Например, широко используемый для работы с клетками крови фосфатный буфер (рН 5,8-8,2) приготавливается следующим образом:

Р-р А: Динатриевый фосфат 1/15 М: растворить 11,876 г Na₂НРО₄ х 2Н₂О или 23,882 г Na₂НРО₄ х 12Н₂О в 1000 мл воды.

Р-р В: КН₂РО₄ 1/15 М: растворить 9,078 г КН₂РО₄ в 1000 мл воды.

Для получения буфера с определенной рН необходимо смешать растворы А и В в нижеуказанных соотношениях:

рН	Р-р А в мл		Р-р В в мл	рН	Р-р А в мл		Р-р В в мл
5,8		8,0	92,0	7,2		72,0	28,0
5,9		9,9	90,1	7,25		74,4	25,6
6,0		12,2	87,8	7,3		76,8	23,2
6,1		15,3	84,7	7,35		78,9	21,1
6,2		18,6	81,4	7,4		80,8	19,2

Продолжение таблицы

рН	Р-р А в мл		Р-р В в мл	рН	Р-р А в мл		Р-р В в мл
6,3		22,4	77,6	7,45		82,5	17,5
6,4		26,7	73,3	7,5		84,1	15,9
6,5		31,8	68,2	7,55		85,7	14,3
6,6		37,5	62,5	7,6		87,0	13,0
6,7		43,5	56,5	7,65		88,2	11,8
6,8		49,6	50,4	7,7		89,4	10,6
6,85		52,5	47,5	7,75		90,5	9,5
6,9		55,4	44,6	7,8		91,5	8,5
6,95		58,2	41,8	7,5		93,2	6,8
7,0		61,1	38,9	8,0		94,7	5,3
7,05		63,9	36,1	8,1		95,8	4,2
7,1		66,6	33,4	8,2		97,0	3,0
7,15		69,2	30,8

При разведении (до соотношения 1:100) рН буферного раствора практически не меняется, однако отражается на его емкости. Буферная емкость – число молей сильной кислоты или сильного основания, добавление которого к буферному раствору изменяет его рН на единицу. Фактически это характеристика способности раствора противостоять прибавлению кислоты или щелочи. Буферная емкость тем больше, чем концентрированнее раствор.

Для приготовления буферных растворов необходимо использовать перекристаллизованные реактивы квалификации “хч” и бидистиллированную воду; значение рН – контролировать потенциометрически (см. ниже).

Перекристаллизация (восстановление кристаллической структуры реагента) достигается путем прокаливания. Необходимость кристаллизации диктуется тем, что при неправильном хранении реактивов (кристаллогидратов) может происходить частичная потеря кристаллизационной воды (выветривание), из-за чего вещество переходит в аморфное состояние. Такой реактив без предварительного прокаливания не пригоден к приготовлению растворов, так как исходно закладывается ошибка при подсчете молекулярной массы кристаллогидрата.

С увеличением температуры константа диссоциации воды возрастает, соответственно увеличивается и концентрация водородных ионов, а рН уменьшается. Поэтому когда указывается точная концентрация водородных ионов в растворе или оптимальный рН какой-либо химической реакции, должна быть указана и температура, к которой эта величина относится, иначе сведения носят лишь приблизительный характер.

Буферные растворы используются в тех случаях, когда анализ проводится при определенном значении рН, в частности при определении активности ферментов.

Приготовление растворов из фиксаналов

Фиксанал представляет собой ампулу, содержащую навеску (либо концентрат) вещества, из которого необходимо приготовить раствор заданной концентрации (молярный, нормальный или процентный). Каждая ампула фиксанала рассчитана на приготовление раствора в определенном объеме растворителя (количество растворителя указывается на этикетке фиксанала). Приготовление растворов производится в соответствии с инструкцией к фиксаналу, выполнение которой обеспечивает полное перенесение вещества в раствор.

Целый ряд веществ, переходя из недиссоциированного состояния в ионизированное, меняет цвет, поэтому окраска раствора зависит от рН. Эти вещества называются кислотно-щелочными индикаторами. Они принадлежат к различным типам органических соединений, но все являются слабыми кислотами или слабыми основаниями. Их недиссоциированные молекулы окрашены иначе, чем диссоциированные. Индикаторы могут использоваться как добавки к растворам реактивов для контроля за изменением рН. Например, в растворе Хенкса (среда, используемая для работы с клетками) в качестве индикатора добавлен феноловый красный. В диапазоне нейтральной рН раствор имеет оранжево-красный цвет, при закислении среды – меняется на желтый, а при защелачивании – на малиновый.

При хранении растворов надо иметь в виду, что основными причинами, которые могут привести к случайному изменению рН, являются попадание угольной кислоты из воздуха и выщелачивание стекла. Углекислота воздуха сказывается главным образом на растворах, рН которых выше 7, поскольку более кислые растворы угольную кислоту не поглощают. Уберечься от ее влияния проще всего, закрывая флаконы с реактивами пробками. Выщелачивание посуды зависит в первую очередь от сорта стекла, а также от длительности хранения реактива. Оценить его влияние в условиях клинической лаборатории непросто, поэтому надо проявлять определенную осторожность. Пластмассовые флаконы, пробирки и кюветы, как правило, делаются из материала, который не выщелачивается.

В лабораториях растворы реактивов обычно приготавливают на несколько дней (до нескольких недель). Стабильность растворов зависит от их концентрации. При необходимости длительного хранения лучше готовить концентраты растворов (например, 10х кратные), так как они более стабильны. Растворы, необходимые непосредственно для работы (рабочие растворы), готовят накануне путем разбавления матричных растворов и используют в течение одного или нескольких дней.