1.2.5. Эпоксидгидролаза

Эти ферменты катализируют трансформацию многих реактивных и специфических

эпоксидов в дигидродиолы, которые для многих соединений являются неактивными. Но в

некоторых случаях, например, для ПАУ, образуются особо опасные эпоксид-дигидродиолы.

Гидролазная реакция (рис. 9) трансформирует эпоксид в диол. Фермент катализирует

нуклеофильную атаку водой или ОН- с противоположной стороны эпоксидного кольца.

Рис. 9. Реакция, катализируемая микросомальной эпоксидгидролазой

Образующиеся диолы имеют транс-конфигурацию. Фермента много в почках и печени.

Извесно 5 форм эпоксидгидролазы: холестериновая, лейкотриеновая, гепоксилиновая,

микросомальная и растворимая. Две последние участвуют в метаболизме ксенобиотиков.

Микросомальная эпоксидгидролаза гидрирует монозамещенные, 1,1-дизамещенные и цис-1,2-

дизамещенные эпоксиды и эпоксиды на циклических системах. Она инактивирует эпоксиды

после ферментов 1-й фазы. Водорастворимая эпоксидгидролаза гидрирует широкий спектр

эпоксидов, но не циклические системы.

Глава 2. Распределение, накопление и элиминация токсинов

Все чужеродные соединения, попадая в организм человека или животных,

распределяются в различных тканях, накапливаются, подвергаются метаболизму и

выводятся. Все эти процеccы требуют отдельного рассмотрения.

2.1. Органо- и тканеспецифичность в распределении токсинов

Компартменты. Тело человека состоит в основном из воды, которая

распределяется среди нескольких компартментов. Объем крови у взрослого человека

составляет около 3-х литров. Объем внеклеточной жидкости, омывающей внутренние органы,

достигает 15 литров. Включая количество воды внутри клеток, общий объем жидкости

составляет приблизительно 42 литра. Лекарства и токсичные соединения по-разному

распределяются среди этих компартментов, знания о которых могут быть важны для

понимания последствий экспозиции. Предположим, что в кровь поступает 1г. соединения.

Если оно остается в крови полностью (например, как антикоагулянт гепарин), то его

концентрация будет составлять приблизительно 333 мг/литр. Напротив, если вещества

распространяются во внеклеточной жидкости (например, альбумин или ионы хлора), то их

концентрация в крови может быть всего 67 мг/литр. Если же вещество распределяется между

вне- и внутриклеточной жидкостью (как этанол), то его концентрация в крови будет

составлять около 24 мг/литр.

Заметим, что объем распределения (Vd) находится в обратной зависимости от

концентрации крови. Чем более свободно внутривенная доза соединения распространяется по

телу, тем ниже его остаточная концентрация в крови. Параметр Vd может быть рассчитан

как отношение вводимой дозы к концентрации в крови. Vd зависит от химических свойств

соединения, является константой для данного вида и может быть определен спериментально.

Подсчет Vd может быть полезен для определения нагрузки на организм, особенно для

соединений, которые выводятся медленно. Эта информация может быть необходимой при

проведении антидот терапии.

Для некоторых соединений подсчитанные величины Vd являются очень большими,

много больше, чем суммарный объем жидкости организма (т.е. 1000 литров). Такие величины

кажутся противоестественными. Обычно такие соединения локализуются не в крови, а в

других компартментах организма. Например, йод концентрируется в щитовидной железе.

ТХДД - в жире, стронций – в костях. В жировой ткани обычно откладываются гидрофобные

соединения, что препятствует их биотрансформации до более водорастворимых производных.

Связывание с белками. Некоторые соединения в крови могут изолироваться

путем связывания с белками. Альбумин, высокая концентрация которого обнаруживается в

крови, имеет сайты связывания для гидрофобных соединений и способствует повышению

растворимости соединений, которые иначе откладываются на стенках кровеносных сосудов

или в тканях. Такое связывание может быть основным путем усиления экскреции. Хорошим

примером является транспорт производных билирубина из поврежденных эритроцитов в

печень. Трансферрин связывает железо, регулирует его доставку в клетки и предотвращает

взаимодействие с восстанавливающими соединениями и кислородом, который генерирует

токсичные высоко реакционноспособные производные. Стероидные гормоны связываются с

определенными глобулинами, а витамин А и тиреоидные гормоны – с белком трансферитин.

Будучи частью макромолекулярного комплекса, витамины и гормоны не фильтруются в почках,

таким образом, предотвращается их потеря в результате фильтрации. В идеале скорость

фильтрации соединения в почках, а, следовательно, время полувыведения, должно быть

обратно пропорционально количеству соединения, связанного с белком в любой момент

времени. Предположим, что соединение полностью не связано с белком и его время

полувыведения составляет 3 часа. Если соединение свободно на 10% и на 90% связано в

комплексе, слишком большом, чтобы фильтроваться, его ожидаемое время полувыведения

увеличивается до 30 часов. В качестве примера можно привести 2,4-D

(дихлорфеноксиуксусную кислоту). У камбалы это соединение является свободным на 30%, а

время полувыведения составляет 5 часов, тогда как у крыс и собак свободно 10% и 3%, а

соответствующее время полувыведения увеличивается до 14 и 87 часов. Белковое связывание

в крови также ограничивает принятие органических ионов (типа 2,4-D) специальными

транспортными системами в клетках проксимальных канальцев почек и их экспорт внутрь

нефронов. Это может снизить скорость элиминирования даже больше, чем снижение скорости

фильтрации.

Изоляция соединений при помощи белков крови может ограничить их действие на

клетки, поскольку свободная концентрация может быть значительно ниже, чем общая. Клетки

часто разрабатывают специальные компенсаторные пути для поглощения некоторых

питательных веществ. У индивидов, получавших большую дозу соединения, которое замещает

связанное вещество, наблюдались токсические реакции. Например, когда антибиотики только

начинали использовать, обнаружилось, что сульфониламиды замещают билирубин из альбумина

плазмы. Когда большие дозы сульфониламидов назначали младенцам, наблюдалось ухудшение

развития гематоэнцефалического барьера, а высвобождающийся билирубин вызывал

повреждения мозга. Тетрациклин, не замещающий билирубин, может быть использован как

альтернативный препарат.

Разграничение слабых кислот/оснований. Многие лекарства и токсичные

соединения являются слабыми кислотами или основаниями, что может сильно влиять на их

распределение среди клеточных мембран. Следующее обсуждение предлагает упрощенный

подход, без учета реакций биотрансформации и транспортных механизмов. Обычно

обладающие зарядом ксенобиотики не диффундируют сквозь мембраны, в отличие от

незаряженных. Поскольку рН сильно влияет на степень ионизации слабых кислот и

оснований, этот фактор является критическим при определении, каким образом будут

распределяться такие соединения. Предположим, была поглощена бензойная кислота (рКа≈5).

В желудке (рН ≈2) она почти полностью будет находиться в незаряженной (кислотной)

форме, способной пройти сквозь мембраны клеток желудка и достичь кровяного русла.

Напротив, слабое основание анилин (рКа≈5) в желудке находится в заряженной форме, и не

может пройти через мембраны. По аналогии, если есть подозрение, что человека отравили

стрихнином, то медикам-экспертам следует в первую очередь проверить содержимое желудка.

Cтепень ионизации при данном рН можно подсчитать, используя отношение Хендерсона-

Хассельбелча (Henderson-Hasselbalch). Если слабая кислота (А) теряет протон, давая

основание (В), то соотношение между этими формами и рН может быть выражено как рН - рКа

= log[B]/[A]. Это соотношение можно использовать при подсчете относительной

концентрации соединения в компартменте при разных рН. На примере анилина в желудке

можно вычислить, что отношение незаряженной (основной) формы к заряженной (кислотной)

составляет приблизительно 1/1000. В крови (рН ≈7), напротив, это соотношение 1/0,01.

Количество незаряженной формы принято за 1 для удобства, поскольку она находится в

равновесии между мембранами кровяного русла и желудка. Для подсчета относительной

концентрации в крови и желудке в состоянии равновесия можно сравнить суммы форм в

каждом компартменте в относительных единицах: в желудке = 1 + 1000 = 1001; в крови = 1

+ 0.01 = 1.01. Таким образом, концентрация вещества в желудке ≈ в 1000 раз больше, чем

в крови. Это очень грубое приближение, но оно дает представление, что вещество

накапливается в том компартменте, где оно наиболее заряжено.

Органы экскреции

Кишечник (тонкая и ободочная кишка). Нижние отделы желудочно-кишечного

тракта могут оказывать значительное влияние на биотрансформацию и судьбу ксенобиотика в

организме. Критическим фактором здесь оказывается состояние кишечной микрофлоры.

Популяция бактерий незначительна в желудке и проксимальных отделах кишечника и

достаточно велика в дистальных отделах. Исследования позволили идентифицировать

несколько сотен видов бактерий, но вероятно это только меньшая часть. Большинство из

них являются облигатными анаэробами, особенно те, которые обитают в ободочной кишке.

Полагают, что токсический ответ обусловлен генетическим полиморфизмом микрофлоры.

Межиндивидуальные различия в состоянии микрофлоры предположительно обусловлены

различиями в диете и окружении. Члены одной семьи обычно имеют сходный состав

микрофлоры.

Микрофлора нижних отделов желудочно-кишечного тракта участвует в реакциях

биотрансформации, обратных к тем, которые протекают в печени и других аэробных

участках. Важным примером является деконъюгация, удаление сульфата и глюкуроновой

кислоты и деградация глутатиона. Результатом этих реакций является внепеченочная

циркуляция отдельных соединений, например билирубина. После того как глюкуроновая

кислота (присоединенная в печени) отделяется в кишечнике, она всасывается в кровь и

вновь захватывается печенью и экскретируется с желчью, которая вбрасывается в кишечник.

Другим примером является активация ксенобиотиков деконъюгацией. Циказин, соединение

растительного происхождения, конъюгат с глюкозой, в некоторых странах присутствует в

рационе питания. При удалении глюкозы остается производное диметилгидразина,

нестабильное соединение, генерирующее метильные радикалы. Диметилгидразин, который

вызывает рак ободочной кишки у крыс, часто метаболизируется аэробно с образованием

сходных продуктов.

CH3-N=N-CH2-O-глюкоза → СH3-N=N-CH2OH → [CH3-N=N]+

↓ ↓

O O

Другим примером обратной реакции в микроокружении нижних отделов кишечника

является реакция восстановления, например превращение диазо- соединений в амины,

которое нашло практическое применение. В 1938 г. за разработку пронтозила,

предшественника сульфониламидного антибиотика, была присуждена Нобелевская премия. При

оральном приеме пронтозил восстанавливается в кишечнике до триаминобензена, что ведет к

выработке сульфаниламидной активности.

Другой пример – инкапсулированный инсулин (обычно инсулин инактивируется при

оральном приеме). Было предложено создать полимерную форму типа R-C6H4-N=N-C6H4-R. При

оральном приеме таких таблеток, инсулин будет высвобождаться в кишечнике, где он может

взаимодействовать со слизью кишечника и поступать в кровяное русло. К отрицательным

примерам относятся ароматические амины, которые используются как пищевые красители.

Показано, что их прием с пищей вызывал рак мочевого пузыря у животных. Исследования

показали, что сама микрофлора может являться источником ксенобиотиков, вызывающих рак

ободочной кишки. В работах исследовался класс соединений, называемых фекалинами.

Это соединение обладало сильным мутагенным и канцерогенным эффектом в

бактериальных тестах. Такие наблюдения приводят к предположению о возможности

эндогенного происхождения некоторых форм рака ободочной кишки.

Мочевой пузырь. Основной причиной рака мочевого пузыря при определенных

видах деятельности (например, производство красителей) являются ароматические амины.

То, что существует корреляция между степенью экспозиции ароматическими аминами и раком

мочевого пузыря, было замечено еще в 1895 г. В 1938 г. для исследования этого явления

начали использовать собак. В 1953 г. эпидемиологические исследования показали, что

среди 4622 рабочих, занятых на производстве красителей, зарегистрировано более 300

случаев рака.мочевого пузыря, умерло от этой болезни 127 человек.

Метаболизм ароматических аминов, приводящий к раку мочевого пузыря, достаточно

хорошо описан. Вначале амины N-гидроксилируются, рослее чего конъюгируют с глюкуроновой

кислотой в печени, а затем в результате циркуляции накапливаются в моче. Моча человека

имеет рН=5, а в этих условиях глюкурониды нестабильны и гидролизуются (конъюгаты могут

также распадаться благодаря активности фермента глюкуронидазы в моче). Образовавшиеся N-

гидроксиламины могут захватываться эпителиальными клетками мочевого пузыря и О-

ацетилироваться или сульфатироваться, причем оба конъюгата нестабильны и распадаются с

образованием высоко реакционноспособного арилнитрониум иона, способного атаковать

макромолекулы клетки.

В 1970-х годах предметом постоянных обсуждений служил сахарин натрия. Этот

искусственный подсластитель вызывал рак мочевого пузыря у самцов крыс, но не у мышей,

хомячков или обезьян. Соединение не метаболизировалось, не взаимодействовало с ДНК, не

являлось мутагеном, однако в больших дозах избыточную пролиферацию (умеренную

гиперплазию) эпителия мочевого пузыря, что, очевидно, является стимулом для

образования опухоли. На основе этих данных сахарин был запрещен к употреблению, однако

под действием общественного протеста Конгресс отклонил запрет. Последующие исследования

не подтвердили, что избыток потребления сахарина вызывает рак. Недавно обнаружено, что

большие дозы сахарина приводят к формированию кристаллов силиката вокруг α2-

микроглобулина в мочевом пузыре самцов крыс. Кристаллы не формируются у тех видов

животных, у которых уровень этого белка невысок. Кристаллы действуют как абразив,

повреждая клетки эпителия, способствуя усилению пролиферации.