4.3.2. Электрофорез
Электрофорез – процесс разделения заряженных частиц под действием внешнего электрического поля. В результате проведения электрофореза можно осуществлять идентификацию и определение количества различных макромолекул, микрочастиц, клеток по их подвижности в направлении силовых линий электрического поля.
Электрофорез применяют для исследования веществ, молекулы которых в соответствующих условиях заряжены и различаются по электрофоретической подвижности. Конкретные условия для разделения подбирают путем изменения характеристик внешней среды (рН среды, температуры, состава и концентрации буферного раствора или носителя). На примере разделения белков принцип метода можно представить следующим образом. Белки являются амфотерными веществами, которые в кислой среде присоединяют протон и ведут себя как катионы, а в щелочной среде – отдают протон и приобретают свойство анионов. В изоэлектрической точке они становятся ионами с нулевым суммарным зарядом, то есть нейтральными молекулами, в которых противоположные заряды пространственно разделены. Суммарный заряд молекул зависит от рН буфера, в котором растворен белок. Изменяя этот параметр, можно менять направление и скорость миграции белков в электрическом поле, то есть разделять белки в анализируемой биопробе. Эффективность разделения зависит не только от суммарного заряда молекул, но и от их размеров. При этом крупные молекулы с высоким суммарным зарядом могут мигрировать на то же расстояние, что и небольшие молекулы с низким суммарным зарядом. Определяющим параметром при этом является соотношение заряд/масса, которое и определяет электрофоретическую подвижность молекул исследуемого компонента.
Электрофорез можно осуществлять в растворе или использовать специальные носители из пористого материала, не проводящие ток. Среда-носитель служит для поддержания стабильности различий в плотности раствора разделяемого вещества и буфера, а также электрофоретических зон, которые легко разрушаются от нагрева, возникающего при прохождении электрического тока через буферный раствор. Однако следует иметь в виду, носитель может оказывать влияние на условия электрофореза и тем самым изменять эффективность разделения (за счет размера пор, адсорбции, собственных химических свойств и т.д.).
По эффективности разделения можно выделить две группы материалов-носителей:
1. Ацетацеллюлоза, агар, агароза. Это относительно инертные материалы с порами больших размеров, которые слабо влияют на эффективность разделения.
2. Крахмальные и акриламидные гели. Эти носители содержат поры, сравнимые по размерам с размерами белковых молекул. Поэтому на них возможно разделение веществ с одинаковыми суммарными зарядами, но различными молекулярными массами. Электрофореграммы, полученные на таких носителях, содержат больше фракций, чем на ацетатцеллюлозе, агаре и агарозе. Так, электрофорез на полиакриламидном геле позволяет выделить 20 и более фракций белков из сыворотки.
Из перечисленных выше носителей наибольшее распространение в клинико-диагностических лабораториях получил ацетат целлюлозы. Электрофорез на ацетатцеллюлозе имеет ряд преимуществ – малое количество образца (0,3 – 2 мкл сыворотки), время разделения 20-60 минут. Количество получаемых фракций меньше, чем при использовании носителей второго типа (при электрофорезе сыворотки – 5 фракций, включая преальбумин), однако именно они являются наиболее клинически информативными.
Электрофорез осуществляется с помощью специальных приборов для электрофореза. Процедура состоит в том, что носитель помещается в электрофоретическую камеру, содержащую буферный раствор. Буферный раствор выполняет двоякую роль: проводит электрический ток и поддерживает определенную рН, определяя электрический заряд растворенного вещества. Избыток буферного раствора удаляют. Исследуемый биоматериал (например, сыворотка крови) наносится на носитель, устанавливается требуемая сила тока. По окончании электрофореза смесь макромолекул оказывается разделенной на дискретные зоны, каждая из которых состоит из частиц с близкими значениями электрофоретической подвижности. Носитель вынимают из камеры, высушивают (или закрепляют для предупреждения диффузии компонентов пробы), а затем окрашивают специфичным для данного класса веществ красителем. Для окрашивания электрофореграмм белков используют амидочерный, бромфеноловый голубой и другие красители. Окрашивание позволяет визуализировать отдельные зоны на электрофореграмме. По положению зон относительно места старта осуществляется идентификация отдельных фракций разделенного вещества (рисунок 4.13).
Рисунок 4.13 – Электрофореграмма белков сыворотки крови на ацетатцеллюлозной пленке
На нижнем рисунке – результат количественного определения основных белковых фракций крови методом денситометрии (денситограмма).
Количественная оценка содержания разделенных компонентов осуществляется по интенсивности окрашивания разделенных зон с помощью специального фотометрического прибора – денситометра, работающего в отраженном от препарата потоке излучения оптического диапазона. Результаты выражаются в графической форме (в виде пиков) и в цифровой форме (рис)
В клинической практике электрофорез широко применяется в исследовании белков и их компонентов, липопротеинов и нуклеиновых кислот.
Одним из наиболее современных и перспективных методов электрофореза является изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). Метод используется преимущественно для исследования белков. Сущность ИЭФ заключается в том, что молекулы белков мигрируют под действием электрического поля в среде с линейным и стабильным градиентом рН до достижения области, соответствующей их изоэлектрической точке (значение рН, при котором белок теряет заряд, а, следовательно, и подвижность в электрическом поле). Если в стабилизирующей среде создать градиент рН, то заряженные молекулы белка, двигаясь по электрическому полю, попадают в область носителя с рН, равным их изоэлектрической точке, и теряют подвижность: каждый белок фокусируется на среде со своей изоэлектрической точкой. Таким образом, ИЭФ использует зависимость знака и величины заряда молекулы белка от рН окружающего раствора. Метод обладает очень высокой разрешающей способностью: удается надежно разделить два белка, отличающиеся по ИЭТ всего на 0,02 ед. рН.