Практическая работа №9

Тема: Генотипирование вируса гепатита С

Цель: Овладение навыками качественного определения вируса гепатита С (HCV) и его генотипирования в образцах плазмы крови

Задачи:

1. Подготовить стерильную одноразовую посуду к выделению РНК

2. Освоить методику выделения РНК из образцов крови

3. Принять к сведению информацию и применить её для правильной утилизации материала использованного для работы с гепатитами

4. Подготовить материал РНК к реакции обратной ранскрипции

Ход работы:

Материалы и оборудование:

Набор реактивов для выделения РНК гепатита наиболее распространенных в Республике Казахстан генотипов HCV (la, lb, 2а, 2Ь и 3).

1. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»

2. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

3. Твердотельный теромостат Гном (Рисунок 12)

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

5. Лизирующий раствор

6. Реагент для преципитации

7. Промывочный раствор №1

8. Промывочный раствор №2

9. Буфер для растворения

10. Отрицательный контрольный образец

11. Внутренний контрольный образец

1. Промаркируйте необходимое количество новых пробирок ёмкостью 1,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца (К-)

2. Внесите по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВК) в каждую пробирку (если предусмотрено его внесение)

3. Добавьте в каждую пробирку 300 мкл лизирующего раствора, не касаясь края. Лизирующий раствор перед внесением в пробирки необходимо прогреть до 65⁰С

4. Добавьте в пробирки по 100 мкл исследуемого образца (кроме К-). В пробирки маркированные К-, добавьте 100 мкл отрицательного контрольного образца.

5. Плотно закройте крышки пробирок, перемешайте на вортексе в течение 3-5 сек

6. Термостатируйте пробу 15 мин при 65⁰С, осадите конденсат центрифугированием при 13000об\мин в течение 30 с.

7. Добавьте 400 мкл реагента для преципитации и перемешайте пробу на вортексе в течение 3-5 с.

8. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 15 мин

9. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником для каждой пробы)

10. Добавьте к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и 3-5 раз аккуратно переверните пробирку

11. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 5 мин

12. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником для каждой пробы)

13. Добавьте к осадку 300 мкл промывочного раствора №2 и 3-5 раз аккуратно переверните пробирку

14. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 5 мин

15. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (отдельным наконечником для каждой пробы)

16. Добавьте к осодку 50 мкл буфера для растворения.

17. Прогрейте пробу при Т 65⁰С в течение 10 мин.

18. Осадите капли центрифугированием пробирок при 13000 об/мин в течение 30 с. Препарат РНК готов. РНК рекомендуется сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции.