3 и 6-е сутки культивирования (соответ­ственно), изолированные с помощью магнитного сепаратора из моно-Нуклеарной фракции периферической крови.

Из данных рисунков видно, что на ранних сроках культивирования ГСК с

109

< • "-'V: . '.. ':'

' '*£ о И

^^Kpv "'it* n-*.t

bBBdHHHI ' ^ij

Рис. 13. ГСК пуповинной крови на 3-й сутки культивирования. А — ГСК с фенотипом CD 34⁺ . Ув. хЮО (фазово-контрастный)

фенотипами CD 34⁺ и CD 133⁺ в культуре по морфологическим признакам схожие. Все клетки округлой формы, на вторые и третьи сутки наблюдается частичное прикрепление клеток на поверхности культуральной посуды, большая часть клеток находится во взвешенном состоянии, сохраняя при этом изначальную форму.

По мере культивирования после смены питательной среды неприкреплен­ные клетки удаляются, а прикрепившиеся клетки начинают изменять свою

/ t ■'■■ **'^:-&**£^И

Рис. 14. Гемопоэтические стволовые клетки периферической крови. Л - ГСК с фенотипом CD 34⁺ . Ув х 100

ПО

- .&*У- ■ .. -•,' ^*

_{«о 8 "° /Л',* " ° .. <а}

; о - ^ ^ " оо ^

, йда ' ^^—Я_о;_!5

Рис. 15. Гемопоэтические стволовые клетки периферической крови. /1 - ГСК с фенотипом CD133⁺. Ув _х 100

r

Рис. 16. Культура ГСК на 10-е сутки культивирования.

А — колония ГСК, Б — мезенхимальные клетки В — гранулоциты,

Г— макрофаги

111

изначальную форму, характерную для ГСК. Клетки увеличиваются в размере цитоплазма становится зернистой и появляются формы клеток, по своей морфологии схожие с макрофагами.

На рис. 16 представлена культура ГСК с фенотипом CD 34⁺ на 10-е сутки культивирования. Как видно из рисунка, в процессе культивирования ГСК отмечается образование колоний (А), состоящих из мелких округлых клеток, характерных для клеток, участвующих в гемопоэзе. Кроме того, к данному сроку культивирования в культуре отмечается появление фибробласто-подобных клеток (Б), крупных клеток с зернистой цитоплазмой (В) и клеток с ундулирующей (Г) мембраной.

Данные изменения в морфологии ГСК объясняются тем, что в ростовой среде отсутствуют факторы роста стволовых клеток (SCF) и интерлейкины (IL-3, IL-6, LIF), которые регулируют межклеточные взаимодействия, определяют выживаемость клеток, стимуляцию или подавление их роста, дифференциацию, функциональную активность и апоптоз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами проведены исследования по определению оптимального метода сбора пуповинной и периферической крови, метода их транспортировки. Проведены эксперименты по отработке оптимальных методов выделения ядросодержащих клеток из пуповинной и периферической крови человека. Указанные источники ГСК исследовались на наличие возбудителей вирусной и бактериальной инфекции. В первичном материале определяли количество CD 34⁺ клеток путем проточной цитофлуориметрии.

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальным методом забора пуповинной крови является закрытый способ, обеспечи­вающий большой объем собираемой пуповинной крови и низкую вероятность микробной контаминации. По количеству собранного материала закрытый способ также имеет преимущество перед открытым способом.

Данные, полученные при определении оптимального температурного режи­ма транспортировки, свидетельствуют, что при доставке и хранении пуповин­ной крови при комнатной температуре (20°С) или при 2-4°С в условиях термо­чемодана с хладоагентами в течение 24—48 ч жизнеспособность клеток пуповин­ной крови не снижалась и составляла соответственно 92% и 88%. Однако при хранении образцов крови в течение 3 суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Таким образом, транспортировка и хранение образцов пуповинной и периферической крови должны осуществляться в течение не более 24 ч и при температуре не выше 2—4°С.

При выделении ядросодержащих клеток из первичного материала опти­мальным методом является использование фиколла с плотностью 1,077 г/мл и лизирующего раствора. Обработка пуповинной и периферической крови указанными методами приводит к получению большей массы клеток по сравнению с методом обработки раствором 3%-ного желатина. Однако использование лизирующего раствора в наших условиях являлось оптималь­ным, по сравнению с фиколлом из-за доступности компонентов, применяемы* в приготовлении данного раствора.

112

Нами отработан метод выделения ГСК с фенотипом CD 34⁺ и CD 133⁺ клеток из полученных мононуклеарных фракций образцов пуповинной и перифери­ческой крови с помощью иммуномагнитного сепаратора MiniMACS (Milteny Biotech, Германия), с последующим определением количества указанных клеток путем подсчета в камере Горяева и на проточном цитофлуориметре.

Количество CD 34⁺ клеток определялось в пуповинной крови до культиви­рования и после культивирования in vitro. При этом установлено, что исследуемые клетки не попадают в область задаваемых параметров, что в свою очередь свидетельствует о большом размере клеток, характерном для клеток макрофагального типа. Все образцы пуповинной крови, использованные в работе, оказались стерильными в отношении контаминации возбудителями вирусных и бактериальных инфекций.

Проводили эксперименты по определению принципиальной возможности

культивирования ядросодержащих клеток и ГСК с фенотипом CD 34⁺ и CD 133⁺

| клеток в различных полусинтетических питательных средах, в результате чего

было установлено, что без применения в ростовой среде факторов роста

I цитокинов выделенные ГСК не обладали пролиферативными свойствами.

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы:

• оптимальным методом сбора пуповинной крови является закрытый способ, обеспечивающий максимальное количество собираемого материала и снижающий риск внешней контаминации;

• оптимальным температурно-временным режимом доставки образцов пуповинной и периферической крови является транспортировка при температуре 2-4°С в течение 24—48 ч;

• выделение ядросодержащих клеток из пуповинной и периферической крови человека с использованием Ficoll-Paque и лизирующего раствора позволяет получать максимально очищенные мононуклеарные фракции;

• использование иммуномагнитной сепарации позволяет выделять избирательно ГСК с фенотипами CD 34⁺ и CD 133⁺.

Отработка методов культивирования CD 34⁺ и CD 133⁺ ГСК с последующей дифференциацией в кардиомиоциты и методов криоконсервации является следующим объектом наших исследований при разработке технологии выделения и культивирования кардиомиоцитов из ГСК человека.

Литература

1. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. М.: Канон, 1995, 384 с. j 2. Мамадалиев СМ. и др. Биотехнология и сахарный диабет//Биотехнологая. Теория и практика, 2002. № 2. С. 62—64.

3. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. // Трансплантация островковых и других эндокринных клеток. В кн. "Трансплантация — руководство". М.: Медицина. Тула "Репроникс Лтд", 1995. С. 317-331.

4. Алиев М.А., Рысулы М.Р. и др. Гемопоэтические стволовые клетки. Алматы: Мектеп, 2005, 136 с.

113 d

5. Коркан И.П., Рысулы М.Р. Стволовые клетки в медицинской практике. Алматы 2004, 59 с.

6. Хансон К.П., Моисеенко В.М., Балдуева И.А, Использование клеточных технологий в онкологии // Вестник РАМН. 2004. № 9. С. 58—61.

7. Кокорев О.В., ЗайцевК.В., Волгушев С.А. Стволовые клетки — реальные перспек­тивы терапии. Сибирский медицинский журнал. 2006. №1. С. 86—94.

8. Джонатан Сарфати. Статья опубликована в журнале TJ. 2001. Vol. 15(N 3) P. 19-26.

9. Рябов СИ., Ракитянская И.А., Шутко А.Н. //Почки и системы иммунитета Л.: Наука. 1989. 135 с.

10. Pittenger M.F., Mackay A.M., BeckS.C. et. al. // Multilineage Potential of Adult Hu­man Mesenhcymal Stem Cells// Scince 1999. V. 284, 2 april, P. 143—147.

1.1. MqjumdarM.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. // Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells //J. Cells Physiol 2000. V. 185. N.l. P. 98-106.

12. ВладимирскаяЕ.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А. и др. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М.: Медпрактика. М., 2005, 392 с.

13. Wenrong Xu and all. Mesenchymal Stem Cells from Adult Human Bone Marrow Differentiate into a Cardiomyocyte Phenotype In Vitro // Experimental Biology and Medicine. 2004. Vol. 229. P. 623-631.

14. David Cameron. // Powerful technique for multiplying adult stem cells may aid thera­pies. // Eurek Alert., 2006. 22-Jan.

15. Шевченко ЮЛ., Матвеев С.А. Клеточные технологии в сердечно-сосудистой хирургии. М.: Медицина, 2005. 160 с.

16. Потапов И.В. и др. Характеристика насосной функции сердца после трансплантации фетальных кардиомиоцитов и мезинхимальных стволовых клеток костного мозга в криоповрежденный миокард. Вестник транспланталогии и искусственных органов. 2003. Т. 3. С. 50—55.

17. Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Потапов ИЗ., Башкина Л.В., Берсенев А.В. Костный мозг как источник получения мезенхи-мальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов. Вестник транспланталогии и искусственных органов. 2002. Т. 4. С. 7—11.

18. Петренко А.Ю., Грищенко В.И. Трансплантация стволовых клеток — перспектив­ное направление терапии XXI в. 2. Стволовые кроветворные клетки из разных источников // Международный медицинский журнал, 2003. № 1. С. 123—129-

19. Чертков ИЛ., Дризе Н.И. Как обеспечивается поддержание кроветворной систе­мы // Гематология и трансфузиология, 1998. № 4. Т. 43. С. 3—8.

20. Абдулкадыров К.М., Романенко НА., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток пуповиннои крови // Вопросы онкологии. 2000. № 5. Т. 46. С. 513—520.

21. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А. Плацентарная кровь: альтернативный источник кроветворных стволовых клеток для трансплантаций. Создание банко пуповиннои крови // Тер. архив. 2001. Т. 73. № 7. С. 76—78.

22. Gluckman E., Broxmeyer H.E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbili^ca cord blood // N. Engl. J. Med. 2001. Vol. 344 (24) С 1860-1861.

23. Gluckman, E., Rocha, Y., Boyer- Chammard, A. et al Outcome of cord-blood transpl^a tation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the Eur

114

pean Blood and Marrow Transplantation Group. // N Eingl J Med. 1997. Vol. 337(6). P. 373-381.

24. Rubinstein, P., Carrier, C, Scaradavou, A. et al. Outcormes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Emgl J Med. 1998. Vol. 339(22). P. 1565-1577.

25. Scott R. Burger Umbilical Cord Blood Stem Cells- Handbook of Transfusion Medicine Academic Press. 2001. P. 171-178.

26. Kypmoea A.B., Зуева Е.Е., Фрегатоеа Л.М. Методы банкирования пуповиннои крови. Иммунология. 2005. Т. 6. С. 577—588.

27. WattS.M., ContrerasM. Stem cell medicine: Umbilical cord blood and its stem cell potential // Seminars in fetal and neonatal medicine. 20Ю5. Vol. 10. P. 209—220.

28. Румянцев А.Г., Масчан А.А., Дышлевая З.М. и др. Трансплантация пуповиннои крови у детей с различными заболеваниями // Материалы конференции "Биотехнология и онкология". СПб, 29—31 мая 2005 г. С. 59—60.

29- BertoliniF., BattagliaM. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns// Blood.

1995. Vol. 85. P. 3361-3362.

30. Lazzari I., Corsini C, Curioni С et al. The Milan Cord Blood Bank and the Italian Cord Blood Network// J. Hematother. 1996. Vol. 5. N 2. P. 1Ц7—122.

31. Rubinstein P., Taylor P.E., Scaradavou A. et al. Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution: Organization of the placental blood program // Blood Cells. 1994. Vol. 20. N 2. P. 587-600.

32. Boyse E.A., Broxmeyer HE., Douglas G.W. Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood// 1U.S. Patent 5.004.681. 1991. April 2.

33. Kogler G, Calle/as J., Hakenberg P. et al. Hematopoietic transplant potential of unre­lated cord blood: critical issues // J. Hematother. 1996. Vol. 5. N. 2. P. 105—116.

34. ArmitageS, FehilyD., Dickenson A. et al. Cord blood bankirng: volume reduction of cord blood units using a semi-automated closed system// Bome Marrow Transplant. 1999. Vol. 23. N. 5. P. 505-509.

35. Isoyama K, Yamada K, Hirota Y. et al. Study of the collection and separation of umbilical cord blood for use in hematopoietic progenitor cell transplantation// Int. J. Hematol. 1996. Vol. 63. N 2. P. 95-102.

36. NaglerA, StockheimD., Elchalal U. Harvesting of human urmbilical cord blood (HUCB) by various methods// Bone Marrow Transplant. 1998. Vol. 21. P. S24.

37. Falkenburg J.H.F., Lim F. Т.Н. Использование пуповитаадй крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // РМЖ. 1996. Т. 3. № 4. С. 24-31.

38. HarrisD. Т. Experience in autologous and allogeneic cord blood banking//J. Hematother.

1996. Vol. 5. N 2. P. 123-128. ³⁹- Ikuta K. Cord blood stem cell transplantation and cord blood bank// Nippon Rinsho.

1998. Vol. 56. N 2. P. 521-530.

⁴°- Kogler G, Calle/as J., Hakenberg P. et al. Hematopoietic transplant potential of unre­lated cord blood: critical issues // J. Hematother. 1996. Vol. 5. N. 2. P. 105—116.

^4l- Wagner Т.Е. Allogeneic umbilical cord blood transplantation// Cancer Treat. Res.

1997. Vol. 77. P. 187-216. ²- Юрасов СВ., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. и др. Выделение гемопоэтических

стволовых клеток из пуповиннои крови человека для тгрансплантации// Гемато­логия и трансфузиология. 1997. Т. 42. № 2. С. 10—15.

115

_L

43. Abdel-MageedA., Rosalio M.L. U., Hutcheson C.E. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential // Blood. 1997. Vol. 90. N 10. P. 32lb (4194).

44. Hubl W., IturraspeJ., Hutcheson C.E. et al. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood // Blood. 1997. Vol. 90, N 10. P. 326b.

45. MachalinskiB., PluciennikE., SamuelA.A. et al. A convenient and economical method for long distance shipment of non-frozen human mononuclear cord blood cells // Blood. 1997. Vol. 90. N10. P. 330b.

46. Shlebak A.A., Marley S.B., Roberts LA. et al. Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord haematopoietic stem cells for clinical transplanta­tion // Bone Marrow Transplant. 1999. Vol. 23. N. 2. P. 131-136.

47. Gluckman E., Broxmeyer H.E. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconis anemia by means of umbilical-cord blood from HLA-identical sibling // N. Engl. J. Med. 1989. Vol. 321. P. 1174-1178.

48. Gluckman, E., Rocha, Y.,Boyer-Chammard,A. et al Outcome of cord-blood transplan­tation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the Euro­pean Blood and Marrow Transplantation Group // N Engl J Med. 1997. Vol. 337(6). P. 373-381.

49. RubinsteinP., DobrilaL., Rosenfield R.E.,AdamsonJ. W. Processing and cryopreservation of placental/umbilical blood for unrelated bone marrow reconstitution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995. Vol. 92. P. 10119-10122.

50. Newton L, Charbord P., Schaal J.P., Herve P. Toward cord blood banking: density-separation and cryopreservation of cord blood progenitors // Exp Hematol. 1993. Vol. 21(5). P. 671-674.

51. Dennlng-KendallP., Donaldson C, NicolA. et al. Optimal processing of human umbili­cal cord blood for clinical banking // Exp Hematol. 1996. Vol. 24(12). P. 1394-1401.

52. Гришина В.В., Тимохина Е.В., АндрееваЛ.Ю. Система сбора и фракционирования стволовых клеток пуповинной крови // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2004. Т. 3, № 6. С. 50—54.

53. Regidor С, Posada M.,MonteagudoD. etal. Umbilical cord blood banking for unrelated transplantation: evaluation of cell separation and storage methods // Exp Hematol. 1999. Vol. 27(2). P. 380-385.

54. YasutakeM.,SumitaM., TerashlmaS. etal. Stem cell collection filter system for human placental/umbilical cord blood processing//Vox Sang. 2001. Vol. 80(2). P. 101—105.

55. EichlerH., Kern S., Beck С et al. Engraftment capacity of umbilical cord blood cells processed by either whole blood preparation and filtration // Stem Cells. 2003. Vol. 21. P. 208-216.

56. Hoffman R., RozlerE., Chute J. et. al. Ex vivo expansion of human haemapoietic stem cells: implications for the modem blood bank //Vox Sang., 1998. Vol. 74. № 2. P. 259— 264.

57. Hows J., Bradley B.A., Marsh J. Growth of human umbilical cord blood in long-term haematopoirtic cultures // LanceL, 1992. Vol. 340. P. 73—76.

58. Huang S., Law P., Young D., HoA.D. Candidate haemapoietic stem cells from fetal tussues, umbilical cord blood vs adult bone marrow and mobilized peripheral blood // Exp. Haemalol., 1998. Vol. 26. № 12. P. 1162-1171.

59. Huang S., Terstappen L.W. Formation of haemapoietic microenvironment and haemapoietic stem cells form singl human bone marrow stem cells // Nature, 1992. Vol. 360. P. 745.

116

60. United States Patent 5,061,620, Tsukamoto, et al. Human hematopoietic stem cell.

61. Руководство по подготовке стеклянной посуды для приготовления питательных сред, растворов, первичных и перевиваемых культур клеток для вирусологических исследований. Гвардейский: НИСХИ, 1985. 733 с.

62. Юрасов СВ., Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. и др. Выделение гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови человека для трансплантации // Гемато­логия и трансфузиология. 1997. Т. 42. № 2. С. 10—15.

63. Abdel-MageedA., Rosalio M.L.U., Hutcheson C.E. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential // Blood. 1997. Vol. 90. N 10. P. 321b (4194).

64. Hubl W., IturraspeJ., Hutcheson C.E. et al. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood // Blood. 1997. Vol. 90. N 10. P. 326b.

65. Rqjendra N. Pahwa, Adiel Fleischer, Soe Than and Robert A. Goods // Successful hematopoietic reconstitution with transplantation of erythrocyte-depleted allogeneic human umbilical cord blood cells in a child with leukemia // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. Vol. 91. P. 4485-^1488. May 1994. Medical Sciences.

А. К. Джусипов, Ю. Д. Денисов, Е. А. Северова, Н. М. Поминова,

Е. Середа (НИИ кардиологии и внутренних болезней, лаборатория

экспериментальной кардиологии),

Е. А. Енин (ННЦХ им. А. Н. Сызганова, лаборатория патоморфологии),

Н. Н. Беляев, Г. К. Закирьянова, Т. А. Супниязова, Ю. В. Перфильева

(Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина

ЦБИ МОИ РК)

МОДЕЛИРОВАНИЕ ИНФАРКТА МИОКАРДА И ЕГО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ

Высокие показатели заболеваемости и летальности при инфаркте миокарда (ИМ) определяют интерес ведущих научно-исследовательских учреждений во всем мире к проблеме профилактики и терапии этой патологии [1—4]. I Совершенно очевидно, что разработка принципов и способов профилактики и терапии ИМ невозможна без углубленного изучения его патогенеза. В связи с этим исследования, направленные на выявление причин и патогенетических механизмов развития ИМ, а также на поиск фармакологической коррекции этих механизмов, по-прежнему актуальны.

ИМ — многофакторное, "вероятностное" заболевание и в сложном комплексе сердечных, сосудистых и нейрогуморальных расстройств, I определяющих его возникновение и развитие, ключевая позиция отводится нарушению экстракардиальных факторов регуляции сердечной деятельности [5—7]. При развитии патологии сердца, в том числе и ИМ, изменения его I функционирования могут, с одной стороны, способствовать включению и/ или активации адаптивных реакций, повышающих резистентность миокарда к патогенным воздействиям, с другой — усугубить течение болезни [9, 10]. Поэтому, степень и масштаб повреждения сердца в значительной мере зависят от состояния экстракардиальных механизмов регуляции сердечной деятельности [8,12,13,14].

ИМ не одномоментный, а эволютивный, последовательный, многоэтапный процесс, поэтому при его изучении ученые настаивают на необходимости проведения серийных, динамических исследований [1,5,14,15,16].

Степень и характер повреждения сердца зависят от времени, прошедшего после окклюзии коронарной артерии у животных [17], и, как подтверждается многочисленными клиническими исследованиями, фактор времени во многом определяет эффективность лечения ИМ [ 1—3,5,19—23]. В большинстве случаев исследования динамики изменений регуляции функции сердца при экспери­ментальном ИМ проводились в течение двух часов или через 24 часа после коронаро-окклюзии [24,25]. Важность временного фактора в патогенезе ИМ подтверждается также и научными данными о том, что место возникновения, электрофизиологические механизмы и реакция нарушений ритма на антиаритмические препараты различны в зависимости от времени, прошедшего после окклюзии коронарной артерии [26].

118

Концепция регенеративной медицины, базирующаяся на использовании собственных стволовых клеток для восстановления поврежденных тканей, сосудов и органов, в последние годы привлекает внимание большого количества кардиологов. Данный метод является альтернативой многим известным методам лечения заболеваний сердца (медикаментозных, хирургических, вплоть до пересадки сердца). Однако многие критерии проведения клеточной терапии, ее показания и противопоказания при конкретной патологии все еще остаются на уровне интуитивных догадок, без серьезных экспериментальных и теоретических обоснований.

Следует отметить, что возможности клеточных технологий в кардиологии остаются малоизученными и нереализованными. Одной из причин этого является отсутствие ясности в представлениях о регенеративных возможностях миокарда [27].

Общепризнанной догмой считается, что во взрослом организме животных и человека КМЦ утрачивают способность к регенерации. В отличие от скелетной мускулатуры и гладкомышечных волокон, миокард не содержит стволовых или сателлитных клеток, способных к пролиферации и замещению образовавшегося дефекта. Вместо мышечной ткани при инфаркте миокарда активируется стромогенез и формируется рубец [28]. Иными словами, если возникает повреждение сердечной мышцы, то оно необратимо приводит к развитию кардиосклероза, а при обширном инфаркте миокарда—к нарушению его функциональных и биомеханических свойств, компенсаторной гипертро­фии, что часто заканчивается развитием СН в течение нескольких месяцев или лет [29,30].

Следует подчеркнуть, что фибробласты, принимающие участие в образовании рубца, являются производными мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Почему эти клетки, обладающие чрезвычайно широкими пластическими свойствами, не превращаются в кардиомиоциты — остается неясным, так как явных ограничений для их превращения в мышечные или сосудистые элементы нет. Можно предположить, как минимум, два варианта событий. Согласно одному из них, клетки-предшественницы фибробластов и эндотелия необратимо встали на путь терминальной дифференцировки и не могут образовывать иные типы клеток, а МСК не попадают в поврежденный миокард, так как не происходит их мобилизация из депо, в частности, костного мозга. Согласно другому сценарию, в поврежденном миокарде не формируются соответствующие условия для реализации пластических свойств МСК в направлении кардиомиогенеза.

Мнение о том, что в сердечной ткани отсутствуют клетки, способные к кардиомиогенезу, в последние годы пересматриваются. Данные последних лет свидетельствуют в пользу того, что в сердечной ткани сохраняются клеточные элементы, способные к пролиферации и образованию новых КМЦ. Так, в Работах коллектива авторов, представленных Л. В. Полежаевым (1965,1995), было показано, что в некротическом миокарде при введении биомодуляторов И ингибиторов его рубцевания на короткий срок появляются клетки, которые Можно морфологически идентифицировать как слабо дифференцированные ^Иобласты. Кроме того, под влиянием указанной терапии уменьшались

119

размеры новообразованной рубцовой ткани по сравнению с контролем. Однако происхождение "миобластоподобных клеток" осталось невыясненным: или это КМЦ, или они относились к другим мышечным элементам, например гладкомышечным клеткам, предшественники которых обнаруживаются в предсердиях. Полежаевым (2000) [34] было показано, что миокард кроликов обладает способностью к восстановлению своей структуры под действием гидролизата сердечной мышцы, гомогенатов скелетных мышц и других биопрепаратов. По-видимому, в данном случае индукция морфогенеза происходит под действием и-РНК, факторов роста мышечной ткани типа MyoD и т. п., которые способны вызывать мышечную экспрессию, в том числе и в фибробластах (Tam et al, 1995; Marry et al., 1996) Salvatore et al. (1995) показали, что, если фибробласты линии ЮТ 1/2 культивировать совместно с миобластами линии С 2 С 12 или скелетными миобластами, то они дифференцируются в мышечные трубочки (1—10% от всей популяции).

Как ранее было описано Румянцевым П. П. (1982) [31], КМЦ не могут пролиферировать, так как строго ориентированные агрегаты сократительных белков в КМЦ и наличие вставочных дисков создают препятствие для цитокинеза при митозе.

Именно поэтому для внедрения КМЦ в структуру миокарда необходимо индуцировать обратимую деструкцию (разборку) его миофибрилл, т. е. вызывать умеренную дедифференцировку сердечной ткани. По-видимому, из-за отсутствия условий для реализации этих процессов, в частности при инфаркте миокарда, митотическое деление в КМЦ обычно не идет дальше кардиокинеза, и регенерация заканчивается формированием полиплоидных КМЦ (Бродский, 1995) [32]. Кроме того, в ткани миокарда взрослого организма в обычных условиях не найдены структуры, подобные МСК, сателлитные клетки скелетных мышц, миобласты или незрелые кардиомиоциты, сохраняющие способность к делению. Обнаруженные в желудочках крыс популяции КМЦ (около 10%), обладающие способностью накапливать ³Н—тимидин, очевидно, можно отнести к клеткам, остановившимся на стадии кариорексиса с формированием полиплоидных (двухъядерных) клеток. Они, видимо, играют важную роль в адаптивной перестройке миокарда при его гипертрофии. Довольно редко можно наблюдать митозы КМЦ в периинфаркт-ной зоне, которые, как правило, заканчиваются цитокинезом. Они, как и цир­кулирующие МСК, не способны к репарации в полном объеме, восстановлению миокарда и инволюции рубца [31,33]. Согласно мнению Д. С. Саркисова [35], уменьшение размеров рубца, показанное в опытах Л. В. Полежаева (1965) [34], связано не с репаративной регенерацией, а с предотвращением вторичных волн некроза в миокарде. С позиций разработанной им теории внутриклеточной регенерации, сердце относится к органам, в которых при повреждении преобладают не пролиферативные процессы в паренхиме, а фибробластические реакции стромы, которые почти необратимы. Иными словами, следует считать, что дефицит функции КМЦ в миокарде возмещается не за счет пролиферации, а посредством внутриклеточных гиперпластических реакций [35].

Для понимания возможности стимуляции регенеративных процессов в КМЦ при ИМ следует проанализировать все механизмы, влияющие на

120

адаптационные и репарационные процессы. Анализ литературы и эксперимен­тальных данных позволяет предположить, что при инфаркте миокарда, как и _при травмах, повреждениях кроветворной системы и стрессовых реакциях, в организме включается универсальный механизм адаптации, развивающийся _по каскадоподобному механизму (КПМА) [36, 37]. КПМА — механизм взаимозависимой последовательной активации ключевых гомеостатических систем (нейроэндокринной, иммунной, ретикулоэндотелиальной (РЭС), кроветворной и др. систем), направленный на поддержание и восстановление постоянства внутренней среды организма в ответ на действие экстремальных, в том числе и повреждающих, факторов. Данная концепция базируется на учении Г. Селье, работах Ф. 3. Меерсона [42], П. К. Анохина [40], П. Д. Саркисова [35], К. В. Судакова [43] и других авторов.

Физиологической основой КПМА являются биоритмы (циркадные, суточные и др.). Каскадоподобный характер данного механизма заключается в том, что возбуждение от одной системы к другой передается последовательно по типу эстафеты с помощью специфических и неспецифических мессенджеров. Очень важной деталью является то, что КПМА может реализовываться по иерархическому типу. Например, стресс, анемия или повреждение тканей вызывают активацию нервной, затем эндокринной, Т-лимфоцитарной, РЭС, кроветворных систем. В результате этого происходит активация стромальных элементов, ответственных за формирование гемопоэтининдуцирующего микроокружения, усиливающая процессы пролиферации и деления стволовых клеток. В конечном итоге развиваются гиперплазия кроветворения, увеличение эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, циркулирующих СК в периферической крови, и повышение устойчивости организма к гипоксии, воспалению и разнообразным повреждениям (Дыгай, Шахов, 1989; Гольдберг и др., Дыгай и др., Шахов, 1991, 1996). При этом не исключается, что этот процесс может протекать и по сетевому принципу, т. е. одновременному развитию по нескольким направлениям. В частности, параллельно гипофи-зарно-гипоталамо-адреналовому пути стимуляция кроветворения может осу­ществляться с помощью симпатических, парасимпатических и адренергических механизмов, что позволяет более гибко реагировать на изменяющиеся условия жизнедеятельности.

Включение КПМА зависит от силы, характера и частоты действия экстре­мального фактора и исходного состояния, как всего организма, так и звеньев самого адаптационного механизма. Для каждого уровня КПМА существует свой специфический регулятор. Так, для передней доли гипофиза кортико-либерина в передней доле гипофиза вырабатывается АКТГ. Он, в свою очередь, стимулирует выработку глюкокортикоидов в надпочечниках. Глюко-Кортикоиды вызывают миграцию Т-лимфоцитов из тимуса. Т-клетки Срабатывают колониестимулирующие факторы, ИЛ-3 и другие факторы, активирующие миелогенез, стромогенез и клетки РЭС. Каждый уровень КПМА Работает по принципу функциональной системы (Анохин, 1975) [40], которая °существляет восприятие и переработку идущей к ней специфической и ^специфической информации, с последующей интегральной оценкой и ^ПеРедачей ее к следующему звену КПМА. Блокада любого уровня КПМА при

121

прохождении через него специфического сигнала приводит к супрессии, деформации или полной отмене адекватного реагирования. Так, удаление надпочечников, тимуса или блокада РЭС или Т-клеток с помощью антител полностью отменяет стимуляцию мезенхимальных стволовых клеток, отвечающих за перенос гемопоэтиндуцирующего микроокружения КОЕФ (Шахов, 1991). Коррекция вышеуказанных повреждений, в частности за счет введения тимоцитов, восстанавливает эти повреждения [39]. Специфические сигналы определяют общий вектор развития КПМА.

Неспецифические регуляторы переводят отдельные звенья КПМА в режим ожидания (включения/ выключения) и создают общую его гармонику. Специфические регуляторы могут стать неспецифическими, если будут действовать не адресно, т.е. на свою специфическую мишень. Таковым стано­вится АКТГ, если действует не на Т-клетки, а на фагоцитирующие мононук-леары [41]. Вместе специфические и неспецифические регуляторные механизмы создают единую "голографическую" картину работы КПМА с учетом реального времени и перспективы его развития, позволяющую объединить многочисленные гомеостатические реакции в единую функциональную гиперсистему. Если инициация КПМА обычно не превышает одни сутки, то I его развитие и реализация занимают от двух недель (гемопоэз) до нескольких месяцев (костная ткань) [37,39].

Анализ имеющейся информации, в том числе и экспериментальных данных, позволяет предположить, что развитие острого инфаркта миокарда также происходит по сценарию развития КПМА. Так, после ишемии, некроза миокарда, сопровождающегося выраженным болевым синдромом, происходит активация нервной, гипофизоадреналовой, иммунной и ретикулоэндотелиаль-ной систем [42, 43]. В поврежденную ткань устремляются нейтрофилы, моноциты и лимфоциты [28]. В результате в миокарде изменяется микроокру­жение. Очевидно, именно в этот период происходит выработка разнообразных ростовых и дифференцирующих факторов, готовых включить механизмы локальной регенерации в поврежденном миокарде. Однако ввиду того, что в сердечной мышце нет КМЦ или МСК, способных дифференцироваться в кардиомиоциты, вместо кардиомиогенеза происходит активация стромальных и сосудистых клеток, которые присутствуют в интерстициальном слое между мышечными волокнами и около сосудов. Если циркулирующие МСК мигрируют в сердце, то по каким причинам они не могут реализовать свою репарационную миссию? С одной стороны, это может происходить из-за их недостаточного количества, а с другой стороны — нельзя исключить и того, что они не подготовлены к дифференцировке в направлении миогенеза. Кроме того, нельзя исключить, что микроокружение и биомеханика поврежденного миокарда не создают необходимых условий для развития МСК в кардиомио­циты. Однако последний довод опровергается в опытах, когда МСК трансплантируют в сердечную ткань.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что при инфаркте миокарда может происходить развитие КПМА. В то же время, в силу особенностей формирования сердца, терминальной дифференцировки КМЦ и отсутствия в них соответствующих стволовых клеток, вместо

122

включения механизмов репаративной регенерации включается регенерация на уровне гипертрофии миокарда и возникновения полиплоидных, с повы­шенной функциональной активностью, клеток. Параллельно образующийся дефект необратимо замещается рубцовой тканью, что может привести к развитию разнообразных осложнений, включая и сердечную недостаточность.

Теоретически изменить ход необратимых изменений в сердечной ткани при инфаркте миокарда можно, если в каскадоподобный механизм адаптации включить экзогенные МСК, обладающие миогенным и ангиогенным потен­циалом. Тогда вместо кардиосклероза, образования рубцов и развития сердеч­ной недостаточности будет включен механизм репаративной регенерации и восстановления миокарда. Этот вопрос достаточно освещен в обзоре И. В. По­тапова и др. (2001) [27]. Отмечено, что для активного участия пересаженных клеток в систоле левого желудочка (ЛЖ) должны выполняться несколько условий:

— клетки должны обладать способностью дифференцироваться в кардиомиоциты, содержать сократительные структуры;

—между клетками должны присутствовать вставочные диски с щелевыми контактами для проведения потенциалов возбуждения к пересаженным клеткам от КМЦ хозяина;

—должна отсутствовать реакция отторжения;

—необходимо свести до минимума ишемические повреждения, шок, некроз и апоптоз пересаженных клеток;

—пересаженные клетки должны способствовать репарации поврежденного участка (замещение соединительной ткани, формирование полноценной биомеханической архитектоники сердечной ткани).

Большинству перечисленных критериев соответствуют мезенхимальные стволовые клетки. Работы по управлению их дифференциации в кардиомио­циты продолжаются. Так, S. Makino et al. (1999) [44] получили кардиомиогенную клеточную линию из мышиных клеток стромы костного мозга, в которых после соответствующей обработки были индуцированы дифференцировки в КМЦ. Эффективность обработки составила 30%. Полученные клетки экспресси-ровали множество специфических для КМЦ генов, имели фенотип фетальных желудочковых КМЦ. Дифференцированные таким образом КМЦ были связаны между собой вставочными дисками, формировали мышечные трубочки, спонтанно сокращались, имели КМЦ-подобную ультраструктуру, включая типичные сакромеры, центрально расположенное ядро, множествен­ные гранулы гликогена и митохондрии. Мышечные трубочки генерировали потенциалы действия, напоминающие таковые у желудочковых КМЦ. Подобные результаты получены S. Tomita et al. (1999) [45], которые свиде­тельствовали о повреждении миокарда с помощью жидкого азота. Кроме того, было установлено, что КМС наряду с образованием КМЦ формировали эндотелиальные и гладкомышечные клетки, что улучшало функцию сердца (Шумаковидр., 2003; Davini etal., 2003).

Не имея полной теории механизма ремодулирующего действия трансплан­тированных клеток, многие авторы сходятся в том, что в результате проведен­ной клеточной кардиопластики можно достичь следующих эффектов:

123

\{

1. предупреждения развития постинфарктной аневризмы;

2. ускорения процессов регенерации миокарда;

3. предотвращения распространения очага некроза и рубцовой ткани;

4. улучшения диастолических свойств миокарда и нагнетательной функции сердца;

5. стимуляции процессов ангиогенеза и оксигенации миокарда.

Т. Wang et al. (2000) выдвинули гипотезу, что микроокружение в миокарде создает определенные условия и сигналы для кардиомиогенной дифферен-цировки МСК. В их исследованиях крысиные МСК после культивирования и удаления большинства гемопоэтических стволовых клеток были пересажены в миокард и дифференцировались в КМЦ, образовывали щелевые контакты. С другой стороны, в опытах на крысах с использованием DAPI МСК и моно-нуклеаров костного мозга было установлено, что стволовые, но не мононук-леарные элементы встраиваются в сердечную ткань после коронароокклюзии. При этом через два месяца они образовывали компактные клеточные агрегаты в миокарде, которые не были тесно связаны с окружающими клетками синцития. Интересно, что в обычных условиях МСК утрачивали способность включаться в процессы клеточной репарации миокарда (Zu et al., 2004), что косвенно свидетельствует об индукции кардиомиогенеза в сердечной ткани только при экстремальных состояниях. МСК взаимодействуют с КМЦ в сердце через С43- и С40- области межклеточных контактов с образованием симметричных гемопоэтических и асимметричных (гетеротипических, гетеромерных) каналов с переходной проводимостью. Клеточная трансплан­тация фетальных КМЦ, меченых геном белка с зеленой флюоресценцией, в сердце показала, что они способны формировать функциональный синцитий, встраиваясь в поврежденный миокард животных (Rubart et al., 2003). Однако данные о том, что МСК обладают такой способностью, крайне противоречивы, и часто непонятно, является ли улучшение работы сердца результатом процессов образования и интеграции новых КМЦ, или они развиваются в результате стимуляции ангиогенеза и гипертрофии миокарда.

Наряду с кроветворными и мезенхимальными стволовыми клетками в костном мозге присутствуют и другие элементы, способные играть активную роль в ремоделировании инфаркта миокарда, в частности речь идет о клетках-предшественниках эндотелиального ряда. Они способны при попадании в поврежденный миокард формировать новые сосуды и капилляры, улучшая оксигенацию ткани. В этой связи рассматривается вопрос о целесообразности применения гетерогенной популяции клеток костного мозга, способной патогенетически воздействовать на различные механизмы репарации КМЦ и влиять на рубцовую ткань. Кроме того, МСК и вспомогательные клетки (типа эндотелиальных, макрофагов, лимфоцитов, стромальных клеток) способны секретировать многочисленные цитокины, ростовые факторы и создавать необходимое микроокружение для прогениторных клеток (Orlic et al., 2001)-По сравнению с ЭСК мезенхимальные стволовые клетки имеют ряД преимуществ.

124

j

МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Экспериментальное моделирование острого инфаркта миокарда в сочетании с современными и классическими исследованиями крайне необходимо для понимания патогенетических механизмов развития данного заболевания у людей и разработки новых способов лечения.

МЕТОДЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИНФАРКТА

МИОКАРДА

Обычно для моделирования острого инфаркта миокарда (ОИМ) используются крысы обоего пола породы "вистар", весом 180—220 г. Моделирование проводят в асептических условиях с применением всех правил септики и антисептики. Перед коронароокклюзией животных исследовали функциональное состояние сердца. Далее при моделировании эксперимен­тального инфаркта миокарда данную процедуру повторяли.

Для выбора наиболее адекватного метода экспериментального инфаркта миокарда мы изучили следующие модели:

1-й метод — модель экспериментального инфаркта миокарда по методу Н. Selye (окклюзия верхней левой венечной артерии). Проведенные исследования показали, что у всех животных через 24 ч после наложения лигатуры наблюдались обширные трансмуральные инфаркты в стенке левого желудочка, подтвержденные гистологическими исследованиями. Несовершен­ством модели является: 30—40%-ная смертность влечение первых 24 ч из-за высокой травматичности (перерезка ребер грудной клетки и мышц, высокая частота развития пневмоторакса).

2-й метод — модель экспериментального инфаркта по методу Н. Selye в модификации Н. М. Поминовой и С. С. Дюсенова (окклюзия верхней левой венечной артерии) [24]. У животных развивался крупноочаговый ИМ (переднебоковой ИМ или ИМ верхнего отдела боковой стенки левого желудочка), подтвержденный гистологическими исследованиями. Недостатки модели: окклюзия вызывается перевязкой артерии, а лигатура не может быть подвергнута тромболизису. К достоинствам модели относятся низкая травматичность и смертность.

3-й метод — моделирование коронарной недостаточности в результате стрессорного повреждения. Методом стрессорного воздействия в нашем исследовании являлась длительная иммобилизация животных в положении на спине по Ф. 3. Меерсону. Лишение возможности свободно передвигаться является для животного сильнейшим стрессирующим фактором. Продолжи­тельность воздействия составляла 6 ч ежедневно в течение 14 дней. На 15-й День у животных регистрировали мелкоочаговые некрозы сердечной мышцы, У 10% животных диагностировали ИМ различной локализации. Развитие заболевания при данной модели сопровождается всеми клиническими, электрофизиологическими и биохимическими изменениями, свойственными стенокардии. Функциональные исследования показывают, что эксперимен­тальная модель наиболее соответствует стенокардии нестабильного течения.

4-й метод — изадриновое повреждение миокарда. Одним из основных

125

факторов, повреждающих миокард при стрессе, является выброс избыточных количеств катехоламинов, которые способны вызывать дистрофические ц некробиотические изменения кардиомиоцитов. Мы моделировали данные повреждения с помощью подкожного введения субтоксических доз (40 мг/кг) изопротеренола (изадрина), как наиболее эффективного синтетического производного катехоламинов длительного действия. Избыток катехоламинов в миокарде обусловливает развитие их кардиотоксических эффектов. В миокар­де у подопытных животных отмечалось формирование небольших участков некроза миокарда с последующим развитием мелкоочагового кардиосклероза. В целом изадриновое повреждение соответствует (с определенным приближе­нием) вариантной стенокардии (стенокардия принцметала).

Обе модели (стрессовая и изадриновая) достаточно схожи по своим морфофункциональным проявлениям. Но стрессовое повреждение по этиологии и патогенезу более приближено к клиническим проявлениям коронарной недостаточности (мелкоочаговый ИМ).

ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА

После проведения коронароокклюзии в нижней трети передней левожелу-дочковой коронарной артерии или в ином месте (в зависимости от модели экспериментального инфаркта—см. ниже) были проведены как наблюдения за состоянием животного, так и патоморфологические исследования миокарда.

Итак, через 24 ч моделирования ОИМ в зоне ишемии наблюдаются все признаки, характерные для стадии альтерации при наблюдаемой воспали­тельной реакции, сопровождающиеся отеком и набуханием кардиомиоцитов (КМЦ), появлением дистрофических и дегенеративных признаков. КМЦ начинают терять свою поперечную исчерченность. Четких границ зоны некроза в этот период выявить не удалось. В интерстициальной соединительной ткани и между мышечными волокнами появляются клеточные инфильтраты, содержащие нейтрофилы, моноциты и лимфоциты. Выраженность некроти­ческих нарушений во многом зависела от степени развития изменений в гемоди­намике. В тех участках, где они были более выражены, наблюдался и более обширный некроз мышечных волокон. Нарушение со стороны сосудов и микро-циркуляции сопровождались появлением отека, стаза клеток крови, кровоиз­лияний и лейкоцитарной инфильтрации. Все эти нарушения в миокарде соответствуют тем данным, которые наблюдали при аналогичных ситуациях и другие авторы [179—182].

К 3—7-м суткам уже можно более серьезно говорить о площади инфаркта, так как начинают проявляться четкие границы некроза (см. приложение 1). В перииифарктной зоне все еще наблюдаются скопления лейкоцитов, хотя их количество начинает снижаться. Капилляры вокруг поврежденных КМЦ часто остаются тромбированными или разрушаются. Мышечные клетки начинают подвергаться резорбции, очевидно за счет фагоцитоза и выделения лизосоиальных ферментов [183]. В патологический процесс включаются ткани, расположенные в верхней и средней стенках левого желудочка. В миокарД^е появляются недифференцированные мезенхимальные клетки со стромальныя фенотипом. Следует подчеркнуть, что пролиферативная реакция со стороны

126

соединительной ткани возникает именно в тот период, когда вместо гранулоцитов в миокарде начинают преобладать мононуклеарные клетки (моноциты, макрофаги, лимфоциты), что наблюдали и другие авторы [184].

На 10— 14-е сутки наблюдений в перииифарктной зоне обнаруживаются гетерогенные по своему составу КМЦ. Часть из них несет признаки атрофии— внутриклеточного некроза и лизиса органелл. Фибробласты активно продуцируют коллаген. Между зоной инфаркта и мышечной тканью прослеживается достаточно четкая граница.

На 30-е сутки в миокарде подопытных животных наблюдается развитие рубцовой ткани, занимающей 60—70% от площади левого желудочка и сочетающейся с гипертрофией сердца на 230—240% от исходного уровня. Исследование функциональных свойств миокарда показало, что изменения со стороны ЭКГ выявляются только у части животных в первые сутки опыта в виде нарушений ритма, появляются экстрасистолии, изменяются в зубце QRS.

Измерение порога фибрилляции желудочков показало, что он снижается на 30—40% по сравнению с контролем.

АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Наиболее адекватной моделью ОИМ для имплантации стволовых клеток была признана модель Н. Selye в модификации Н. М. Поминовой и С. С. Дюсенова (см. метод 2), так как он наименее травматичен, и выживаемость крыс наибольшая при стабильно и ярко протекающем процессе.

Контролем развития ОИМ у крыс служили следующие показатели: изменения в динамике электрофизиологических показателей сердца, ультразвуковое исследование сердца в динамике ОИМ, патоморфологические изменения в ткани миокарда.

ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

Перед проведением ЭКГ животным давался легкий эфирный наркоз. Исследование проводились в 1-м, 2-м, 3-м AVR, AVL и AVF отведениях.

Исследование показало, что выявляются только у части животных в первые сутки опыта в виде нарушений ритма, появления экстрасистолии, проявлением патологического зубца Q, иногда комплекса QS. Также выявлена элевация сегмента PS — Т. Чаще всего диагностируется переднебоковой распростра­ненный передний инфаркт миокарда.

Спустя две недели не было обнаружено каких-либо отклонений в ЭКГ по сравнению со здоровыми животными.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МИОКАРДА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

Исследование патоморфологических характеристик производится на трех Уровнях: макроскопический анализ — внешнее обследование органов; микроскопическое исследование тканей и электронно-микроскопическое изучение клеток.

127

Макроскопически сердца крыс средних размеров, реже — чуть больщ_е среднего, плотной консистенции (в единичных случаях наблюдался эффект "каменного сердца"). Поверхность сердца неровная, бугристая, темно-бурого цвета. Часто не представлялось возможным выделить орган из сердечной сумки все ткани представляли собой единый конгломерат. На темно-буром фоне выделялись хорошо заметные участки ишемии белесоватого цвета. На разрезе так же обнаруживались четкие очаги патологических процессов миокарда. В суженных просветах имелись довольно плотные кровяные свертки.

II

V

л!

Макроскопически сердце крысы (группа ИМ). На разрезе четко просматривается зона нарушения кровообращения. Стрелочками отмечены зоны ишемии миокарда.

128

Так же отмечено, что при вскрытии грудной клетки и плевральной полости имело место большое количество серозно-геморрагической жидкости.

Гистологическое исследование

Материал для гистологического исследования фиксировали в 10% забу-ференном формалине, для электронно-микроскопического исследования — 2,5%-ном растворе глютаральдегида. Проводка осуществлялась по общепри­нятой гистологической и электронно-микроскопической методикам. Гисто­логические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, полутонкие срезы—метиленовым синим, азуром-2 и основным фуксином (С. Humphray, F. Pittman, 1974). Препараты исследовали на световом микроскопе "Leica" DM 4000 В с цифровой камерой "Leica" DFC 320. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали на электронном микроскопе ЭВМ- 100Л.

Исследования показали, что при моделировании экспериментального инфаркта миокарда в ткани сердца отмечаются мелкие очаги повреждения миокарда, характеризующиеся глыбчатым распадом миофибрилл и миолизом. В мышечных волокнах зоны ишемии при отмечается исчезновение гликогена, резкое снижение окислительно-восстановительных ферментов.

Интерстициальное пространство зоны ишемии содержит серозную жидкость, белковоподобное вещество, фибрин, эритроциты, макрофаги и нейтрофильные лейкоциты. Последние интактны или разрушены и находятся в непосредственной близости к необратимо поврежденным кардиомиоцитам.

Нарушения гемодинамики локализуются в основном в зоне ишемии миокарда и вокруг нее. Сосудистые расстройства развиваются преиму­щественно в зоне ишемии: гиперемия, отек, кровоизлияния, стазы, лейкоцитарная инфильтрация, микротромбы (рис. 1).

В миокарде обнаруживаются множественные очаги пролиферации соединительнотканных элементов вокруг погибших групп мышечных волокон. Пролиферативно-клеточная реакция вокруг участков некроза миокарда начиналась с появлением мононуклеаров, постепенно вытесняющих лейкоциты. Кроме лейкоцитов и гистиоцитов, среди пролиферирующих клеток наблюдались макрофаги, фибробласты, единичные лимфоидные клетки. В мышечных волокнах субэпикардиального слоя левого желудочка выявлено много мелких эозинофильных участков, лишенных ядер. В некоторых эозинофильных сегментах ядра сохранялись. Наряду с эозинофильными встречаются и базифильные мышечные волокна. Ядра в них — с явлениями пикноза, рексиса и лизиса. Гликоген в зоне ишемии отсутствовал.

В отдельных приготовленных гистологических срезах выявлены участки формирования абсцессов непосредственно в ткани сердца животных. Рядом также имели место зоны ишемии миокарда, с выраженными дистрофическими процессами в кардиомиоцитах.

Нарушения гемодинамики локализовались в основном в зоне ишемии Миокарда и вокруг нее. Они более интенсивны по сравнению с ранними сроками и проявлялись в венозной гиперемии, периваскулярном отеке, мелкоочаговых, сливающихся кровоизлияниях, миграции лейкоцитов в интерстициальную ткань. Лейкоцитарная реакция более заметна, чем в ранние сроки.

129

A

Б

Рис. 1. Зона инфаркта: А — отек стромы, лимфощщая инфильтрация. Ув. х 100. Б — дистрофические изменения кардиомиоцитов Ув. х 400.

130

Рис. 2. Паретически расширенные сосуды, заполненные склеенными эритрэоцитами (микротромбы). Прилежащая сердечная ткань отечна, немного разволокненаа. Окраска гематоксилин — эозин. Ув. х 200.

Кровоизлияния встречались чаще во внутренних слоях стенкси левого желудочка сердца. Мышечные структуры в центральной зоне развивающегося инфаркта подвергались деструкции, фрагментации и лизису. При изучении околоинфарктной зоны миокарда отмечено, что в миокарде формируется зона липидной инфильтрации, расположенная за пределами зоны ишемищ (жировая дистрофия кардиомиоцитов вследствие гипоксии).

Зона инфаркта миокарда выявляется при микроскопии. ВЗыявлены эозинофилия, комковатость саркоплазмы, некробиотические измешения ядер в поврежденных кардиомиоцитах, стазы в капиллярах, выход фсорменных элементов крови за пределы капилляров, глыбчатый распад миофийрилл.

В краевой зоне ишемического некроза миокарда выявляется нерегулярное чередование кардиомиоцитов, подвергшихся коагуляционному мекрозу и кардиомиоцитов с разной степенью выраженности дистрофши (рис.2). Коагуляционный некроз кардиомиоцитов проявляется пикно:зом ядер, очаговой деструкцией и контрактурой фрагментов миофибрилл, вшутрикле-точным отложением фибрина. В целом, морфологические изменения кардио­миоцитов в краевой зоне ишемии свидетельствуют о прогрессировшном рас­пространении некроза вследствие гипоксии и очаговой аноксии, обусловленной микротромбозом капилляров по периферии зоны ишемии (рис. 3).

131

Рис. 3. Инфаркт субэндокардиальный, стадия организации. Клеточная инфильтрация представлена круглоклеточными элементами. В прилежащих кардиомиоцитах отмечают­ся изменения соотношения ядерного цитоплазматического индекса в сторону ядра. Окраска гематоксилин — эозин. Ув. х 200.

ВЫВОДЫ

1. При моделировании острого инфаркта методом коронаро-окклюзии можно воспроизвести картину ИМ, наблюдаемого у человека, с развитием характерных для данного заболевания морфофункциональных изменений.

2 На данный момент наиболее удобной и эффективной моделью экспери­ментального инфаркта миокарда для последующего введения СК признана модель крупноочагового инфаркта миокарда по Н. Selye в нашей модификации.

3. Моделирование инфаркта миокарда окклюзией коронарной артерии укладывается в классические сроки, описанные в литературе и совпадает с клиническими данными.