VIII. Антигенные свойства нейраминидазы

Нейраминидаза считается важным в антигенном отношении компонентом вириона. Уникальность NA* вируса гриппа заключается в том, что она, будучи ферментом, играет, кроме того, роль антигена при заболевании гриппом. Антитела к NA* могут создавать защиту против гриппа и изменять течение болезни (см. гл. 12). Используя рекомбинантные штаммы, содержащие распространенную в настоящее время NA*, и серологически измененные гемагглютинины, Schulman и соавт. (1968) показали, что антитела к NA* ингибируют вирусную репликацию в клетках легкого мыши, уменьшают титр вируса и степень поражения легких.

Как и НА*, NA* подвержена антигенным сдвигам и дрейфу. Нейраминидазная компонента вириона меняется в процессе антигенной изменчивости (Paniker, 1968; Schulman, Kilbour-ne, 1969). Хотя новый тип вируса гриппа — тип А2 — возник в 1947 г. и при этом наблюдались очень существенные изменения НА* нейраминидазная .компонента нового типа давала положительный ответ в «росс-реакциях с NA* вируса гриппа

АО и поэтому N А* из обоих типов вируса были обозначены одним символом — N1 (Paniker, 1968; World Health Organization, 1972). В 1957—1958 гг. возник новый тип вируса А2. При этом образовался как новый НА* (N2), так и новая NA* (N2). Как показал Rafelson и соавт. (1963а, Ь), в этом случае кросс-реакции между антисыворотками к азиатским штаммам (N2) и антисыворотками к PR8 (N1) или к вирусу гриппа В отсутствовали. Штамм, возникший в 1968 г., обладал новым типом НА* (НЗ), а его NA* — высокий кросс-реактивностью со штаммами вируса триппа А2 и в связи с этим для ее обозначения был вновь использован символ N2 (World Health Organization, 1972). Однако небольшое изменение, так называемый антигенный дрейф, все же наблюдалось в 10-летние периоды, отделяющие 'кардинальные антигенные сдвиги (Schulman, Kilbourne, 1969).

Взаимодействие «ейраминидазы с антителами может быть изучено с помощью нескольких методов. К ним относятся такие методики, как ингибирование ферментативной активности (Fazekas de St. Groth, 1962, 1963; Aymard-Hanry et al., 1973), иммунопреципитация (Easterday et al., 1969; Schild, Pereira, 1969; Palese et al., 1973), определение уменьшения размера бляшек (Jahiel, Kilbourne, 1966) и тесты титрования на мышах (Schulman et al., 1968). Полосу иммунопреципита-ции можно наблюдать после проведения иммунодиффузии при использовании низ'комолекулярного хромофорного субстрата МФН (Palese et al., 1973).

Наиболее широко распространенной методикой определения наличия антинейраминидазных антител является реакция торможения нейраминидазной активности с использованием высокомолекулярных субстратов — гликопротеидов, содержащих нейраминовую кислоту. Уровень ингибирования антителом не зависит от (концентрации субстрата (Fazekas de St. Groth, 1963; Rafelson et al., 1963a). Реакция подавления нейраминидазной активности была стандартизована, причем в этом случае в качестве субстрата использовали фетуин, а за степень подавления активности -принимали величину разведения исходного раствора антител, при котором наблюдается 50% подавление нейраминидазной активности (Aymard-Hen-ту et al., 1973). Если откладывать на графике процент ингибирования в зависимости от логарифма разведения антисыворотки, должна получиться прямая линия. Обычные условия проведения этого теста: 1,2% концентрация фетуина в 0,1 М фосфатном буфере, рН 5,9 тз присутствии 1,5 ,мМ СаСЬ в объеме 0,2 мл. Чувствительность реакции возросла за счет увели-.. чения времени инкубации нейраминидазы с антисывороткой и субстратом (17 ч при 37°С).

Было обнаружено, что степень ингибирования нейраминидазной активности за счет взаимодействия с антителами за-

висит от размеров молекулы субстрата (Fazekas de St. Groth,. 1963; Rafelson et al., 1963). Такая же зависимость наблюдалась и для нейраминидазы Vibrio cholerae (Mohr, Schramm, 1960). Было показано, что нейраминидазная активность вируса гриппа ингибируется специфическими антителами, если: в качестве субстрата использовать высокомолекулярный субстрат (орозомукоид, фетуин или лликопротеид, выделенный, из мочи), и ингибируется слабо или вообще не ингибируется при использовании низкомолекулярных субстратов, таких,, как сиалиллактоза. Это указывает «а то, что ингибирование активности нейраминидазы—стерический процесс, т. е. антитело взаимодействует не с активным центром фермента, а с соседним участком (или участками), и степень ингибирова-ния возрастает с ростам относительной молекулярной массы используемого в реакции субстрата (Fazekas de St. Grothr 1962).

Сравнивая штаммы вируса гриппа А и В, Fazekas de St.. Groth (1963) обнаружил, что в вирионах штамма АО (Mel) нейраминидаза расположена таким образом, что легкодоступна для нейтрализации антителами, и -максимальная: степень ингибирования при использовании одного и того же субстрата выше для штамма А0(Ме1), чем для штамма B/Lee. Для штамма вируса гриппа А2 наблюдалось стериче-ское ингибирование антителами при использовании высокомолекулярных субстратов и слабое — при использовании в качестве субстрата сиалиллактозы. В отличие от этого для штамма вируса гриппа В ингибирование отсутствовало при использовании сиалиллактозы, 80% ингибировались при использовании высокомолекулярных субстратов (таких, как фетуин, орозомукоид и мукоид мочи, обработанный трипсином) и 100% при использовании очень больших субстратов (эритроциты, мукоид мочи и овомуцин). Это может свидетельствовать о том, что в штаммах вируса гриппа В расстояние между антигенным и активным центром больше, чем в штаммах гриппа А.

При расщеплении антител с помощью папаина стериче-ское ингибирование резко уменьшается, хотя константа связывания антител в обоих случаях одинакова. Кроме того, ингибирование нейраминидазной активности носит неконкурентный характер и зависит от: 1) расстояния между антигенной детерминантой и активным центром фермента; 2) размера и формы молекулы субстрата; 3) размера молекулы антитела. Оценка величины расстояния между антигенным и активным участками нейрамияидазы дала величину 2 им (Fazekas de St. Groth, 1962). Эти эксперименты -были проведены с антисывороткой к цельной вирусной частице, содержащей антитела как к гемагглютинину, так и к нейраминидазе. Для подтверждения приведенных выше выводов необходимо провести.

аналогичные эксперименты с использованием моноспецифической сыворотки к нейраминидазе.

То, что активный центр фермента не принимает участия в выработке антител, характерно не только для нейраминидазы. По-видимому, это свойство присуще некоторым другим ферментам и является показателем отсутствия мутабельности активного центра у биологических видов (Cinader, 1967). Одним из объяснений этого феномена может быть то, что, если бы организм распознавал активный центр вирусной NA* так же, как активный центр своей собственной NA*, он не смог бы выработать антитела к вирусному ферменту.

Антитела к НА* в различной степени ингибируют активность NA* некоторых штаммов вируса гриппа (Paniker, 1968; Webster, Pereira, 1968). Ингибирование активности NA*, вызванное антителами к НА*, несмело места, если NA* (Х7) изолировали из вириона с помощью твина-20 (Webster, 1970a), SDS 'или лроназы (Easterday et al., 1969). И, наоборот, антитела к NA* могут подавлять гематтлютинацию некоторых штаммов вируса гриппа (Kilbourne, 1968; Schulman, Kilbourne, 1969). Однако в большинстве случаев антитела к NA* не ингибируют реакцию гемагглютинации, но эффективно -подавляют элюцию вируса (Brown, Laver, 1968). Реакция ингиби-роваяия .гемагплютинации была использована для выявления антител к NA* рекомбинантов Х15 « Х15 (НК) (Kendal et al., 1972). Чувствительность этого теста была повышена при использовании IgG-антител человека (Kendal et al., 1972) (см. также гл. 11).