Практическая работа №7
Тема: Проведение качественного ПЦР-анализа формат «Real-time»
Цель занятия: Освоить метод детекции с помощью детектирующего амплификатора в режиме «Реального времен»
Задачи:
Усвоить правило подготовки ДНК образца к детекции в режиме «Реального времен»
Освоить теоретические основы реализации метода детекции с помощью детектирующего амплификатора в режиме «Реального времен»
Усвоить интерфейс компьютерной программы для реализации программы детекции в режиме «Реального времен»
Выучить основные правила безопасного поведения при работе с детектирующим амплификатором в «Реальном времени»
Материалы и оборудование для проведения практического занятия
Ламинар типа «ПЦР-бокс»
Ц
ентрифуга
(вортекс)
Центрифуга Eppendorf Microspin (Рисунок 21)
Дозаторы HTL «VE-series»
Штатив для дозаторов
Штатив рабочее место 200X0,2мл.
Штативы для хранения пробирок 100X1,5мл.
Детектирующий амплификатор ДТ-322 (Real-time) в комплекте с компьютером
Смесь для амплификации, запечатанная парафином
Раствор Taq-полимеразы
Минеральное масло
Положительный контрольный образец (К+)
Ход работы №1
Промаркируйте пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации (с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца - «К-» и положительного контрольного образца - «К+»).
Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы.
Добавьте в каждую пробирку по 1 капле минерального масла.
Перенесите пробирки в зону пробоподготовки.
Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл выделенного из образца препарата ДНК (кроме пробирок «К-», «К+»). В пробирку, маркированную «К-», добавьте 5,0 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподготовку, в пробирку, маркированную «К+», добавьте 5,0 мкл положительного контрольного образца.
Центрифугируйте пробирки при 1000 об/мин в течение 3-5 с.
Установите все пробирки в детектирующий амплификатор и проведите ПЦР в режиме, приведенном в таблице 1 или 2, с учетом объема реакционной смеси 35мкл.
Внимание! При работе с комплектом реагентов для выявления ДНК гарднереллы вагиналис (Gardnerella vaginalis) возможно проведение ПЦР в режиме, общем для всех комплектов. В этом случае необходимо обращать внимание на значение порогового цикла Ct (Ср) по FAM: положительными считают образцы для которых значение Q (Ср) по FAM меньше или равно 35.
Ход работы №2
Цель работы: Усвоить интерфейс компьютерной программы для реализации программы детекции в режиме «Реального времен»
Детекция и учет результатов осуществляется на приборах ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») или iCycler iQ (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями к приборам.
ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации специфического _продукта и внутреннего контрльного образца, мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно.
Примечание: Тест-системы предназначены для детекции результатов ПЦР во время амплификации. В качестве альтернативного способа учета результатов возможно использование метода гель-электрофореза.
Условия хранения
Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует хранить в темном месте при 2-8 °С в течение всего срока годности. Примечание: Допускается хранение пробирок со смесью для амплификации, запечатанной парафином, в темном месте при 18-25 °С в течение всего срока годности.
Таблица 9. Режим амплификации для амплификатора ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК Технология»)
№ блока 1 |
Тип блока |
Температура |
мин |
сек |
Число повторов |
Режим оптических измерений |
|
цикл |
80 °С |
1 |
00 |
1 |
|
|
|
94 °С |
1 |
30 |
|
|
2 |
цикл |
94 °С |
0 |
30 |
5 |
|
|
|
64 °С |
0 |
15 |
|
V |
3 |
цикл |
94 °С |
0 |
10 |
45 (35) |
|
|
|
64 °С |
0 |
15 |
|
V |
4 |
хранение |
10 |
|
|
|
|
Данный режим амплификация предназначен для следующих комплектов реагентов:
Хламидия трахоматис (Chlamydia trachomatis), Микоплазма хоминис (M.hominis) Микоплазма гениталиум (M.genitalium) Уреаплазма уреалитикум (Т-960) и уреаплазма парвум (U.urealyticum+ U.parvum) Уреаплазма парвум (U.parvum) Уреаплазма уреалитикум (T-960)(U.urealyticum) Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginalis) Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis) Нейссерия гонореи (Neisseria gonorrhoeae) Кандида альбиканс (Candida albicans) Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2) Вирус герпеса человека тип 6 (HHV6) Вирус герпеса человека тип 8 (HHV8) Цитомегаловирус (CMV)
Таблица 10. Режим амплификации для амплификатора iCycler iQ 5 (Bio-Rad).
Для данного режима необходимо активировать переключатель "Use persistent well factor"
Cycle |
Repeats |
Step |
Dwell time |
Setpoint |
PCR/Melt Data Acquisition |
1 |
1 |
|
|
|
|
|
|
1 |
1:00 |
80,0 |
|
2 |
1:30 |
94,0 |
|
||
2 |
5 |
|
|
|
|
|
|
1 |
0:30 |
94,0 |
|
2 |
0:45 |
64,0 |
|
||
3 |
45 |
|
|
|
|
|
1 |
0:10 |
94,0 |
|
|
2 |
0:45 |
64,0 |
Real-time |
||
4 |
1 |
|
|
|
|
|
|
1 |
1:00 |
10 |
|
Вирус папилломы тип 16 и 18 (HPV16 и 18) Микобактерия туберкулеза- микобактерия бовис комплекс (М.Tuberculosis - М. Bovis) Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) Коринебактерия дифтерия (Corynebacterium diphtheriae) - токсигенные штаммы Стрептококк группы A (Streptococcus pyogenes) Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii) Вирус Эпштейна-Барр (EBV) Легионелла пневмофила (Legionella pneumophila) Вирус варицелла зостер (VZV)
ДЕТЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.
Метод горизонтального электрофореза
Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (Рисунок 22). Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, - например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм).
Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.